從LondonCalling看Nanopore在RNA相關(guān)技術(shù)的新進(jìn)展2025年5月20日至23日，牛津納米孔科技公司（OxfordNanoporeTechnologies，以下簡稱ONT）舉辦了備受矚目的LondonCalling發(fā)布會。在這場盛會中，ONT帶來了眾多技術(shù)更新，其中RNA測序、表觀和蛋白組相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)展尤為引人注目。接下來，讓我們一起深入探索這些技術(shù)亮點，看看Nanopore技術(shù)如何在生物學(xué)研究的多個層面帶來新的突破，為科研人員提供更強(qiáng)大的助力。一、cDNA更新：突破讀長限制，提升數(shù)據(jù)質(zhì)量將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行Nanopore測序，能夠獲得RNA的全長序列。一直以來，如何獲取更多更長的全長轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)是技術(shù)人員關(guān)注的焦點。經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶是影響讀長的關(guān)鍵因素。在此次更新中，ONT替換了一種來自第三方的新DNA聚合酶（如圖1A所示），這一改變極大地提升了讀長。具體來看，N50從1.4kb提升到了2.7kb（見圖1B），在相同時間內(nèi)能夠測得更多的數(shù)據(jù)量（如圖1C所示）。除此之外，新聚合酶還顯著提高了轉(zhuǎn)錄本5’端的覆蓋度（如圖1D所示），使得檢測到的編碼轉(zhuǎn)錄本數(shù)量也有所增加（見圖1E）。這一更新無疑為研究人員獲取更完整、更準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄本信息提供了有力支持，有助于更深入地理解基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)潛在的生物學(xué)意義。圖1直接RNA測序更新：提高運(yùn)行效率，降低成本在納米孔直接RNA測序（directRNAsequencing，以下簡稱DRS）領(lǐng)域，目前廣泛使用的建庫試劑盒是SQK-RNA004。然而，該試劑盒存在一個明顯的局限性，即無法區(qū)分不同樣品，導(dǎo)致一張芯片一次只能測一個文庫。這不僅限制了運(yùn)行效率，還增加了運(yùn)行成本。為了解決這一問題，正在進(jìn)行β測試的新建庫試劑盒在逆轉(zhuǎn)錄階段引入了條形碼標(biāo)簽（以下簡稱barcode，如圖2A所示），從而實現(xiàn)了對不同樣品的有效區(qū)分。測試結(jié)果顯示，該試劑盒中有24種barcode，一張芯片能夠同時檢測24個文庫，且每個文庫的數(shù)據(jù)量分布均勻（如圖2B所示）。這一創(chuàng)新舉措極大地提高了DRS的運(yùn)行效率，降低了成本，使研究人員能夠在有限的資源下進(jìn)行更大規(guī)模的樣本分析，為RNA研究帶來了更高的便利性和經(jīng)濟(jì)性。圖2RNA修飾更新：拓展檢測范圍，深化表觀研究DRS的最大優(yōu)勢之一是以單堿基分辨率檢測RNA修飾。目前，m6A、m5C、假尿嘧啶和肌苷的分析已經(jīng)整合到了ONTbasecaller軟件Dorado中。然而，RNA修飾的種類遠(yuǎn)不止這四種。在本次發(fā)布會上，ONT介紹了DRS檢測的四種新修飾——2’OMe-A/C/G/U（如圖3A所示）。2’OMe修飾在調(diào)控RNA的穩(wěn)定性、折疊和翻譯過程中發(fā)揮著重要作用，尤其在rRNA和snRNA上豐度較高。若rRNA和snRNA上的修飾模式出現(xiàn)異常，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，官方支持的DRS現(xiàn)在能夠一次性同時檢測多達(dá)8種RNA修飾（如圖3B所示）。這一更新進(jìn)一步拓展了DRS在RNA表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用范圍，為研究人員深入探究RNA修飾在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞生理功能以及疾病發(fā)生發(fā)展中的作用提供了更全面、更精準(zhǔn)的工具，有助于推動RNA表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究不斷向前發(fā)展。圖3隨著Nanopore技術(shù)在RNA測序、表觀和蛋白組等領(lǐng)域的不斷進(jìn)步，我們有理由相信，未來它將在生命科學(xué)的各個研究方向上發(fā)揮更加重要的作用。從更長的讀長、更高的數(shù)據(jù)質(zhì)量，到更高效的運(yùn)行、更低的成本，再到更廣泛的修飾檢測、更深入的表觀研究，這些技術(shù)更新為科研人員提供了更