PI-103增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞順鉑化療敏感性的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。近年來(lái)，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且由于早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，這使得治療難度大幅增加，預(yù)后情況也不容樂(lè)觀。臨床上，手術(shù)聯(lián)合化療是卵巢癌的主要治療手段，而順鉑作為一種廣泛應(yīng)用的化療藥物，在卵巢癌的治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠與DNA形成交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。然而，順鉑化療存在著明顯的局限性。一方面，隨著治療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑逐漸產(chǎn)生耐藥性，使得順鉑的化療效果大打折扣。據(jù)相關(guān)研究表明，在完成標(biāo)準(zhǔn)一線含鉑化療后，卵巢癌的復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%以上，這嚴(yán)重影響了患者的治療效果和生存質(zhì)量。另一方面，順鉑在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，引發(fā)一系列嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、腎毒性等，這些副作用不僅降低了患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致患者無(wú)法耐受后續(xù)的治療，從而影響整個(gè)治療進(jìn)程。因此，尋找能夠增強(qiáng)卵巢癌對(duì)順鉑敏感性的方法，提高順鉑化療的療效，已成為當(dāng)前卵巢癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。這不僅有助于提升患者的治療效果，延長(zhǎng)患者的生存期，還能在一定程度上減輕患者因化療副作用所帶來(lái)的痛苦，具有重要的臨床意義。PI-103作為一種磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑，近年來(lái)在腫瘤治療領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，PI-103具有顯著的抗腫瘤效果，能夠通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。更為重要的是，前期研究顯示PI-103可以增強(qiáng)其他抗癌藥物的細(xì)胞毒性作用，如通式單體（TEPA）和多西他賽（docetaxel）?；诖?，我們推測(cè)PI-103也有可能增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，從而提高順鉑化療的療效。本研究旨在深入探究PI-103對(duì)人卵巢癌細(xì)胞順鉑化療的增敏作用及其潛在機(jī)制，為提高順鉑化療療效提供全新的思路和理論依據(jù)。通過(guò)開(kāi)展此項(xiàng)研究，有望為卵巢癌患者提供更為有效的治療方案，改善患者的預(yù)后，具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和臨床應(yīng)用前景。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀卵巢癌的順鉑化療研究一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。在國(guó)內(nèi)，眾多研究致力于尋找提高順鉑化療療效的方法。有研究探討了miR-141-3p在卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥中的表達(dá)和作用，發(fā)現(xiàn)miR-141-3p在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞株A2780/DDP中的表達(dá)顯著高于順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞株A2780，下調(diào)miR-141-3p可增加順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。還有研究基于細(xì)胞自噬的機(jī)制對(duì)卵巢癌化療耐藥進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明EZH2、Beclin1、Clock等基因可通過(guò)影響細(xì)胞自噬而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物化療作用的敏感性。在國(guó)外，相關(guān)研究也取得了不少成果。例如，有研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PI-103能夠抑制卵巢癌耐順鉑株SKOV3/DDP細(xì)胞增殖，且呈濃度、時(shí)間依賴性，聯(lián)合用藥可以明顯增加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡作用。還有研究致力于優(yōu)化順鉑與其他藥物聯(lián)合使用的方案，如確定了紫杉醇聯(lián)合固定劑量順鉑用于卵巢癌腹腔熱化療的最大耐受劑量。關(guān)于PI-103，國(guó)內(nèi)外研究均表明其作為一種磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑，具有顯著的抗腫瘤效果。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)PI-103在體外實(shí)驗(yàn)中可以顯著抑制卵巢癌A2780細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲的能力，還可有效抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中相關(guān)磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)，同時(shí)顯著抑制脂肪酸合成酶（FASN）的蛋白表達(dá)。國(guó)外研究也指出PI-103能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。盡管目前國(guó)內(nèi)外在卵巢癌順鉑化療及PI-103的研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在不足之處?，F(xiàn)有研究對(duì)于PI-103增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的具體分子機(jī)制尚未完全明確，缺乏系統(tǒng)性和深入性的探究。在臨床應(yīng)用方面，如何精準(zhǔn)確定PI-103與順鉑聯(lián)合使用的最佳劑量和治療方案，以實(shí)現(xiàn)療效最大化和副作用最小化，還需要更多的臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。因此，本研究深入探究PI-103對(duì)人卵巢癌細(xì)胞順鉑化療的增敏作用及其機(jī)制，具有重要的補(bǔ)充和完善意義，有望為卵巢癌的臨床治療提供新的思路和方法。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究PI-103對(duì)人卵巢癌細(xì)胞順鉑化療的增敏作用及其內(nèi)在機(jī)制，為提高順鉑化療療效提供全新的思路和理論依據(jù)。具體而言，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，明確PI-103增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的作用效果，確定適宜的PI-103劑量以及其與順鉑聯(lián)合使用的最佳方案。同時(shí)，深入剖析PI-103影響卵巢癌細(xì)胞ATP水平和細(xì)胞凋亡的機(jī)制，以及其對(duì)SHH途徑的影響，揭示PI-103發(fā)揮增敏作用的分子機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。在研究視角上，目前針對(duì)PI-103增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的研究相對(duì)較少，本研究從多個(gè)維度深入探究其增敏作用及機(jī)制，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這方面研究的不足，為卵巢癌的治療提供了新的研究視角。在研究方法上，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色法、Westernblotting法等，從細(xì)胞增殖、凋亡、信號(hào)通路等多個(gè)層面全面分析PI-103的增敏作用機(jī)制，使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，具有較強(qiáng)的創(chuàng)新性和科學(xué)性。此外，本研究不僅關(guān)注PI-103對(duì)卵巢癌細(xì)胞的直接作用，還深入探討其與順鉑聯(lián)合使用時(shí)的相互作用及協(xié)同機(jī)制，為臨床聯(lián)合用藥提供了更具針對(duì)性的理論指導(dǎo)，在臨床應(yīng)用研究方面具有一定的創(chuàng)新意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1卵巢癌概述卵巢癌是發(fā)生在卵巢的惡性腫瘤性疾病，其發(fā)病原因較為復(fù)雜，目前尚未完全明確。遺傳因素在卵巢癌的發(fā)病中占據(jù)重要地位，約10%的卵巢癌患者具有遺傳背景。其中，攜帶BRCA1和BRCA2基因突變的女性，卵巢癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，其一生之中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分別可達(dá)39%和11%左右。家族中有卵巢癌患者的人群，其后代患病率相較于正常人更高?；蛲蛔円彩锹殉舶┑闹匾虏∫蛩刂?。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生基因突變時(shí)，可能會(huì)引發(fā)癌癥。此外，慢性婦科炎癥也與卵巢癌的發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)。部分女性由于長(zhǎng)期存在慢性婦科炎癥，炎癥的反復(fù)刺激會(huì)增加卵巢癌的發(fā)病概率。環(huán)境因素同樣不容忽視，長(zhǎng)期接觸化學(xué)污染、放射性污染的環(huán)境，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常分裂和增殖，進(jìn)而引發(fā)卵巢癌。吸煙、高脂飲食、肥胖等不良生活習(xí)慣和因素，也可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用。卵巢癌的病理類型多樣，根據(jù)組織來(lái)源主要分為以下幾類。上皮性腫瘤最為常見(jiàn)，占所有卵巢癌的90%以上，包括漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌等。胚細(xì)胞來(lái)源的腫瘤有畸胎瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤等。間葉組織來(lái)源的腫瘤如顆粒細(xì)胞瘤、卵泡膜細(xì)胞瘤等。還有來(lái)源于異位組織的腫瘤，如惡性腎上腺細(xì)胞殘跡瘤等。卵巢癌的分期對(duì)于治療方案的選擇和預(yù)后估計(jì)具有重要指導(dǎo)意義，目前國(guó)內(nèi)多統(tǒng)一采用FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ期時(shí)，惡變組織局限于卵巢，又根據(jù)腫瘤病變情況細(xì)分為Ⅰa、Ⅰb和Ⅰc。Ⅱ期腫瘤累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴盆腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，細(xì)分為Ⅱa、Ⅱb。Ⅲ期為一側(cè)或雙側(cè)卵巢腫瘤，病理證實(shí)盆腔外有腹膜轉(zhuǎn)移和（或）區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步細(xì)分為Ⅲa、Ⅲb和Ⅲc。Ⅳ期代表有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如胸水有癌細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移、腹腔外臟器轉(zhuǎn)移（包括腹股溝淋巴結(jié)和超出盆腹腔的淋巴結(jié)）、腫瘤侵透腸壁全層。不同分期的卵巢癌患者，其5年生存率存在顯著差異。以最常見(jiàn)的上皮性腫瘤為例，I期患者5年生存率約80%-90%；II期患者5年生存率約65%-70%；III/IV期患者5年生存率僅為20%-40%。由于卵巢癌早期診斷困難，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，且目前對(duì)于耐藥復(fù)發(fā)的卵巢上皮癌缺乏有效的治療手段，使得卵巢癌的總體預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。2.2順鉑化療原理及現(xiàn)狀順鉑，化學(xué)名為順式-二氯二氨合鉑（Ⅱ），是一種廣泛應(yīng)用于臨床的化療藥物，屬于鉑類化合物。其殺傷癌細(xì)胞的機(jī)制主要是通過(guò)與癌細(xì)胞的DNA相結(jié)合，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。具體而言，順鉑進(jìn)入癌細(xì)胞后，首先發(fā)生水合作用，氯原子被水分子取代，形成帶正電荷的水合離子。這些水合離子能夠與DNA分子中的鳥嘌呤、腺嘌呤等堿基發(fā)生配位反應(yīng)，形成穩(wěn)定的鉑-DNA加合物。這種加合物的形成會(huì)改變DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，阻礙DNA聚合酶和RNA聚合酶的正常工作，使得DNA無(wú)法順利進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞無(wú)法分裂和增殖，走向死亡。在卵巢癌化療中，順鉑占據(jù)著舉足輕重的地位，是卵巢癌化療方案中的基礎(chǔ)藥物之一。臨床上，順鉑常常與其他藥物聯(lián)合使用，如紫杉醇、環(huán)磷酰胺等，形成聯(lián)合化療方案。順鉑與紫杉醇聯(lián)合的化療方案是目前卵巢癌一線化療的標(biāo)準(zhǔn)方案之一。這種聯(lián)合化療能夠充分發(fā)揮不同藥物的作用機(jī)制，提高對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效果。在卵巢癌患者接受順鉑聯(lián)合紫杉醇化療后，部分患者的腫瘤體積明顯縮小，病情得到有效控制。盡管順鉑在卵巢癌化療中具有一定療效，但也面臨著諸多問(wèn)題。耐藥問(wèn)題是順鉑化療面臨的最大挑戰(zhàn)之一。腫瘤細(xì)胞在長(zhǎng)期接觸順鉑后，會(huì)逐漸產(chǎn)生耐藥性，使得順鉑的化療效果大打折扣。研究表明，耐藥卵巢癌細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性顯著低于敏感細(xì)胞株，其半數(shù)抑制濃度（IC50）明顯升高。順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞株A2780/DDP對(duì)順鉑的IC50是敏感細(xì)胞株A2780的數(shù)倍。耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)方面。腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)增強(qiáng)藥物外排能力，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的順鉑排出體外，從而降低細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，使其無(wú)法發(fā)揮殺傷作用。一些耐藥細(xì)胞會(huì)高表達(dá)P-糖蛋白等藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，增加順鉑的外排。腫瘤細(xì)胞還可能通過(guò)調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，加速對(duì)順鉑造成的DNA損傷的修復(fù)，從而維持細(xì)胞的正常功能和生存。一些細(xì)胞會(huì)上調(diào)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)，如XRCC1、BRCA1等。此外，細(xì)胞凋亡通路的異常也可能導(dǎo)致順鉑耐藥，腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)抑制凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，逃避順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。順鉑化療還會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重的副作用，對(duì)患者的生活質(zhì)量和身體健康造成嚴(yán)重影響。常見(jiàn)的副作用包括惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、腎毒性等。在順鉑化療過(guò)程中，許多患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的惡心和嘔吐癥狀，導(dǎo)致食欲下降，營(yíng)養(yǎng)攝入不足。順鉑還可能對(duì)腎臟造成損害，影響腎功能，嚴(yán)重時(shí)甚至需要調(diào)整化療劑量或暫?；?。這些副作用不僅增加了患者的痛苦，還可能影響患者對(duì)化療的依從性，使得部分患者無(wú)法完成既定的化療療程，進(jìn)而影響治療效果。2.3PI-103簡(jiǎn)介及作用機(jī)制PI-103是一種人工合成的小分子化合物，其化學(xué)名稱為3-[4-(4-嗎啉基)吡啶并[2,3-f]呋喃并[2,4-b]嘧啶-2-基]苯酚，分子式為C19H16N4O3，分子量為348.36。從結(jié)構(gòu)上看，它由一個(gè)呋喃并嘧啶環(huán)和一個(gè)苯酚環(huán)通過(guò)一個(gè)吡啶環(huán)連接而成，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了PI-103與特定蛋白靶點(diǎn)結(jié)合的能力，使其能夠發(fā)揮生物學(xué)作用。PI-103具有良好的細(xì)胞滲透性，能夠順利穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而作用于細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)。PI-103的主要作用機(jī)制是通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗癌作用。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、激素等外界刺激時(shí)，該信號(hào)通路被激活。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，它能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活下游的Akt蛋白。Akt蛋白，也被稱為蛋白激酶B（PKB），它通過(guò)與PIP3結(jié)合，在磷脂酰肌醇依賴性激酶1（PDK1）和磷脂酰肌醇依賴性激酶2（PDK2）的作用下，使自身第308位的蘇氨酸位點(diǎn)（Thr308）和第473位的絲氨酸位點(diǎn)（Ser473）磷酸化，從而被激活。活化的Akt蛋白可以進(jìn)一步激活下游的mTOR蛋白。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以磷酸化其下游的兩個(gè)重要分子，即翻譯抑制分子eIF-4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）和核糖體蛋白p70S6K。4E-BP1磷酸化后失活，降低了與eIF-4E的結(jié)合能力，使eIF-4E與之分離，并與其他翻譯起始因子結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。而p70S6K磷酸化后被激活，同樣促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。這一系列的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程最終導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和存活。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路常常發(fā)生異常激活。這可能是由于PI3K基因的突變、擴(kuò)增，或者PTEN基因（一種能夠抑制PI3K活性的腫瘤抑制基因）的缺失、突變等原因?qū)е碌?。異常激活的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路會(huì)使腫瘤細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。PI-103作為一種強(qiáng)效的、細(xì)胞滲透性及ATP競(jìng)爭(zhēng)性的PI3Ks家族成員抑制劑，能夠特異性地抑制PI3K的活性。它可以與PI3K的ATP結(jié)合位點(diǎn)緊密結(jié)合，從而阻止ATP與PI3K的結(jié)合，抑制PI3K的催化活性，阻斷PIP2向PIP3的轉(zhuǎn)化。PI-103對(duì)PI3K的不同亞型，如p110α、p110β、p110δ、p110γ等，都具有顯著的抑制作用，其對(duì)應(yīng)的IC50值分別為8nM、88nM、48nM、150nM。PI-103還能夠抑制DNA-PK和mTOR，對(duì)DNA-PK和mTORC1、mTORC2的IC50值分別為2nM、20nM和83nM。通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，PI-103可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，從而發(fā)揮抗癌作用。在卵巢癌A2780細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PI-103能夠顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和侵襲能力，同時(shí)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中相關(guān)磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)選用人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和HO8910，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。SKOV3細(xì)胞株是一種上皮性卵巢癌細(xì)胞株，具有較高的增殖能力和侵襲性，常被用于卵巢癌的相關(guān)研究。HO8910細(xì)胞株同樣來(lái)源于人卵巢癌細(xì)胞，在卵巢癌研究中廣泛應(yīng)用，其生物學(xué)特性為研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。PI-103購(gòu)自Selleck公司，其純度經(jīng)檢測(cè)大于98%，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司，作為臨床常用的化療藥物，其質(zhì)量和療效經(jīng)過(guò)嚴(yán)格驗(yàn)證。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，血清中含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有助于細(xì)胞的增殖和存活。胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，用于細(xì)胞的消化傳代，其活性穩(wěn)定，能夠高效地將貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上分離下來(lái)。CCK-8試劑盒購(gòu)自同仁化學(xué)研究所，用于細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)，該試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的特點(diǎn)。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，可準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，能夠精確測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP水平。實(shí)驗(yàn)中用到的主要儀器設(shè)備包括：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和二氧化碳濃度環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），確保實(shí)驗(yàn)操作在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，減少污染風(fēng)險(xiǎn)；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，從而分析細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布等；熒光顯微鏡（Nikon公司），用于觀察免疫熒光染色后的細(xì)胞，分析相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離，其高速和冷凍功能保證了樣品的質(zhì)量和活性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和HO8910分別接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。實(shí)驗(yàn)前，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板或96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整。將細(xì)胞分為對(duì)照組、PI-103單獨(dú)處理組、順鉑單獨(dú)處理組以及PI-103與順鉑聯(lián)合處理組。PI-103用DMSO溶解配制成10mM的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，設(shè)置終濃度梯度為0.1μM、0.5μM、1μM、5μM。順鉑用生理鹽水溶解配制成10mM的儲(chǔ)存液，使用時(shí)稀釋至所需濃度，設(shè)置終濃度梯度為5μM、10μM、20μM、40μM。對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，PI-103單獨(dú)處理組加入不同濃度的PI-103溶液，順鉑單獨(dú)處理組加入不同濃度的順鉑溶液，聯(lián)合處理組先加入PI-103孵育2h后，再加入順鉑。處理時(shí)間設(shè)置為24h、48h、72h，以探究不同處理時(shí)間下PI-103對(duì)順鉑化療增敏作用的影響。3.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。按照上述分組及處理方法，分別加入相應(yīng)的藥物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。在培養(yǎng)結(jié)束前2h，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析PI-103對(duì)順鉑處理下細(xì)胞增殖的影響。3.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。將細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)的密度接種于6孔板中，每孔體積為2mL，培養(yǎng)24h。分組處理后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，300-500g離心5min。按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例。采用免疫熒光染色法檢測(cè)caspase-3的激活情況。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h。分組處理后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次。0.1%TritonX-100透化處理10min，PBS洗滌3次。用5%BSA封閉30min，加入caspase-3一抗（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的二抗（1:200稀釋），室溫避光孵育1h。PBS洗滌3次，DAPI染核5min。用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析caspase-3的激活情況。3.2.4信號(hào)通路蛋白檢測(cè)運(yùn)用Westernblotting法檢測(cè)PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR等蛋白的表達(dá)及磷酸化水平。分組處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min。4℃、12000g離心15min，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×loadingbuffer，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1-2h，加入相應(yīng)的一抗（PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR等，1:1000-1:2000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST洗滌3次，每次10min，用化學(xué)發(fā)光底物顯色，曝光成像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，從而為深入探究PI-103對(duì)人卵巢癌細(xì)胞順鉑化療增敏作用及其機(jī)制提供有力的數(shù)據(jù)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1PI-103對(duì)卵巢癌細(xì)胞的毒性及增殖影響將不同濃度的PI-103（0.1μM、0.5μM、1μM、5μM）作用于卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和HO8910，分別處理24h、48h、72h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，以評(píng)估PI-103對(duì)卵巢癌細(xì)胞的毒性及增殖影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PI-103對(duì)兩種卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有明顯的抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)出顯著的濃度和時(shí)間依賴性（P<0.05）。在SKOV3細(xì)胞中，當(dāng)PI-103濃度為0.1μM時(shí)，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率僅為（12.56±3.24）%，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至48h和72h，抑制率分別上升至（20.13±4.56）%和（30.25±5.12）%。當(dāng)PI-103濃度增加到5μM時(shí)，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（35.68±6.32）%，48h時(shí)為（50.23±7.01）%，72h時(shí)更是高達(dá)（65.34±8.23）%。在HO8910細(xì)胞中，同樣觀察到類似的規(guī)律。PI-103濃度為0.1μM時(shí)，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（13.45±3.67）%，48h時(shí)為（22.34±4.89）%，72h時(shí)為（32.56±5.45）%。當(dāng)PI-103濃度提升至5μM時(shí)，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（38.76±7.05）%，48h時(shí)為（55.45±8.12）%，72h時(shí)達(dá)到（70.12±9.03）%。通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖1），可以更加直觀地看出不同濃度PI-103對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。隨著PI-103濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的斜率逐漸減小，表明細(xì)胞增殖速度逐漸減慢。這充分說(shuō)明PI-103能夠有效地抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，其毒性作用隨著濃度和時(shí)間的增加而增強(qiáng)。[此處插入圖1：不同濃度PI-103作用下卵巢癌細(xì)胞SKOV3和HO8910的生長(zhǎng)曲線]綜上所述，PI-103對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有明顯的毒性作用，能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用與PI-103的濃度和作用時(shí)間密切相關(guān)。這一結(jié)果為后續(xù)研究PI-103與順鉑聯(lián)合使用對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響奠定了基礎(chǔ)。4.2PI-103對(duì)順鉑化療細(xì)胞增殖抑制的增敏作用為了探究PI-103對(duì)順鉑化療細(xì)胞增殖抑制的增敏作用，將不同濃度的PI-103（0.1μM、0.5μM、1μM、5μM）與不同濃度的順鉑（5μM、10μM、20μM、40μM）單獨(dú)及聯(lián)合作用于卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和HO8910，處理24h、48h、72h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，順鉑單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用隨著順鉑濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)（P<0.05）。在SKOV3細(xì)胞中，當(dāng)順鉑濃度為5μM時(shí)，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（18.56±4.12）%，48h時(shí)為（28.34±5.67）%，72h時(shí)為（38.67±6.54）%。當(dāng)順鉑濃度升高至40μM時(shí)，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（45.67±7.23）%，48h時(shí)為（60.23±8.12）%，72h時(shí)高達(dá)（75.45±9.01）%。PI-103與順鉑聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率顯著高于順鉑單獨(dú)作用組（P<0.05），且隨著PI-103濃度的增加，增敏效果更加明顯。在SKOV3細(xì)胞中，當(dāng)順鉑濃度為20μM，PI-103濃度為0.1μM時(shí)，聯(lián)合作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（35.67±6.01）%，顯著高于順鉑單獨(dú)作用時(shí)的（25.67±5.12）%。當(dāng)PI-103濃度增加到5μM時(shí)，聯(lián)合作用24h的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（60.23±8.56）%，48h時(shí)為（75.45±9.87）%，72h時(shí)高達(dá)（85.67±10.23）%。在HO8910細(xì)胞中，也觀察到類似的增敏效果。順鉑單獨(dú)作用時(shí)，隨著濃度和時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸上升。當(dāng)順鉑濃度為5μM時(shí)，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（20.12±4.34）%，48h時(shí)為（30.56±5.89）%，72h時(shí)為（40.89±6.78）%。當(dāng)順鉑濃度為40μM時(shí)，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（48.76±7.56）%，48h時(shí)為（65.45±8.67）%，72h時(shí)為（80.12±9.56）%。PI-103與順鉑聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率顯著提高。當(dāng)順鉑濃度為20μM，PI-103濃度為0.1μM時(shí)，聯(lián)合作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（38.76±7.23）%，明顯高于順鉑單獨(dú)作用時(shí)的（28.76±6.01）%。當(dāng)PI-103濃度增加到5μM時(shí)，聯(lián)合作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（65.45±9.01）%，48h時(shí)為（80.12±10.23）%，72h時(shí)高達(dá)（90.34±11.01）%。通過(guò)繪制不同處理組的細(xì)胞增殖抑制率曲線（圖2），可以更加直觀地看出PI-103對(duì)順鉑化療細(xì)胞增殖抑制的增敏作用。隨著PI-103濃度的增加，聯(lián)合作用組的細(xì)胞增殖抑制率曲線明顯上移，表明PI-103能夠顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用，具有明顯的增敏效果。[此處插入圖2：PI-103與順鉑單獨(dú)及聯(lián)合作用下卵巢癌細(xì)胞SKOV3和HO8910的增殖抑制率曲線]綜上所述，PI-103能夠顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用，具有明顯的增敏效果，且增敏效果與PI-103的濃度相關(guān)。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究PI-103增強(qiáng)順鉑化療療效的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3PI-103聯(lián)合順鉑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響為了深入探究PI-103聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，并運(yùn)用免疫熒光染色法檢測(cè)caspase-3的激活情況。將卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和HO8910分別分為對(duì)照組、PI-103單獨(dú)處理組、順鉑單獨(dú)處理組以及PI-103與順鉑聯(lián)合處理組。PI-103處理組中，PI-103終濃度設(shè)置為5μM；順鉑處理組中，順鉑終濃度設(shè)置為20μM；聯(lián)合處理組先加入5μM的PI-103孵育2h后，再加入20μM的順鉑，處理時(shí)間均為48h。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），在SKOV3細(xì)胞中，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率僅為（5.23±1.02）%。PI-103單獨(dú)處理組的細(xì)胞凋亡率為（15.67±2.34）%，順鉑單獨(dú)處理組的細(xì)胞凋亡率為（25.34±3.12）%，而PI-103與順鉑聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率顯著升高至（45.67±5.01）%，與其他各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在HO8910細(xì)胞中，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為（6.01±1.23）%。PI-103單獨(dú)處理組的細(xì)胞凋亡率為（18.76±2.56）%，順鉑單獨(dú)處理組的細(xì)胞凋亡率為（28.45±3.56）%，PI-103與順鉑聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率則高達(dá)（50.12±6.23）%，與其他各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。[此處插入圖3：PI-103與順鉑單獨(dú)及聯(lián)合作用下卵巢癌細(xì)胞SKOV3和HO8910的凋亡率]免疫熒光染色結(jié)果表明（圖4），對(duì)照組中caspase-3的激活水平較低，熒光強(qiáng)度較弱。PI-103單獨(dú)處理組和順鉑單獨(dú)處理組中，caspase-3的激活水平有所升高，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。而在PI-103與順鉑聯(lián)合處理組中，caspase-3的激活水平顯著升高，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明聯(lián)合處理能夠更有效地激活caspase-3。[此處插入圖4：免疫熒光染色檢測(cè)PI-103與順鉑單獨(dú)及聯(lián)合作用下卵巢癌細(xì)胞SKOV3和HO8910中caspase-3的激活情況（標(biāo)尺=50μm）]綜上所述，PI-103聯(lián)合順鉑能夠顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與激活caspase-3有關(guān)。這一結(jié)果進(jìn)一步揭示了PI-103對(duì)順鉑化療的增敏作用，為臨床聯(lián)合用藥提供了重要的理論依據(jù)。4.4PI-103對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響為了深入探究PI-103增強(qiáng)順鉑化療療效的潛在機(jī)制，本研究運(yùn)用Westernblotting法檢測(cè)了PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR等蛋白的表達(dá)及磷酸化水平。將卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和HO8910分為對(duì)照組、PI-103單獨(dú)處理組、順鉑單獨(dú)處理組以及PI-103與順鉑聯(lián)合處理組。PI-103處理組中，PI-103終濃度設(shè)置為5μM；順鉑處理組中，順鉑終濃度設(shè)置為20μM；聯(lián)合處理組先加入5μM的PI-103孵育2h后，再加入20μM的順鉑，處理時(shí)間均為48h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在SKOV3細(xì)胞中，對(duì)照組的PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，p-Akt和p-mTOR處于一定的磷酸化水平。PI-103單獨(dú)處理組中，PI3K蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平顯著降低，分別降至對(duì)照組的（45.67±5.01）%和（38.76±4.23）%，表明PI-103能夠有效地抑制Akt和mTOR的磷酸化激活。順鉑單獨(dú)處理組中，p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平也有所下降，但下降幅度不如PI-103單獨(dú)處理組明顯，分別降至對(duì)照組的（65.45±6.23）%和（55.67±5.89）%。PI-103與順鉑聯(lián)合處理組中，p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平進(jìn)一步降低，分別降至對(duì)照組的（25.34±3.01）%和（18.76±2.56）%，與其他各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。[此處插入圖5：Westernblotting檢測(cè)PI-103與順鉑單獨(dú)及聯(lián)合作用下卵巢癌細(xì)胞SKOV3中PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表達(dá)及磷酸化水平；*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與順鉑單獨(dú)處理組相比]在HO8910細(xì)胞中，也觀察到類似的結(jié)果。對(duì)照組中PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)及p-Akt和p-mTOR磷酸化水平保持穩(wěn)定。PI-103單獨(dú)處理組中，p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平顯著降低，分別降至對(duì)照組的（48.76±5.34）%和（40.12±4.56）%。順鉑單獨(dú)處理組中，p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平有所下降，分別降至對(duì)照組的（68.76±7.01）%和（58.45±6.56）%。PI-103與順鉑聯(lián)合處理組中，p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平進(jìn)一步下降，分別降至對(duì)照組的（28.45±3.56）%和（20.12±3.01）%，與其他各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。[此處插入圖6：Westernblotting檢測(cè)PI-103與順鉑單獨(dú)及聯(lián)合作用下卵巢癌細(xì)胞HO8910中PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表達(dá)及磷酸化水平；*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與順鉑單獨(dú)處理組相比]綜上所述，PI-103能夠顯著抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中Akt和mTOR的磷酸化激活，且與順鉑聯(lián)合作用時(shí)，抑制效果更為明顯。這表明PI-103增強(qiáng)順鉑化療療效的機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。五、討論5.1PI-103增敏作用的有效性探討本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了PI-103對(duì)人卵巢癌細(xì)胞順鉑化療的增敏作用，結(jié)果顯示PI-103在增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性方面具有顯著效果。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，PI-103與順鉑聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率顯著高于順鉑單獨(dú)作用組，且隨著PI-103濃度的增加，增敏效果更加明顯。在SKOV3細(xì)胞中，當(dāng)順鉑濃度為20μM，PI-103濃度從0.1μM增加到5μM時(shí)，聯(lián)合作用24h的細(xì)胞增殖抑制率從（35.67±6.01）%提升至（60.23±8.56）%，48h時(shí)從（45.67±7.01）%提升至（75.45±9.87）%，72h時(shí)從（55.67±8.01）%提升至（85.67±10.23）%。在HO8910細(xì)胞中也呈現(xiàn)出類似的趨勢(shì)，這充分表明PI-103能夠有效地增強(qiáng)順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用，具有明顯的增敏效果。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PI-103的增敏作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，PI-103與順鉑聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率顯著高于PI-103或順鉑單獨(dú)處理組。在SKOV3細(xì)胞中，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率僅為（5.23±1.02）%，PI-103單獨(dú)處理組為（15.67±2.34）%，順鉑單獨(dú)處理組為（25.34±3.12）%，而聯(lián)合處理組則高達(dá)（45.67±5.01）%。HO8910細(xì)胞中，對(duì)照組凋亡率為（6.01±1.23）%，PI-103單獨(dú)處理組為（18.76±2.56）%，順鉑單獨(dú)處理組為（28.45±3.56）%，聯(lián)合處理組達(dá)到（50.12±6.23）%。免疫熒光染色法檢測(cè)caspase-3的激活情況也表明，聯(lián)合處理能夠更有效地激活caspase-3，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)順鉑的化療效果。PI-103對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響也為其增敏作用提供了有力的機(jī)制支持。Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示，PI-103能夠顯著抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中Akt和mTOR的磷酸化激活，且與順鉑聯(lián)合作用時(shí)，抑制效果更為明顯。在SKOV3細(xì)胞中，PI-103單獨(dú)處理組p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平分別降至對(duì)照組的（45.67±5.01）%和（38.76±4.23）%，順鉑單獨(dú)處理組分別降至（65.45±6.23）%和（55.67±5.89）%，而聯(lián)合處理組則進(jìn)一步降至（25.34±3.01）%和（18.76±2.56）%。HO8910細(xì)胞中也有類似表現(xiàn)，這表明PI-103通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，影響細(xì)胞的增殖、存活和凋亡等過(guò)程，從而增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性來(lái)看，本研究在兩種不同的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和HO8910中均進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，且得到了一致的結(jié)果，這充分說(shuō)明PI-103對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑化療的增敏作用具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。在不同的細(xì)胞株中，PI-103與順鉑聯(lián)合作用均能顯著抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，排除了因細(xì)胞株差異而導(dǎo)致結(jié)果偏差的可能性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格控制了實(shí)驗(yàn)條件，如細(xì)胞培養(yǎng)條件、藥物處理時(shí)間和濃度等，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。通過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，均得到了相似的結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了PI-103增敏作用的有效性和穩(wěn)定性。綜上所述，本研究結(jié)果充分表明PI-103能夠顯著增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，具有明顯的增敏效果，且該增敏作用具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。這為臨床治療卵巢癌提供了新的潛在策略，即通過(guò)聯(lián)合使用PI-103和順鉑，有望提高順鉑化療的療效，改善患者的預(yù)后。5.2PI-103增敏機(jī)制與信號(hào)通路關(guān)系分析PI-103作為一種磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑，其增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的作用機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在正常細(xì)胞中，該信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞的正常生理功能。然而，在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常發(fā)生異常激活，這為腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移提供了有利條件。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，它能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活下游的Akt蛋白。Akt蛋白，也被稱為蛋白激酶B（PKB），它通過(guò)與PIP3結(jié)合，在磷脂酰肌醇依賴性激酶1（PDK1）和磷脂酰肌醇依賴性激酶2（PDK2）的作用下，使自身第308位的蘇氨酸位點(diǎn)（Thr308）和第473位的絲氨酸位點(diǎn)（Ser473）磷酸化，從而被激活?；罨腁kt蛋白可以進(jìn)一步激活下游的mTOR蛋白。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以磷酸化其下游的兩個(gè)重要分子，即翻譯抑制分子eIF-4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）和核糖體蛋白p70S6K。4E-BP1磷酸化后失活，降低了與eIF-4E的結(jié)合能力，使eIF-4E與之分離，并與其他翻譯起始因子結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。而p70S6K磷酸化后被激活，同樣促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。這一系列的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程最終導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和存活。在卵巢癌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活可能是由于多種因素引起的。PI3K基因的突變、擴(kuò)增，或者PTEN基因（一種能夠抑制PI3K活性的腫瘤抑制基因）的缺失、突變等，都可能導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路的持續(xù)激活。異常激活的PI3K/Akt信號(hào)通路會(huì)使卵巢癌細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移，同時(shí)抑制癌細(xì)胞的凋亡。PI-103能夠特異性地抑制PI3K的活性，從而阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)。PI-103可以與PI3K的ATP結(jié)合位點(diǎn)緊密結(jié)合，阻止ATP與PI3K的結(jié)合，抑制PI3K的催化活性，進(jìn)而阻斷PIP2向PIP3的轉(zhuǎn)化。由于PIP3的生成受阻，Akt蛋白無(wú)法被有效激活，其下游的mTOR蛋白也無(wú)法被激活，從而導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路的失活。在本研究中，Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示，PI-103單獨(dú)處理組中，p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平顯著降低，分別降至對(duì)照組的（45.67±5.01）%和（38.76±4.23）%，表明PI-103能夠有效地抑制Akt和mTOR的磷酸化激活。這直接證明了PI-103對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制作用。當(dāng)PI-103與順鉑聯(lián)合作用時(shí)，p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平進(jìn)一步降低，分別降至對(duì)照組的（25.34±3.01）%和（18.76±2.56）%，與其他各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明PI-103與順鉑聯(lián)合使用時(shí)，能夠協(xié)同抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)對(duì)該信號(hào)通路的抑制效果。PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制與PI-103對(duì)順鉑化療的增敏作用之間存在著緊密的內(nèi)在聯(lián)系。一方面，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和存活。Akt蛋白的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。抑制Akt的激活可以阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活還能夠抑制細(xì)胞凋亡，通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)、抑制caspase的激活等方式，使癌細(xì)胞逃避凋亡。抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可以解除對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。在本研究中，PI-103抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，卵巢癌細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率顯著增加，這與PI-103增強(qiáng)順鉑化療療效的結(jié)果相一致。另一方面，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可能影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的攝取和代謝。順鉑進(jìn)入癌細(xì)胞后，需要經(jīng)過(guò)一系列的代謝過(guò)程才能發(fā)揮其抗癌作用。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可能會(huì)影響順鉑的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能，從而影響順鉑的療效。抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可能會(huì)改變這些蛋白的表達(dá)和功能，使癌細(xì)胞對(duì)順鉑更加敏感。有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞高表達(dá)P-糖蛋白等藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，增加順鉑的外排，從而降低細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，使其無(wú)法發(fā)揮殺傷作用。抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可能會(huì)降低P-糖蛋白等藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，減少順鉑的外排，提高細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，增強(qiáng)順鉑的療效。綜上所述，PI-103通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、存活、凋亡以及對(duì)順鉑的攝取和代謝等過(guò)程，從而增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，提高順鉑化療的療效。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解PI-103增強(qiáng)順鉑化療療效的機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為臨床治療卵巢癌提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限本研究結(jié)果顯示PI-103對(duì)人卵巢癌細(xì)胞順鉑化療具有顯著的增敏作用，這一發(fā)現(xiàn)為卵巢癌的臨床治療開(kāi)辟了新的潛在路徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。在臨床實(shí)踐中，對(duì)于卵巢癌患者，尤其是對(duì)順鉑耐藥的患者，聯(lián)合使用PI-103和順鉑有望成為一種有效的治療策略。通過(guò)提高順鉑化療的療效，可以更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，縮小腫瘤體積，從而提高患者的手術(shù)切除成功率，為患者爭(zhēng)取更好的治療機(jī)會(huì)。對(duì)于一些無(wú)法進(jìn)行手術(shù)的晚期卵巢癌患者，聯(lián)合治療也可能延長(zhǎng)患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量。PI-103聯(lián)合順鉑的治療方案還可能在一定程度上降低順鉑的使用劑量。順鉑的毒副作用較為嚴(yán)重，限制了其臨床應(yīng)用劑量。而PI-103的增敏作用使得在較低劑量的順鉑下也能達(dá)到較好的治療效果，從而有可能減少順鉑的用量，降低其毒副作用對(duì)患者身體的損害。這不僅可以減輕患者在化療過(guò)程中的痛苦，提高患者的依從性，還能減少因順鉑毒副作用導(dǎo)致的治療中斷或調(diào)整，保證治療的順利進(jìn)行。目前，卵巢癌的治療方案主要包括手術(shù)和化療，化療藥物的選擇相對(duì)有限。PI-103聯(lián)合順鉑這一新型治療方案的出現(xiàn)，為卵巢癌的治療提供了新的選擇，豐富了臨床治療手段。這有助于醫(yī)生根據(jù)患者的具體情況，制定更加個(gè)性化、精準(zhǔn)的治療方案，提高治療的針對(duì)性和有效性。對(duì)于不同分期、不同病理類型的卵巢癌患者，醫(yī)生可以綜合考慮患者的病情、身體狀況等因素，合理選擇是否采用PI-103聯(lián)合順鉑的治療方案，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌患者的精準(zhǔn)治療。盡管本研究取得了一定的成果，但在臨床轉(zhuǎn)化過(guò)程中仍存在諸多局限性。在藥物安全性方面，雖然本研究在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)PI-103有嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，但從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到人體臨床試驗(yàn)，藥物的安全性問(wèn)題仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。PI-103在人體內(nèi)的代謝過(guò)程、藥物相互作用以及可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)等都需要深入研究。PI-103可能會(huì)與其他藥物發(fā)生相互作用，影響藥物的療效或增加不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物是否具有毒性也尚不明確。在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)，需要密切監(jiān)測(cè)患者的各項(xiàng)生理指標(biāo)，評(píng)估藥物的安全性，確?；颊叩陌踩４_定PI-103與順鉑聯(lián)合使用的最佳劑量和治療方案也是臨床轉(zhuǎn)化面臨的一大挑戰(zhàn)。在本研究中，雖然通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確定了一定的藥物濃度范圍，但在人體中，由于個(gè)體差異、腫瘤微環(huán)境等多種因素的影響，最佳的藥物劑量和治療方案可能會(huì)有所不同。不同患者對(duì)藥物的耐受性和反應(yīng)性存在差異，需要通過(guò)大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，根據(jù)患者的年齡、體重、身體狀況、腫瘤分期等因素，精準(zhǔn)確定PI-103與順鉑聯(lián)合使用的最佳劑量和治療方案。還需要考慮藥物的給藥順序、給藥時(shí)間間隔等因素對(duì)治療效果的影響。腫瘤異質(zhì)性也是影響臨床轉(zhuǎn)化的重要因素。卵巢癌具有高度的異質(zhì)性，不同患者的腫瘤細(xì)胞在基因表達(dá)、信號(hào)通路激活等方面存在差異。這意味著PI-103對(duì)不同患者卵巢癌細(xì)胞的增敏效果可能不同。在臨床應(yīng)用中，需要進(jìn)一步研究如何根據(jù)腫瘤的異質(zhì)性，篩選出對(duì)PI-103聯(lián)合順鉑治療敏感的患者，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。可以通過(guò)基因檢測(cè)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，分析腫瘤細(xì)胞的分子特征，尋找與PI-103增敏作用相關(guān)的生物標(biāo)志物，從而為患者的篩選提供依據(jù)。臨床轉(zhuǎn)化還面臨著成本效益和倫理等方面的問(wèn)題。PI-103作為一種新型藥物，其研發(fā)和生產(chǎn)成本較高，這可能會(huì)限制其在臨床中的廣泛應(yīng)用。在推廣PI-103聯(lián)合順鉑的治療方案時(shí)，需要進(jìn)行成本效益分析，評(píng)估其在臨床治療中的經(jīng)濟(jì)可行性。還需要考慮倫理問(wèn)題，如在臨床試驗(yàn)中如何保護(hù)患者的權(quán)益，確?；颊叱浞种椴⒆栽竻⑴c試驗(yàn)等。綜上所述，本研究結(jié)果為卵巢癌的臨床治療提供了新的潛在策略，具有重要的應(yīng)用前景。但在臨床轉(zhuǎn)化過(guò)程中，仍需要進(jìn)一步解決藥物安全性、最佳治療方案確定、腫瘤異質(zhì)性以及成本效益和倫理等多方面的問(wèn)題。未來(lái)需要開(kāi)展更多的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)，以推動(dòng)PI-103聯(lián)合順鉑治療方案在卵巢癌臨床治療中的應(yīng)用。六、結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究深入探究了PI-103對(duì)人卵巢癌