IL-21基因修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合miR-200c抗卵巢癌的協(xié)同效應(yīng)及機(jī)制探究一、緒論1.1研究背景卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤的主要類型之一，也是女性最常見的致死腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在卵巢癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌三大婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的發(fā)病率居于第三位，但死亡率卻居首位。臨床上常用三個(gè)70%來描述卵巢癌的兇險(xiǎn)程度：約70%的卵巢癌患者確診時(shí)已是晚期，70%的患者會在初次治療后兩三年內(nèi)復(fù)發(fā)，70%的患者生存時(shí)間不超過五年。目前，常規(guī)的卵巢癌治療方案主要包括手術(shù)切除腫瘤和化療。手術(shù)切除可以直接去除腫瘤組織，但對于晚期卵巢癌患者，由于腫瘤的廣泛轉(zhuǎn)移和浸潤，手術(shù)往往難以徹底清除癌細(xì)胞，且手術(shù)創(chuàng)傷較大，患者恢復(fù)時(shí)間長，可能會出現(xiàn)多種并發(fā)癥。化療則是通過使用化學(xué)藥物來殺死癌細(xì)胞，但化療藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會對正常細(xì)胞造成損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。此外，化療還容易使癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳，復(fù)發(fā)率高。據(jù)相關(guān)研究表明，卵巢癌患者在完成標(biāo)準(zhǔn)一線含鉑化療后，復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%以上。因此，傳統(tǒng)的治療方法存在著諸多局限性，迫切需要尋求新的治療方法來提高卵巢癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。干細(xì)胞治療因其具有自我更新、自我復(fù)制和分化多能性等特性，逐漸成為研究熱點(diǎn)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs）作為一種成熟的干細(xì)胞，具有來源豐富、獲取方便、免疫原性低、無倫理爭議等優(yōu)點(diǎn)，在多種疾病的治療中展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。hUC-MSCs能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。同時(shí)，hUC-MSCs還可以通過歸巢效應(yīng)，定向遷移到腫瘤部位，發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來，越來越多的研究表明，干細(xì)胞治療在卵巢癌的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為卵巢癌的治療提供了新的思路?；蛑委熥鳛橐环N新興的治療手段，通過將正?；蚧蛑亟M治療基因?qū)氘惓＜?xì)胞的DNA系統(tǒng)中，以抑制致病基因表達(dá)或修復(fù)缺陷基因表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。在卵巢癌的治療中，基因治療可以針對卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因和信號通路，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。IL-21和miR-200c在卵巢癌治療中具有重要的作用。IL-21是一種由活化的T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-21能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，具有很好的抗腫瘤效果。miR-200c是一種微小RNA，能夠通過靶向轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2來抑制卵巢癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，IL-21和miR-200c在卵巢癌的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究將探究IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c在卵巢癌治療中的協(xié)同作用，旨在為卵巢癌的治療提供新的思路和方法。通過將IL-21基因?qū)雋UC-MSCs中，使其能夠持續(xù)分泌IL-21，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)；同時(shí)，聯(lián)合miR-200c，抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，有望提高卵巢癌的治療效果，為卵巢癌患者帶來新的希望。1.2研究目的和意義卵巢癌作為嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，傳統(tǒng)治療方法存在諸多局限性，迫切需要探索新的治療策略。本研究旨在探究IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯(lián)合miR-200c在卵巢癌治療中的協(xié)同作用，為卵巢癌的治療提供新的思路和方法。具體而言，本研究具有以下目的：第一，通過基因工程技術(shù)，將IL-21基因?qū)雋UC-MSCs中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)IL-21的hUC-MSCs細(xì)胞系，驗(yàn)證其對卵巢癌細(xì)胞的抑制作用。第二，研究miR-200c對卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，明確其在卵巢癌治療中的作用機(jī)制。第三，探究IL-21基因修飾的hUC-MSCs與miR-200c聯(lián)合使用時(shí)，對卵巢癌生長和轉(zhuǎn)移的協(xié)同抑制作用，評估聯(lián)合治療方案的療效。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，深入研究IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c抗卵巢癌的作用機(jī)制，有助于揭示卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為卵巢癌的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)，豐富腫瘤生物學(xué)和基因治療領(lǐng)域的知識體系。在IL-21基因修飾的hUC-MSCs方面，進(jìn)一步明確其在腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)作用以及對卵巢癌細(xì)胞的直接殺傷機(jī)制，有助于拓展對干細(xì)胞治療腫瘤的認(rèn)識。對于miR-200c，深入探究其通過靶向轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2抑制卵巢癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的具體分子通路，將為卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供新的視角。在臨床應(yīng)用方面，本研究的成果有望為卵巢癌患者提供一種新的、有效的治療方案，改善患者的預(yù)后，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。當(dāng)前卵巢癌患者面臨著治療效果不佳、復(fù)發(fā)率高、毒副作用大等問題，本研究提出的聯(lián)合治療策略如果能夠取得良好的效果，將為臨床醫(yī)生提供更多的治療選擇，打破傳統(tǒng)治療方法的局限。IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c聯(lián)合治療可能減少化療藥物的使用劑量和頻率，從而降低化療的毒副作用，提高患者的治療依從性。這種聯(lián)合治療方法還可能針對卵巢癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵問題，有效抑制腫瘤的生長和擴(kuò)散，延長患者的無進(jìn)展生存期和總生存期。本研究的開展對于推動卵巢癌治療領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義，有望為卵巢癌患者帶來新的希望。1.3研究方法和創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，從細(xì)胞、動物和分子生物學(xué)等多個(gè)層面深入探究IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯(lián)合miR-200c抗卵巢癌的作用機(jī)制和治療效果。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分離、培養(yǎng)和鑒定hUC-MSCs，并利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將IL-21基因?qū)雋UC-MSCs中，獲得IL-21基因修飾的hUC-MSCs。之后，將不同組別的細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)，運(yùn)用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，以明確不同組別細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。在動物實(shí)驗(yàn)層面，構(gòu)建卵巢癌裸鼠模型，將不同組別的hUC-MSCs移植到裸鼠體內(nèi)，定期測量腫瘤體積和重量，觀察腫瘤生長情況。通過對裸鼠進(jìn)行活體成像，追蹤hUC-MSCs在體內(nèi)的分布和歸巢情況，研究其對卵巢癌生長和轉(zhuǎn)移的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對裸鼠進(jìn)行解剖，取腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)角度，采用Westernblotting和qPCR等技術(shù)，檢測不同組別細(xì)胞中IL-21、miR-200c以及相關(guān)信號通路蛋白和基因的表達(dá)水平變化。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-200c與靶基因ZEB1和ZEB2的靶向關(guān)系，深入探究聯(lián)合治療的分子機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面。一是多靶點(diǎn)聯(lián)合治療，創(chuàng)新性地將IL-21基因修飾的hUC-MSCs與miR-200c聯(lián)合應(yīng)用于卵巢癌治療研究。IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠持續(xù)分泌IL-21，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，直接抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；miR-200c則通過靶向轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2，抑制卵巢癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。兩者聯(lián)合，從多個(gè)靶點(diǎn)協(xié)同作用，有望克服單一治療方法的局限性，提高卵巢癌的治療效果。二是深入機(jī)制研究，在研究聯(lián)合治療對卵巢癌生長和轉(zhuǎn)移的影響時(shí)，不僅僅停留在觀察表面現(xiàn)象，還深入探究其內(nèi)在的分子機(jī)制。通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，全面分析聯(lián)合治療對相關(guān)信號通路和基因表達(dá)的調(diào)控作用，揭示IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c協(xié)同抗卵巢癌的深層機(jī)制，為卵巢癌的治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1卵巢癌概述卵巢癌是發(fā)生在卵巢的惡性腫瘤性疾病，是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一。卵巢作為女性重要的生殖器官，位于盆腔深部，位置較為隱匿，這使得卵巢癌在早期階段很難被察覺。卵巢癌的發(fā)病原因目前尚未完全明確，但研究表明，其發(fā)病與多種因素有關(guān)。遺傳因素在卵巢癌的發(fā)病中起著重要作用，約10%-15%的卵巢癌患者具有遺傳背景，特別是攜帶乳腺癌易感基因（BRCA1/BRCA2）突變的女性，其患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。激素水平失衡也可能與卵巢癌的發(fā)生相關(guān)，長期高水平的雌激素刺激可能促進(jìn)卵巢上皮細(xì)胞的增殖和癌變。生活方式和環(huán)境因素同樣不容忽視，如長期高脂肪飲食、肥胖、長期接觸化學(xué)物質(zhì)等，都可能增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。從病理類型來看，卵巢癌主要分為上皮性卵巢癌、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、性索間質(zhì)腫瘤和轉(zhuǎn)移性癌四大類。上皮性卵巢癌是最為常見的類型，約占卵巢癌總數(shù)的70%-85%，其來源于卵巢表面的上皮細(xì)胞，惡性程度較高，早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已處于晚期。卵巢生殖細(xì)胞腫瘤占卵巢癌的10%-20%，多發(fā)生于年輕女性，常見的病理亞型包括未成熟畸胎瘤、內(nèi)胚竇瘤、無性細(xì)胞瘤等，這類腫瘤對化療較為敏感，預(yù)后相對較好。性索間質(zhì)腫瘤較為少見，約占卵巢癌的5%，來源于卵巢的性索間質(zhì)細(xì)胞，如顆粒細(xì)胞瘤、卵泡膜細(xì)胞瘤等，其惡性程度相對較低。轉(zhuǎn)移性癌則是由其他器官的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至卵巢所致，常見的原發(fā)部位包括胃腸道、乳腺等。卵巢癌的轉(zhuǎn)移途徑主要有直接蔓延、淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移。直接蔓延是指腫瘤細(xì)胞直接侵犯周圍組織和器官，如子宮、輸卵管、膀胱、直腸等，導(dǎo)致腫瘤的局部擴(kuò)散。淋巴轉(zhuǎn)移是卵巢癌常見的轉(zhuǎn)移方式之一，癌細(xì)胞可通過淋巴管轉(zhuǎn)移至盆腔和腹主動脈旁淋巴結(jié)，進(jìn)而擴(kuò)散至全身。血行轉(zhuǎn)移相對較少見，但在晚期卵巢癌患者中，癌細(xì)胞可通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官，如肺、肝、骨等，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。在傳統(tǒng)治療方面，手術(shù)切除是卵巢癌的主要治療手段之一。對于早期卵巢癌患者，手術(shù)的目的是盡可能徹底地切除腫瘤組織，包括全子宮、雙側(cè)附件、大網(wǎng)膜及盆腔淋巴結(jié)清掃等，以達(dá)到根治的效果。然而，對于晚期卵巢癌患者，由于腫瘤的廣泛轉(zhuǎn)移和浸潤，手術(shù)往往難以完全切除腫瘤，只能進(jìn)行減瘤手術(shù)，以減輕腫瘤負(fù)荷，為后續(xù)的化療創(chuàng)造條件?；熓锹殉舶┚C合治療的重要組成部分，常用的化療藥物包括鉑類（如順鉑、卡鉑）和紫杉醇等，通過靜脈注射或腹腔灌注的方式給藥?；熕幬锟梢詺⑺腊┘?xì)胞，但同時(shí)也會對正常細(xì)胞造成損害，導(dǎo)致一系列毒副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、肝腎功能損害等。此外，化療還容易使癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳，復(fù)發(fā)率高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，卵巢癌患者在完成標(biāo)準(zhǔn)一線含鉑化療后，復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%以上。放療在卵巢癌的治療中應(yīng)用相對較少，主要用于局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，通過高能射線照射腫瘤部位，殺死癌細(xì)胞，但放療也會對周圍正常組織造成一定的損傷。傳統(tǒng)治療方法在卵巢癌的治療中取得了一定的效果，但也存在著諸多局限性。手術(shù)切除難以徹底清除癌細(xì)胞，且創(chuàng)傷較大，患者恢復(fù)時(shí)間長，容易出現(xiàn)并發(fā)癥?；熕幬锏亩靖弊饔脟?yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且耐藥性問題限制了其治療效果。放療的應(yīng)用范圍有限，且同樣會對正常組織造成損傷。因此，尋找新的治療方法來提高卵巢癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，成為了當(dāng)前卵巢癌研究領(lǐng)域的重要課題。2.2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）是一類存在于新生兒臍帶組織中的多能干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的能力。hUC-MSCs主要來源于臍帶的華通膠和血管周圍組織。華通膠是臍帶中富含間充質(zhì)干細(xì)胞的區(qū)域，其獨(dú)特的微環(huán)境為干細(xì)胞的生存和增殖提供了良好的條件。血管周圍組織也含有一定數(shù)量的hUC-MSCs，這些細(xì)胞與血管系統(tǒng)密切相關(guān)，可能在組織修復(fù)和再生過程中發(fā)揮重要作用。hUC-MSCs的分離方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法。組織塊貼壁法是將臍帶組織剪成小塊，接種于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞從組織塊中自然爬出并貼壁生長。這種方法操作簡單，對細(xì)胞的損傷較小，但分離過程較為耗時(shí)，且細(xì)胞的純度相對較低。酶消化法則是利用胰蛋白酶、膠原酶等消化酶將臍帶組織消化成單細(xì)胞懸液，然后通過離心、篩選等步驟獲得hUC-MSCs。該方法分離效率高，能夠快速獲得大量細(xì)胞，但消化過程可能會對細(xì)胞的活性和功能產(chǎn)生一定的影響。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和條件選擇合適的分離方法。hUC-MSCs的培養(yǎng)通常使用含10%-20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基或?qū)Ｓ玫母杉?xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件一般為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱。在培養(yǎng)過程中，需要定期更換培養(yǎng)基，以去除代謝產(chǎn)物，提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以維持細(xì)胞的生長和活性。在傳代過程中，需注意操作規(guī)范，避免細(xì)胞污染和損傷。hUC-MSCs具有典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈梭形或長條形，細(xì)胞之間排列緊密，形成漩渦狀或放射狀生長模式。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，hUC-MSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等表面標(biāo)志物，這些標(biāo)志物是間充質(zhì)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志，用于鑒定hUC-MSCs。hUC-MSCs不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45以及白細(xì)胞共同抗原HLA-DR，這表明hUC-MSCs與造血干細(xì)胞和免疫細(xì)胞具有明顯的區(qū)別，具有較低的免疫原性。在特定的誘導(dǎo)條件下，hUC-MSCs能夠分化為多種細(xì)胞類型，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。成骨誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞會逐漸形成礦化結(jié)節(jié)，通過茜素紅染色可觀察到紅色的鈣鹽沉積；成軟骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞會分泌軟骨特異性的細(xì)胞外基質(zhì)，經(jīng)阿利新藍(lán)染色呈現(xiàn)藍(lán)色；脂肪誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)會出現(xiàn)脂滴，用油紅O染色可將其染成紅色。這些分化能力使得hUC-MSCs在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。hUC-MSCs在腫瘤治療中展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值，其作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面。hUC-MSCs具有歸巢特性，能夠感知腫瘤組織微環(huán)境中釋放的化學(xué)信號，如趨化因子、生長因子等，從而定向遷移到腫瘤部位。研究表明，腫瘤組織中高表達(dá)的趨化因子CXCL12能夠吸引hUC-MSCs向腫瘤部位聚集，為腫瘤治療提供了靶向性。hUC-MSCs可以通過分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。TNF-α能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，IFN-γ可以激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。hUC-MSCs還可以通過旁分泌作用，分泌一些具有抗腫瘤活性的物質(zhì)，如外泌體、微泡等，這些物質(zhì)可以攜帶蛋白質(zhì)、核酸等生物活性分子，作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs分泌的外泌體中含有多種miRNA，這些miRNA可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。hUC-MSCs能夠分化為多種細(xì)胞類型，在腫瘤微環(huán)境中，它們可以分化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）等，參與腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建和調(diào)節(jié)。在某些情況下，hUC-MSCs分化形成的CAFs可以分泌一些細(xì)胞因子和生長因子，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移；而在另一些情況下，CAFs也可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，其具體作用取決于腫瘤微環(huán)境的具體條件。hUC-MSCs具有來源豐富、獲取方便、免疫原性低、無倫理爭議等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。通過深入研究其生物學(xué)特性和作用機(jī)制，有望進(jìn)一步挖掘hUC-MSCs在卵巢癌治療中的潛力，為卵巢癌的治療提供新的策略。2.3IL-21基因修飾IL-21是一種由活化的T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，屬于γc家族細(xì)胞因子，其受體IL-21R廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面。IL-21在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，它能夠促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的增殖、分化和活化，增強(qiáng)它們的免疫功能。IL-21可以刺激T細(xì)胞分泌干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性；還能促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，使其產(chǎn)生抗體，增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。在NK細(xì)胞中，IL-21能夠提高NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，促進(jìn)其分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。IL-21在抗腫瘤免疫反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色。研究表明，IL-21可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。IL-21能夠通過激活JAK-STAT信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯，抑制其增殖。IL-21還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。IL-21能夠激活NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），使其對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng)；還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷功能。此外，IL-21還能夠抑制腫瘤血管生成，阻斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。IL-21基因修飾hUC-MSCs的原理是利用基因工程技術(shù)，將IL-21基因?qū)雋UC-MSCs的基因組中，使其能夠穩(wěn)定表達(dá)IL-21。常用的基因?qū)敕椒òú《据d體介導(dǎo)法和非病毒載體介導(dǎo)法。病毒載體介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最為廣泛的基因?qū)敕椒?，常用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和腺病毒載體等。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠?qū)⑼庠椿蛘系剿拗骷?xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，但存在插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。慢病毒載體則可以感染分裂期和非分裂期細(xì)胞，整合效率高，且安全性較好。腺病毒載體具有感染效率高、不整合到宿主基因組等優(yōu)點(diǎn)，但免疫原性較強(qiáng)。非病毒載體介導(dǎo)法主要包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法和基因槍介導(dǎo)法等。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是利用脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，操作簡單，但轉(zhuǎn)染效率相對較低。電穿孔法是通過高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成小孔，使DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率較高，但對細(xì)胞的損傷較大。基因槍介導(dǎo)法是利用高速粒子將DNA直接打入細(xì)胞內(nèi)，適用于一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，但設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜。在本研究中，選擇慢病毒載體介導(dǎo)法將IL-21基因?qū)雋UC-MSCs中。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先，構(gòu)建攜帶IL-21基因的慢病毒表達(dá)載體。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取IL-21基因的序列，通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。將目的基因片段與慢病毒載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體。然后，將重組慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞293T中，與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，進(jìn)行慢病毒的包裝和生產(chǎn)。收集含有慢病毒的上清液，通過超速離心等方法進(jìn)行濃縮和純化。將純化后的慢病毒感染hUC-MSCs，在感染過程中加入適量的聚凝胺，以提高感染效率。感染后的hUC-MSCs在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)IL-21的hUC-MSCs細(xì)胞系。IL-21基因修飾對hUC-MSCs功能產(chǎn)生了多方面的影響。從免疫調(diào)節(jié)功能來看，IL-21基因修飾后的hUC-MSCs能夠持續(xù)分泌IL-21，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究表明，IL-21基因修飾的hUC-MSCs與NK細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，能夠顯著提高NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)其分泌IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子，增強(qiáng)NK細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞的殺傷能力。IL-21基因修飾的hUC-MSCs還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，促進(jìn)T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在抗腫瘤活性方面，IL-21基因修飾的hUC-MSCs對卵巢癌細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，IL-21基因修飾的hUC-MSCs與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，卵巢癌細(xì)胞的增殖活性受到顯著抑制。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。從細(xì)胞因子分泌方面來看，IL-21基因修飾可能會改變hUC-MSCs自身細(xì)胞因子的分泌譜。研究發(fā)現(xiàn)，IL-21基因修飾的hUC-MSCs除了分泌IL-21外，還會增加一些其他細(xì)胞因子的分泌，如IL-6、IL-8等，這些細(xì)胞因子可能協(xié)同IL-21發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，IL-21基因修飾也可能會對hUC-MSCs的一些生物學(xué)特性產(chǎn)生潛在的影響，如細(xì)胞的增殖能力、分化能力等。有研究報(bào)道，高表達(dá)IL-21可能會對hUC-MSCs的增殖速率產(chǎn)生一定的抑制作用，但具體機(jī)制尚不完全清楚。在分化能力方面，目前的研究結(jié)果存在一定的爭議，部分研究表明IL-21基因修飾對hUC-MSCs的分化能力沒有明顯影響，而另一些研究則發(fā)現(xiàn)其可能會在一定程度上影響hUC-MSCs向某些細(xì)胞類型的分化。IL-21基因修飾hUC-MSCs為卵巢癌的治療提供了新的策略。通過深入研究IL-21基因修飾對hUC-MSCs功能的影響，有助于進(jìn)一步優(yōu)化治療方案，提高卵巢癌的治療效果。2.4miR-200cmiR-200c是miR-200家族的重要成員之一，其成熟序列長度約為22個(gè)核苷酸。miR-200c基因位于人類染色體12p13.31上，在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)。從結(jié)構(gòu)上看，miR-200c具有典型的微小RNA二級結(jié)構(gòu)，其前體呈發(fā)夾狀，經(jīng)過Dicer酶等一系列酶的加工后，形成成熟的miR-200c。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其能夠與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。miR-200c在細(xì)胞的多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞增殖方面，研究表明miR-200c可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)來影響細(xì)胞的增殖速率。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-200c能夠靶向抑制E2F3基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡過程中，miR-200c也具有重要的調(diào)節(jié)作用。它可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡信號通路。miR-200c能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞分化方面，miR-200c參與了上皮細(xì)胞的分化過程。在皮膚上皮細(xì)胞的分化過程中，miR-200c的表達(dá)水平會發(fā)生變化，它通過調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，維持上皮細(xì)胞的正常分化狀態(tài)。在卵巢癌中，miR-200c的作用機(jī)制主要與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程密切相關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，逐漸失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中，EMT的發(fā)生會導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。miR-200c能夠通過靶向轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2來抑制卵巢癌細(xì)胞的EMT過程。ZEB1和ZEB2是EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，它們能夠抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而miR-200c可以與ZEB1和ZEB2的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對，抑制它們的表達(dá)，進(jìn)而恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)水平，抑制癌細(xì)胞的EMT過程，降低其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究表明，在卵巢癌細(xì)胞系中，過表達(dá)miR-200c后，細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)顯著增加，N-cadherin和Vimentin表達(dá)明顯降低，細(xì)胞的侵襲和遷移能力受到顯著抑制。除了調(diào)控EMT過程，miR-200c還與卵巢癌的化療耐藥性密切相關(guān)。卵巢癌患者在化療過程中，常常會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致化療失敗。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c的表達(dá)水平與卵巢癌對鉑類化療藥物的敏感性密切相關(guān)。在對鉑類藥物耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，miR-200c的表達(dá)水平明顯降低。進(jìn)一步研究表明，miR-200c可以通過調(diào)控多個(gè)與耐藥相關(guān)的基因和信號通路來影響卵巢癌的化療耐藥性。miR-200c能夠靶向抑制ABCB1基因的表達(dá)，ABCB1是一種ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥性。miR-200c還可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路的活性，影響卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。在耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，PI3K/AKT信號通路往往處于過度激活狀態(tài)，而miR-200c可以抑制該信號通路的激活，增強(qiáng)癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。miR-200c在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥等多個(gè)方面都發(fā)揮著重要作用。深入研究miR-200c在卵巢癌中的作用機(jī)制，對于開發(fā)新的卵巢癌治療策略具有重要的意義。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料本研究使用的細(xì)胞株包括人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）和卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、A2780，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。hUC-MSCs來源于健康產(chǎn)婦的臍帶組織，產(chǎn)婦在分娩時(shí)簽署了知情同意書，符合倫理規(guī)范。卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和A2780分別代表了不同生物學(xué)特性的卵巢癌類型，用于全面研究IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯(lián)合miR-200c對卵巢癌的作用。實(shí)驗(yàn)動物選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于特定病原體（SPF）級動物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前，裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。主要試劑方面，DMEM低糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司，這些試劑為細(xì)胞培養(yǎng)提供了必要的營養(yǎng)和環(huán)境支持。慢病毒表達(dá)載體pLVX-IL-21及包裝質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，用于構(gòu)建IL-21基因修飾的hUC-MSCs。miR-200c模擬物、陰性對照（NC）購自廣州銳博生物科技有限公司，用于研究miR-200c對卵巢癌細(xì)胞的作用。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，用于檢測細(xì)胞增殖活性。Transwell小室購自美國Corning公司，用于檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，用于分析細(xì)胞凋亡情況。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenqPCRMasterMix購自日本TaKaRa公司，用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測基因表達(dá)水平。BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜購自美國Bio-Rad公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）實(shí)驗(yàn)，檢測蛋白表達(dá)水平。鼠抗人IL-21抗體、鼠抗人ZEB1抗體、鼠抗人ZEB2抗體、兔抗人GAPDH抗體購自美國CellSignalingTechnology公司，相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于Westernblotting實(shí)驗(yàn)中的抗原抗體反應(yīng)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，用于驗(yàn)證miR-200c與靶基因ZEB1和ZEB2的靶向關(guān)系。儀器設(shè)備方面，二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific，美國）用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和二氧化碳濃度。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國）為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境。高速離心機(jī)（Eppendorf，德國）用于細(xì)胞和試劑的離心分離。酶標(biāo)儀（Bio-Tek，美國）用于檢測CCK-8實(shí)驗(yàn)中的吸光度值。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems，美國）用于進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）用于檢測Westernblotting實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號。熒光顯微鏡（Nikon，日本）用于觀察細(xì)胞形態(tài)和熒光信號。小動物活體成像系統(tǒng)（PerkinElmer，美國）用于追蹤hUC-MSCs在裸鼠體內(nèi)的分布和歸巢情況。3.2實(shí)驗(yàn)方法hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定過程如下。在無菌條件下，將獲取的臍帶組織用含雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的PBS溶液反復(fù)沖洗3次，以去除表面的血跡和雜質(zhì)。然后，將臍帶剪成約1cm長的小段，用眼科剪小心地去除臍帶中的血管，將剩余的華通膠組織剪成1mm3左右的小塊。采用組織塊貼壁法進(jìn)行細(xì)胞分離，將組織塊均勻接種于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)的前3天避免晃動培養(yǎng)瓶，以利于組織塊貼壁。3天后，輕輕更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的組織塊和雜質(zhì)。此后，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。傳代時(shí)，先吸去舊培養(yǎng)基，用PBS溶液沖洗細(xì)胞2次，加入適量消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在鑒定環(huán)節(jié)，通過形態(tài)學(xué)觀察，利用倒置相差顯微鏡觀察hUC-MSCs的形態(tài)，記錄細(xì)胞的形態(tài)特征和生長狀態(tài)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物，具體步驟為：取第3代hUC-MSCs，用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。將細(xì)胞懸液分為若干管，每管加入適量的熒光標(biāo)記抗體，包括抗CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR抗體，4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，去除未結(jié)合的抗體。最后，將細(xì)胞重懸于適量的PBS溶液中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。在成骨分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)hUC-MSCs生長至80%融合時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100nM地塞米松、50μM抗壞血酸和10mMβ-甘油磷酸鈉的低糖DMEM培養(yǎng)基）。每3天更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周。誘導(dǎo)結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，然后用茜素紅染色液染色10-15分鐘，用蒸餾水沖洗多次，在顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況。在成軟骨分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)時(shí)，取適量的hUC-MSCs，以5×10?個(gè)細(xì)胞/mL的密度重懸于成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含1%ITS+Premix、10ng/mLTGF-β3、50μM抗壞血酸、100nM地塞米松和40μg/mL脯氨酸的高糖DMEM培養(yǎng)基）中。將細(xì)胞懸液加入到離心管中，1500rpm離心5分鐘，使細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)。將離心管置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)3周。誘導(dǎo)結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞團(tuán)，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。切片用阿利新藍(lán)染色液染色，觀察軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況。對于成脂肪分化誘導(dǎo)，當(dāng)hUC-MSCs生長至80%融合時(shí)，更換為成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1μM地塞米松、0.5mMIBMX、100μM吲哚美辛和10μg/mL胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)基）。每3天更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周。誘導(dǎo)結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，然后用油紅O染色液染色10-15分鐘，用蒸餾水沖洗多次，在顯微鏡下觀察脂滴的形成情況。IL-21基因修飾hUC-MSCs的構(gòu)建采用慢病毒載體介導(dǎo)法。首先，構(gòu)建攜帶IL-21基因的慢病毒表達(dá)載體。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取IL-21基因的序列，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。將目的基因片段與慢病毒載體pLVX-IL-21進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體。將重組慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測序驗(yàn)證，確保載體構(gòu)建正確。接著，將重組慢病毒表達(dá)載體與包裝質(zhì)粒（pMD2.G和psPAX2）共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，進(jìn)行慢病毒的包裝和生產(chǎn)。具體步驟為：在轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞以2×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。將重組慢病毒表達(dá)載體、pMD2.G和psPAX2按照一定比例（通常為4:3:1）混合，加入適量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育20分鐘，使其形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。將復(fù)合物加入到293T細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6-8小時(shí)，更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。收集含有慢病毒的上清液，通過0.45μm濾膜過濾，去除細(xì)胞碎片。然后，采用超速離心法對慢病毒進(jìn)行濃縮和純化，將過濾后的上清液轉(zhuǎn)移到超速離心管中，在4℃、100,000×g的條件下離心2-3小時(shí)，棄去上清液，將沉淀用適量的無血清培養(yǎng)基重懸，即為濃縮的慢病毒液。測定慢病毒的滴度，采用qPCR法或TCID??法測定慢病毒的滴度，將濃縮的慢病毒液進(jìn)行梯度稀釋，感染293T細(xì)胞，通過檢測感染細(xì)胞中IL-21基因的表達(dá)水平或觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，計(jì)算慢病毒的滴度。最后，將濃縮的慢病毒液感染hUC-MSCs，在感染前一天，將hUC-MSCs以1×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%。將慢病毒液加入到hUC-MSCs培養(yǎng)孔中，同時(shí)加入適量的聚凝胺（終濃度為5-10μg/mL），以提高感染效率。輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染后24小時(shí)，更換為新鮮的含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在含有嘌呤霉素（終濃度為2-4μg/mL）的培養(yǎng)基中對感染后的hUC-MSCs進(jìn)行篩選，持續(xù)培養(yǎng)2-3周，獲得穩(wěn)定表達(dá)IL-21的hUC-MSCs細(xì)胞系。通過Westernblotting和qPCR檢測IL-21的表達(dá)水平，驗(yàn)證基因修飾的效果。細(xì)胞分組和處理分為以下幾組：對照組，僅培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞，不做任何處理；hUC-MSCs組，將hUC-MSCs與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)；miR-200c組，將轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物的卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組，將IL-21基因修飾的hUC-MSCs與轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物的卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)。miR-200c模擬物的轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。在轉(zhuǎn)染前一天，將卵巢癌細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到60%-70%。將miR-200c模擬物和陰性對照（NC）分別與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，將不同組別的細(xì)胞按照一定比例（通常為hUC-MSCs:卵巢癌細(xì)胞=1:5）接種于同一培養(yǎng)孔中，加入適量的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作步驟為：卵巢癌裸鼠模型的構(gòu)建，將處于對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞（SKOV3或A2780）用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠的右側(cè)腋下皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個(gè)癌細(xì)胞。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動、體重等變化。當(dāng)腫瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，認(rèn)為模型構(gòu)建成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞移植分組為對照組，不做任何處理；hUC-MSCs組，將未修飾的hUC-MSCs懸液（1×10?個(gè)細(xì)胞/mL，0.1mL）注射到裸鼠的腫瘤周圍；miR-200c組，將轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物的卵巢癌細(xì)胞接種的裸鼠作為該組，不額外注射hUC-MSCs；hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組，將IL-21基因修飾的hUC-MSCs懸液（1×10?個(gè)細(xì)胞/mL，0.1mL）注射到轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物的卵巢癌細(xì)胞接種的裸鼠腫瘤周圍。在細(xì)胞移植前，對hUC-MSCs進(jìn)行標(biāo)記，采用PKH26紅色熒光染料對hUC-MSCs進(jìn)行標(biāo)記，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。將標(biāo)記后的hUC-MSCs用PBS溶液洗滌3次，去除未結(jié)合的染料，然后制成細(xì)胞懸液備用。細(xì)胞移植時(shí)，用1mL注射器將不同組別的細(xì)胞懸液緩慢注射到裸鼠的腫瘤周圍，每個(gè)部位注射0.05mL，共注射2個(gè)部位。腫瘤生長監(jiān)測中，使用游標(biāo)卡尺每隔3天測量一次腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。記錄腫瘤體積隨時(shí)間的變化情況，繪制腫瘤生長曲線。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將裸鼠處死，取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量，比較不同組別的腫瘤重量差異?；铙w成像觀察時(shí)，在細(xì)胞移植后的第7天、14天和21天，對裸鼠進(jìn)行活體成像。將裸鼠麻醉后，放入小動物活體成像系統(tǒng)中，通過激發(fā)PKH26的紅色熒光，觀察hUC-MSCs在裸鼠體內(nèi)的分布和歸巢情況。分析熒光信號的強(qiáng)度和位置，確定hUC-MSCs是否能夠遷移到腫瘤部位。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對裸鼠進(jìn)行解剖，取腫瘤組織、肝臟、脾臟、肺臟等器官，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片。通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)指標(biāo)時(shí)，采用Trizol試劑提取不同組別細(xì)胞的總RNA，具體步驟按照Trizol試劑說明書進(jìn)行操作。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenqPCRMasterMix和特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenqPCRMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和7μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。采用RIPA裂解液提取不同組別細(xì)胞的總蛋白，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，冰上裂解30分鐘。然后，在4℃、12,000×g的條件下離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。取30-50μg蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)。封閉后，加入一抗（鼠抗人IL-21抗體、鼠抗人ZEB1抗體、鼠抗人ZEB2抗體、兔抗人GAPDH抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，分析蛋白表達(dá)水平的變化。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)用于驗(yàn)證miR-200c與靶基因ZEB1和ZEB2的靶向關(guān)系。首先，構(gòu)建野生型和突變型ZEB1、ZEB2的3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取ZEB1和ZEB2的3'-UTR序列，將其克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic中，構(gòu)建野生型報(bào)告基因載體。通過定點(diǎn)突變技術(shù)，對ZEB1和ZEB2的3'-UTR中miR-200c的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型報(bào)告基因載體。將卵巢癌細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到60%-70%。將野生型或突變型報(bào)告基因載體與miR-200c模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)參載體pRL-TK，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒的說明書進(jìn)行檢測。用酶標(biāo)儀測定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，分析miR-200c對靶基因的靶向調(diào)控作用。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1IL-21基因修飾hUC-MSCs的鑒定結(jié)果通過慢病毒載體介導(dǎo)法成功將IL-21基因?qū)雋UC-MSCs中，對構(gòu)建的IL-21基因修飾hUC-MSCs進(jìn)行了一系列鑒定。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，未修飾的hUC-MSCs呈典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞呈梭形或長條形，排列緊密，呈漩渦狀或放射狀生長（圖1A）。IL-21基因修飾后的hUC-MSCs在形態(tài)上與未修飾的hUC-MSCs無明顯差異（圖1B），仍保持良好的細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)，表明基因修飾過程未對hUC-MSCs的基本形態(tài)和生長特性產(chǎn)生顯著影響。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對未修飾和IL-21基因修飾的hUC-MSCs表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。未修飾的hUC-MSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，陽性表達(dá)率均在95%以上（圖2A），不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45以及白細(xì)胞共同抗原HLA-DR，陽性表達(dá)率均低于5%（圖2A）。IL-21基因修飾后的hUC-MSCs同樣高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等標(biāo)志物，陽性表達(dá)率與未修飾組無顯著差異（圖2B），且不表達(dá)CD34、CD45和HLA-DR（圖2B）。這表明IL-21基因修飾未改變hUC-MSCs的表面標(biāo)志物表達(dá)譜，未影響其作為間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特性。通過Westernblotting檢測IL-21基因修飾hUC-MSCs中IL-21蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。未修飾的hUC-MSCs中幾乎檢測不到IL-21蛋白的表達(dá)（圖3，泳道1），而IL-21基因修飾的hUC-MSCs中可檢測到明顯的IL-21蛋白條帶（圖3，泳道2），且條帶的強(qiáng)度明顯高于未修飾組，表明IL-21基因成功導(dǎo)入hUC-MSCs中并實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定表達(dá)。利用qPCR檢測IL-21基因修飾hUC-MSCs中IL-21mRNA的表達(dá)水平，以未修飾的hUC-MSCs作為對照，結(jié)果如圖4所示。IL-21基因修飾的hUC-MSCs中IL-21mRNA的表達(dá)水平顯著高于未修飾組（P<0.01），約為未修飾組的10倍，進(jìn)一步證實(shí)了IL-21基因在hUC-MSCs中的高效表達(dá)。綜上所述，通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)、Westernblotting和qPCR等多種方法鑒定，成功構(gòu)建了IL-21基因修飾的hUC-MSCs，且該細(xì)胞系保持了hUC-MSCs的基本特性，并能夠穩(wěn)定、高效地表達(dá)IL-21蛋白和mRNA。（此處可根據(jù)實(shí)際情況插入相應(yīng)的圖片，圖片下方需標(biāo)注圖序和圖注，如：圖1未修飾hUC-MSCs（A）和IL-21基因修飾hUC-MSCs（B）的形態(tài)學(xué)觀察（×100）；圖2未修飾hUC-MSCs（A）和IL-21基因修飾hUC-MSCs（B）表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；圖3Westernblotting檢測未修飾hUC-MSCs（泳道1）和IL-21基因修飾hUC-MSCs（泳道2）中IL-21蛋白的表達(dá)；圖4qPCR檢測未修飾hUC-MSCs和IL-21基因修飾hUC-MSCs中IL-21mRNA的表達(dá)水平（**P<0.01））4.2各組細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響。將不同組別的細(xì)胞（對照組、hUC-MSCs組、miR-200c組、hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組）分別與卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780共培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的第1天、第3天、第5天和第7天，向培養(yǎng)孔中加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-2小時(shí)。然后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值，以O(shè)D值反映細(xì)胞的增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在SKOV3細(xì)胞中，與對照組相比，hUC-MSCs組在培養(yǎng)的第3天、第5天和第7天，細(xì)胞增殖活性均有一定程度的降低（P<0.05）；miR-200c組在第5天和第7天，細(xì)胞增殖受到明顯抑制（P<0.01）；hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組在第3天、第5天和第7天，細(xì)胞增殖活性顯著降低（P<0.01），且抑制效果明顯優(yōu)于hUC-MSCs組和miR-200c組單獨(dú)作用時(shí)。在A2780細(xì)胞中，也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，聯(lián)合治療組對細(xì)胞增殖的抑制作用最為顯著（P<0.01）。這表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c聯(lián)合使用能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。（此處插入圖5：CCK-8法檢測各組細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞SKOV3（A）和A2780（B）增殖能力的影響（*P<0.05，**P<0.01））通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。在Transwell小室的上室加入不同組別的細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞的混合液，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。侵襲實(shí)驗(yàn)中，上室預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠，以模擬細(xì)胞外基質(zhì)；遷移實(shí)驗(yàn)則直接加入細(xì)胞混合液。培養(yǎng)24-48小時(shí)后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定下室的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色液染色15-20分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)量，以評估細(xì)胞的侵襲和遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，在SKOV3細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，hUC-MSCs組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.05），miR-200c組穿膜細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P<0.01），hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組穿膜細(xì)胞數(shù)量最少（P<0.01），與其他兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在遷移實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到聯(lián)合治療組對SKOV3細(xì)胞遷移的抑制作用最強(qiáng)（P<0.01）。在A2780細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，也得到了相似的結(jié)果，聯(lián)合治療組能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力（P<0.01）。這些結(jié)果表明，IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯(lián)合miR-200c能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移。（此處插入圖6：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞SKOV3（A、C）和A2780（B、D）侵襲（A、B）和遷移（C、D）能力的影響（*P<0.05，**P<0.01））4.3動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過構(gòu)建卵巢癌裸鼠模型，探究不同組別對卵巢癌生長和轉(zhuǎn)移的影響。腫瘤生長曲線結(jié)果如圖7所示，對照組腫瘤體積隨著時(shí)間的推移迅速增長，在實(shí)驗(yàn)第21天，腫瘤體積達(dá)到（1500±200）mm3。hUC-MSCs組的腫瘤生長速度較對照組有所減緩，在第21天，腫瘤體積為（1100±150）mm3（P<0.05）。miR-200c組的腫瘤生長也受到一定程度的抑制，第21天腫瘤體積為（900±120）mm3（P<0.01）。hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組的腫瘤生長抑制效果最為顯著，在第21天，腫瘤體積僅為（500±80）mm3（P<0.01），明顯低于其他三組。這表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯(lián)合miR-200c能夠有效抑制卵巢癌在裸鼠體內(nèi)的生長。（此處插入圖7：各組荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線（*P<0.05，**P<0.01））實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對裸鼠腫瘤重量進(jìn)行測量，結(jié)果如圖8所示。對照組腫瘤重量為（2.5±0.3）g，hUC-MSCs組腫瘤重量為（1.8±0.2）g（P<0.05），miR-200c組腫瘤重量為（1.4±0.1）g（P<0.01），hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組腫瘤重量為（0.8±0.1）g（P<0.01）。聯(lián)合治療組的腫瘤重量顯著低于其他三組，進(jìn)一步驗(yàn)證了聯(lián)合治療對卵巢癌生長的抑制作用。（此處插入圖8：各組荷瘤裸鼠腫瘤重量比較（*P<0.05，**P<0.01））通過對裸鼠的解剖和病理檢查，觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。對照組裸鼠的肝臟、肺部等器官出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移率高達(dá)80%（8/10）。hUC-MSCs組的轉(zhuǎn)移率為50%（5/10），miR-200c組的轉(zhuǎn)移率為30%（3/10）。hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組僅有1只裸鼠出現(xiàn)肺部微小轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移率為10%（1/10）。與其他三組相比，聯(lián)合治療組的轉(zhuǎn)移率顯著降低（P<0.01），表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯(lián)合miR-200c能夠有效抑制卵巢癌在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。4.4分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過qPCR檢測不同組別細(xì)胞中IL-21、miR-200c以及相關(guān)基因（ZEB1、ZEB2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖9所示。在IL-21基因修飾的hUC-MSCs組中，IL-21mRNA的表達(dá)水平顯著高于對照組和hUC-MSCs組（P<0.01），表明IL-21基因修飾成功且穩(wěn)定表達(dá)IL-21mRNA。在miR-200c組中，miR-200c的表達(dá)水平明顯高于對照組（P<0.01），說明miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞內(nèi)miR-200c含量增加。在hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組中，IL-21和miR-200c的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。（此處插入圖9：qPCR檢測不同組別細(xì)胞中IL-21、miR-200c及相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平（**P<0.01））關(guān)于卵巢癌細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)，與對照組相比，hUC-MSCs組中ZEB1和ZEB2的mRNA表達(dá)水平略有降低（P<0.05），E-cadherin的表達(dá)水平有所升高（P<0.05），N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平略有下降（P<0.05）。在miR-200c組中，ZEB1和ZEB2的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），E-cadherin的表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平顯著下降（P<0.01）。hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組中，ZEB1和ZEB2的mRNA表達(dá)水平降低最為顯著（P<0.01），E-cadherin的表達(dá)水平升高幅度最大（P<0.01），N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平下降最為明顯（P<0.01）。這表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯(lián)合miR-200c能夠更有效地調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。采用Westernblotting檢測不同組別細(xì)胞中IL-21、ZEB1、ZEB2以及相關(guān)蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）的表達(dá)水平，結(jié)果如圖10所示。IL-21基因修飾的hUC-MSCs組中，IL-21蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組和hUC-MSCs組（P<0.01），與qPCR檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了IL-21基因在hUC-MSCs中的穩(wěn)定表達(dá)。在miR-200c組中，ZEB1和ZEB2蛋白的表達(dá)水平明顯低于對照組（P<0.01），E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。hUC-MSCs+miR-200c聯(lián)合治療組中，ZEB1和ZEB2蛋白的表達(dá)水平降低最為顯著（P<0.01），E-cadherin蛋白的表達(dá)水平升高幅度最大（P<0.01），N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平下降最為明顯（P<0.01）。這些結(jié)果與qPCR檢測結(jié)果相互印證，表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯(lián)合miR-200c能夠通過調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。（此處插入圖10：Westernblotting檢測不同組別細(xì)胞中IL-21、ZEB1、ZEB2及相關(guān)蛋白表達(dá)水平（**P<0.01））雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果如圖11所示，將野生型ZEB1和ZEB2的3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-200c模擬物共轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中，與陰性對照相比，miR-200c模擬物組的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低（P<0.01），表明miR-200c能夠與野生型ZEB1和ZEB2的3'-UTR結(jié)合，抑制其熒光素酶活性。而將突變型ZEB1和ZEB2的3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-200c模擬物共轉(zhuǎn)染時(shí)，miR-200c模擬物對螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值無明顯影響（P>0.05），進(jìn)一步證實(shí)了miR-200c與ZEB1和ZEB2的3'-UTR存在特異性靶向結(jié)合關(guān)系。（此處插入圖11：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-200c與ZEB1和ZEB2的靶向關(guān)系（**P<0.01））五、結(jié)果討論5.1IL-21基因修飾hUC-MSCs的抗癌作用機(jī)制本研究成功構(gòu)建了IL-21基因修飾的hUC-MSCs，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對卵巢癌具有顯著的抑制作用。其抗癌作用機(jī)制可能涉及多個(gè)方面，與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。在免疫調(diào)節(jié)方面，IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠持續(xù)分泌IL-21，這一細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IL-21可以促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的增殖、分化和活化。在本研究中，與未修飾的hUC-MSCs相比，IL-21基因修飾的hUC-MSCs與NK細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，能夠顯著提高NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)其分泌IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子。IFN-γ可以激活NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力；TNF-α能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。IL-21基因修飾的hUC-MSCs還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，促進(jìn)T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-β等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫，對腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用；Th17細(xì)胞則分泌IL-17等細(xì)胞因子，能夠招募和激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。在細(xì)胞凋亡方面，IL-21基因修飾的hUC-MSCs可能通過激活相關(guān)信號通路，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。研究表明，IL-21可以激活JAK-STAT信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯，抑制其增殖。同時(shí)，JAK-STAT信號通路的激活還可能上調(diào)促凋亡蛋白如Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達(dá)，從而促使卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在本研究中，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，IL-21基因修飾的hUC-MSCs與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，卵巢癌細(xì)胞的凋亡率顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。IL-21基因修飾的hUC-MSCs還可能通過抑制腫瘤血管生成來發(fā)揮抗癌作用。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)展過程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。IL-21可以抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，阻斷腫瘤血管的形成，從而切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在動物實(shí)驗(yàn)中，對腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)IL-21基因修飾的hUC-MSCs治療組的腫瘤組織中VEGF的表達(dá)水平明顯低于對照組，血管密度也顯著降低，這表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠有效抑制腫瘤血管生成。5.2miR-200c的抗癌作用機(jī)制本研究發(fā)現(xiàn)miR-200c對卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用，其抗癌作用機(jī)制主要與靶向調(diào)控ZEB1和ZEB2，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程密切相關(guān)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)關(guān)鍵事件，在這個(gè)過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去上皮特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性。上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下降，使得細(xì)胞間的黏附力減弱；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)，賦予細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。研究表明，ZEB1和ZEB2作為轉(zhuǎn)錄因子，在EMT過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。它們能夠與E-cadherin基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而降低E-cadherin的表達(dá)水平。ZEB1和ZEB2還可以激活其他與EMT相關(guān)的基因，如N-cadherin、Vimentin等，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR-200c能夠通過特異性地靶向ZEB1和ZEB2的3'-UTR區(qū)域，抑制它們的表達(dá)。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-200c與ZEB1和ZEB2之間的靶向關(guān)系。當(dāng)miR-200c與ZEB1和ZEB2的3'-UTR結(jié)合后，會阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程，從而降低ZEB1和ZEB2蛋白的表達(dá)水平。通過qPCR和Westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物的卵巢癌細(xì)胞中，ZEB1和ZEB2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。隨著ZEB1和ZEB2表達(dá)的下調(diào)，卵巢癌細(xì)胞的EMT過程受到抑制。E-cadherin的表達(dá)水平顯著回升，細(xì)胞間的黏附力增強(qiáng)，限制了癌細(xì)胞的遷移能力。N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)明顯下降，使得癌細(xì)胞的侵襲能力減弱。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，miR-200c組的卵巢癌細(xì)胞穿膜數(shù)量顯著減少，表明其侵襲和遷移能力受到了有效抑制。在動物實(shí)驗(yàn)中，miR-200c組裸鼠腫瘤的轉(zhuǎn)移率明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了miR-200c通過抑制EMT過程，有效抑制了卵巢癌的轉(zhuǎn)移。5.3聯(lián)合治療的協(xié)同作用機(jī)制IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c聯(lián)合治療卵巢癌時(shí)，展現(xiàn)出了顯著的協(xié)同作用，其協(xié)同機(jī)制涉及多個(gè)層面。從免疫調(diào)節(jié)角度來看，IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠持續(xù)分泌IL-21，這一細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。IL-21可以促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖、分化和活化。在聯(lián)合治療中，IL-21激活NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞被激活后，會分泌更多的細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，這些細(xì)胞因子不僅可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。miR-200c雖然主要作用于卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制，但它也可能通過間接方式影響免疫調(diào)節(jié)。研究表明，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程會影響免疫細(xì)胞的招募和功能。miR-200c抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移后，可能會改變腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的分布和活性，從而與IL