MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)驅(qū)動(dòng)結(jié)直腸癌演進(jìn)的機(jī)制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)直腸癌（ColorectalCancer,CRC）是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)193萬(wàn)，死亡病例數(shù)達(dá)94萬(wàn)，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第三位和第二位。在中國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率也不容小覷，且近年來(lái)呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)。結(jié)直腸癌嚴(yán)重威脅著人類的健康和生活質(zhì)量。早期結(jié)直腸癌患者常無(wú)明顯癥狀，隨著病情的進(jìn)展，可出現(xiàn)便血、腹痛、排便習(xí)慣改變、腸梗阻等癥狀，給患者帶來(lái)極大的痛苦。此外，結(jié)直腸癌的治療過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)用高昂，不僅給患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也對(duì)社會(huì)醫(yī)療資源造成了巨大的壓力。因此，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。腫瘤代謝重編程是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一，它為腫瘤細(xì)胞的快速增殖、存活和轉(zhuǎn)移提供了必要的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞在代謝過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列的改變，包括葡萄糖代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝等，以適應(yīng)其快速生長(zhǎng)和增殖的需求。其中，還原型輔酶Ⅱ（NicotinamideAdenineDinucleotidePhosphate,NADPH）作為細(xì)胞內(nèi)重要的還原當(dāng)量，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、生物合成和抗氧化防御等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NADPH穩(wěn)態(tài)的失衡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此，深入研究腫瘤細(xì)胞中NADPH代謝的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的治療策略具有重要的理論意義。亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（MethylenetetrahydrofolateDehydrogenase2,MTHFD2）是線粒體一碳代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)，且與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。MTHFD2能夠催化亞甲基四氫葉酸（CH2-THF）轉(zhuǎn)化為甲?；臍淙~酸（10-CHO-THF），同時(shí)將氧化型輔酶Ⅱ（NADP+）還原為NADPH，為腫瘤細(xì)胞提供了重要的還原當(dāng)量，參與維持腫瘤細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)和生物合成過(guò)程。已有研究表明，MTHFD2在多種腫瘤中發(fā)揮著促癌作用，然而，其在結(jié)直腸癌中調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)的具體作用及分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。本研究旨在探討MTHFD2在結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中對(duì)NADPH穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用及分子機(jī)制，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。通過(guò)深入研究MTHFD2與結(jié)直腸癌的關(guān)系，有望揭示結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為開(kāi)發(fā)更加有效的治療策略提供理論支持，從而提高結(jié)直腸癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，癌癥代謝領(lǐng)域一直是研究熱點(diǎn)，眾多頂尖科研團(tuán)隊(duì)對(duì)MTHFD2及NADPH穩(wěn)態(tài)與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行了深入探索。美國(guó)哈佛大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在癌細(xì)胞代謝機(jī)制研究方面處于前沿地位，他們通過(guò)先進(jìn)的單細(xì)胞分析技術(shù)和代謝組學(xué)手段，揭示了腫瘤細(xì)胞代謝的高度異質(zhì)性，為理解MTHFD2在腫瘤細(xì)胞中的特異性功能提供了重要的技術(shù)思路和理論基礎(chǔ)。此外，一些研究已表明MTHFD2在多種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，且敲低MTHFD2可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，初步揭示了MTHFD2在腫瘤代謝中的關(guān)鍵作用，但對(duì)于其在結(jié)直腸癌中調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)的具體分子機(jī)制，仍缺乏系統(tǒng)性研究。在國(guó)內(nèi)，中山大學(xué)腫瘤防治中心的徐瑞華教授團(tuán)隊(duì)在消化系統(tǒng)腫瘤代謝研究方面成果顯著。2018年，該團(tuán)隊(duì)在國(guó)際著名腫瘤學(xué)雜志JNCI發(fā)表論文，證實(shí)了葉酸代謝通路中的亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（MTHFD2）是維持結(jié)直腸癌還原型輔酶Ⅱ（NADPH）穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因。他們通過(guò)分析結(jié)直腸癌組織中生成NADPH的所有基因的表達(dá)情況，首次揭示了MTHFD2在維持結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)的NADPH穩(wěn)態(tài)及防御活性氧損傷、促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用及調(diào)控機(jī)制，同時(shí)通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明MTHFD2可作為結(jié)直腸癌新的預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)，其抑制劑具有潛在的藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值。然而，目前對(duì)于MTHFD2在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中對(duì)NADPH穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用，以及MTHFD2與其他代謝途徑或信號(hào)通路在維持NADPH穩(wěn)態(tài)方面的交互作用，仍有待進(jìn)一步深入研究。總體而言，雖然目前對(duì)于MTHFD2與腫瘤的關(guān)系已有一定的研究基礎(chǔ)，但在結(jié)直腸癌領(lǐng)域，尤其是MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制方面，仍存在許多研究空白。深入探討這些問(wèn)題，將有助于揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討MTHFD2在調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)方面的作用機(jī)制，以及其對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的影響，為結(jié)直腸癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：MTHFD2在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)及臨床意義分析：收集結(jié)直腸癌患者的組織標(biāo)本及臨床資料，運(yùn)用免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，檢測(cè)MTHFD2在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征（如腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等）及預(yù)后的相關(guān)性。同時(shí)，選取多種結(jié)直腸癌細(xì)胞系，檢測(cè)MTHFD2的表達(dá)情況，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞模型。MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響：通過(guò)RNA干擾技術(shù)構(gòu)建MTHFD2低表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)）、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)）和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)），分別檢測(cè)MTHFD2表達(dá)下調(diào)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。此外，構(gòu)建MTHFD2過(guò)表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，進(jìn)行上述反向?qū)嶒?yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制研究：采用代謝組學(xué)技術(shù)，檢測(cè)MTHFD2表達(dá)改變后結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)NADPH及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的水平變化，明確MTHFD2對(duì)NADPH穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用。通過(guò)酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，分析MTHFD2的脫氫酶活性和環(huán)水解酶活性對(duì)NADPH生成的影響。利用免疫共沉淀、熒光素酶報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，篩選并驗(yàn)證與MTHFD2相互作用的蛋白或分子，探究它們?cè)谡{(diào)控MTHFD2活性及NADPH穩(wěn)態(tài)中的作用機(jī)制。此外，還將研究MTHFD2是否通過(guò)影響其他代謝途徑（如磷酸戊糖途徑、脂肪酸合成途徑等）來(lái)間接調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)。MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制：在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建結(jié)直腸癌小鼠模型，通過(guò)尾靜脈注射或原位移植的方式，將MTHFD2表達(dá)改變的結(jié)直腸癌細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移情況，并檢測(cè)腫瘤組織中NADPH水平、氧化應(yīng)激指標(biāo)（如ROS水平、MDA含量、SOD活性等）以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中，利用過(guò)氧化氫等氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，模擬腫瘤微環(huán)境中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，研究MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下存活、增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響，深入探討MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制?；贛THFD2的潛在治療策略探索：根據(jù)上述研究結(jié)果，篩選或設(shè)計(jì)針對(duì)MTHFD2的小分子抑制劑或靶向藥物，并對(duì)其進(jìn)行活性和安全性評(píng)價(jià)。在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型中，驗(yàn)證這些抑制劑或靶向藥物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，探討其作為結(jié)直腸癌潛在治療藥物的可行性，為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的策略和思路。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法臨床樣本收集與分析：收集結(jié)直腸癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，同時(shí)收集患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等。運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)MTHFD2在組織標(biāo)本中的表達(dá)水平及定位情況，通過(guò)分析其表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，初步探討MTHFD2在結(jié)直腸癌中的臨床意義。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選取多種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系，如HCT116、SW480、HT29等，采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建MTHFD2低表達(dá)的細(xì)胞系，通過(guò)轉(zhuǎn)染MTHFD2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建MTHFD2高表達(dá)的細(xì)胞系。利用CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力；采用代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NADPH及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的水平變化；運(yùn)用酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分析MTHFD2的脫氫酶活性和環(huán)水解酶活性；利用免疫共沉淀、熒光素酶報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)技術(shù)篩選并驗(yàn)證與MTHFD2相互作用的蛋白或分子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建結(jié)直腸癌小鼠模型，如通過(guò)皮下注射或原位移植結(jié)直腸癌細(xì)胞建立荷瘤小鼠模型。將MTHFD2表達(dá)改變的結(jié)直腸癌細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，定期測(cè)量腫瘤體積和重量。通過(guò)尾靜脈注射的方式觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，觀察肺、肝等遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量及大小。檢測(cè)腫瘤組織中NADPH水平、氧化應(yīng)激指標(biāo)（如ROS水平、MDA含量、SOD活性等）以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，探究MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制。生物信息學(xué)分析：利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如TCGA（TheCancerGenomeAtlas）、GEO（GeneExpressionOmnibus）等，下載結(jié)直腸癌相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、臨床數(shù)據(jù)等。運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，如差異表達(dá)分析、生存分析、基因富集分析等，進(jìn)一步驗(yàn)證MTHFD2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的相關(guān)性，挖掘MTHFD2可能參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，為實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線流程如下（見(jiàn)圖1）：收集結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本及臨床資料，進(jìn)行免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)MTHFD2在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性；同時(shí)選取結(jié)直腸癌細(xì)胞系，檢測(cè)MTHFD2表達(dá)情況。構(gòu)建MTHFD2低表達(dá)和過(guò)表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，進(jìn)行細(xì)胞增殖、遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。采用代謝組學(xué)技術(shù)、酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀、熒光素酶報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)，研究MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。構(gòu)建結(jié)直腸癌小鼠模型，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移情況，檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)指標(biāo)，研究MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制。根據(jù)上述研究結(jié)果，篩選或設(shè)計(jì)針對(duì)MTHFD2的小分子抑制劑或靶向藥物，在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型中驗(yàn)證其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用。綜合各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的作用及調(diào)控機(jī)制，探討基于MTHFD2的潛在治療策略。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1：研究技術(shù)路線圖二、MTHFD2與NADPH穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)基礎(chǔ)2.1MTHFD2的分子結(jié)構(gòu)與功能MTHFD2基因在人類中定位于2p13.1染色體，基因全長(zhǎng)16736bp，包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。其編碼的MTHFD2蛋白由350個(gè)氨基酸構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約為37kD，以二聚體的形式發(fā)揮生物學(xué)功能。MTHFD2蛋白具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過(guò)X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，它由兩個(gè)長(zhǎng)α螺旋連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，在兩結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)由小的D2螺旋形成的大縫隙，這個(gè)大縫隙便是配體的結(jié)合位點(diǎn)，可結(jié)合的配體包括NAD+、無(wú)機(jī)磷酸鹽和LY345899等。這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了MTHFD2蛋白獨(dú)特的功能特性。MTHFD2主要定位于線粒體，在線粒體一碳代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它具有亞甲基四氫葉酸脫氫酶和甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶的雙重酶活性，能夠催化亞甲基四氫葉酸（CH2-THF）氧化為10-甲?；臍淙~酸（10-CHO-THF），這一過(guò)程涉及到一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)。在反應(yīng)過(guò)程中，MTHFD2利用其脫氫酶活性，以NAD+為輔酶，將CH2-THF上的氫原子轉(zhuǎn)移給NAD+，使其還原為NADH，同時(shí)CH2-THF被氧化為相應(yīng)的亞胺中間體；隨后，利用環(huán)水解酶活性，該亞胺中間體發(fā)生水解反應(yīng)，生成10-CHO-THF。這一反應(yīng)不僅為核苷酸合成和其他甲基化反應(yīng)提供了重要的一碳單位，還參與了細(xì)胞內(nèi)的能量代謝和物質(zhì)合成過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義。在葉酸代謝通路中，MTHFD2處于核心地位，其催化的反應(yīng)是葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。葉酸進(jìn)入細(xì)胞后，首先被還原為四氫葉酸（THF），THF在一系列酶的作用下，與不同的一碳單位結(jié)合，形成多種形式的一碳單位載體，如CH2-THF、10-CHO-THF等。MTHFD2催化CH2-THF轉(zhuǎn)化為10-CHO-THF，使得一碳單位能夠以合適的形式參與到嘌呤、胸腺嘧啶等生物分子的合成過(guò)程中。嘌呤合成過(guò)程中，10-CHO-THF提供的一碳單位參與了嘌呤環(huán)的構(gòu)建，是嘌呤合成不可或缺的原料；胸腺嘧啶合成過(guò)程中，一碳單位也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過(guò)一系列的反應(yīng)最終形成胸腺嘧啶，為DNA的合成提供了重要的組成部分。MTHFD2還與其他葉酸代謝相關(guān)酶協(xié)同作用，共同維持葉酸代謝通路的平衡和穩(wěn)定。如果MTHFD2的功能出現(xiàn)異常，將導(dǎo)致葉酸代謝紊亂，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖，甚至引發(fā)疾病。2.2NADPH穩(wěn)態(tài)的維持機(jī)制NADPH作為細(xì)胞內(nèi)重要的輔酶，在維持細(xì)胞的正常生理功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它不僅參與了脂肪酸、膽固醇等生物分子的合成過(guò)程，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)，還在細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)中扮演著不可或缺的角色，幫助細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的損傷。細(xì)胞內(nèi)NADPH的穩(wěn)態(tài)維持是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，涉及多種代謝途徑和關(guān)鍵酶的協(xié)同作用。磷酸戊糖途徑（PentosePhosphatePathway,PPP）是細(xì)胞生成NADPH的主要代謝途徑之一，約占細(xì)胞內(nèi)NADPH生成量的60%。該途徑從6-磷酸葡萄糖（G-6-P）開(kāi)始，在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，可分為氧化階段和非氧化階段。在氧化階段，G-6-P在6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）的催化下，脫氫生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)將NADP+還原為NADPH；6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯在內(nèi)酯酶的作用下水解為6-磷酸葡萄糖酸，后者在6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的催化下再次脫氫并脫羧，生成5-磷酸核酮糖，同時(shí)又生成一分子NADPH和二氧化碳。這兩步脫氫反應(yīng)是磷酸戊糖途徑的限速步驟，G6PD是該途徑的關(guān)鍵限速酶，其活性受到NADPH/NADP+比值的嚴(yán)格調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NADPH含量較高時(shí)，NADPH會(huì)反饋抑制G6PD的活性，使磷酸戊糖途徑的流量減少；反之，當(dāng)NADPH需求增加，NADP+濃度升高時(shí)，G6PD活性增強(qiáng)，途徑加速進(jìn)行。在非氧化階段，5-磷酸核酮糖經(jīng)過(guò)一系列轉(zhuǎn)酮基及轉(zhuǎn)醛基反應(yīng)，生成3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖，這些中間產(chǎn)物可重新進(jìn)入糖酵解途徑進(jìn)行代謝，實(shí)現(xiàn)了磷酸戊糖途徑與糖酵解途徑的相互聯(lián)系。葉酸介導(dǎo)的一碳代謝也是NADPH生成的重要途徑。在這一過(guò)程中，葉酸首先被還原為四氫葉酸（THF），THF在多種酶的作用下，與不同的一碳單位結(jié)合，形成多種形式的一碳單位載體。MTHFD2作為線粒體一碳代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化亞甲基四氫葉酸（CH2-THF）氧化為10-甲?；臍淙~酸（10-CHO-THF），在這個(gè)過(guò)程中，MTHFD2利用其脫氫酶活性，以NAD+為輔酶，將CH2-THF上的氫原子轉(zhuǎn)移給NAD+，使其還原為NADH，同時(shí)CH2-THF被氧化為相應(yīng)的亞胺中間體；隨后，利用環(huán)水解酶活性，該亞胺中間體發(fā)生水解反應(yīng)，生成10-CHO-THF。雖然此過(guò)程直接產(chǎn)生的是NADH，但線粒體中的煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（NNT）可以利用質(zhì)子電化學(xué)梯度將NADH的電子轉(zhuǎn)移給NADP+，從而生成NADPH，為細(xì)胞提供還原當(dāng)量。葉酸介導(dǎo)的一碳代謝不僅為NADPH的生成提供了途徑，還為嘌呤、胸腺嘧啶等生物分子的合成提供了一碳單位，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有重要意義。蘋果酸酶（MalicEnzyme,ME）也參與了NADPH的生成過(guò)程。蘋果酸酶有三種同工酶，分別為ME1、ME2和ME3，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的分布和功能略有不同。ME1主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，ME2主要存在于線粒體中，ME3則主要存在于過(guò)氧化物酶體中。蘋果酸酶催化蘋果酸氧化脫羧生成丙酮酸，同時(shí)將NADP+還原為NADPH。在腫瘤細(xì)胞中，蘋果酸酶的活性常常升高，以滿足腫瘤細(xì)胞對(duì)NADPH的大量需求。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，ME1的過(guò)表達(dá)能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)NADPH的水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。蘋果酸酶還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝物水平，影響細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和能量代謝，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。除了上述生成途徑，NADPH的穩(wěn)態(tài)還受到其消耗途徑的影響。在細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)中，NADPH發(fā)揮著關(guān)鍵作用。谷胱甘肽還原酶（GlutathioneReductase,GR）利用NADPH作為輔酶，將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為還原型谷胱甘肽（GSH），GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑，它可以通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）的作用，將過(guò)氧化氫（H2O2）還原為水，從而清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS），保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。硫氧還蛋白還原酶（ThioredoxinReductase,TRXR）也依賴于NADPH作為電子供體，維持硫氧還蛋白（TRX）的還原狀態(tài)，TRX參與了細(xì)胞內(nèi)的多種氧化還原反應(yīng)，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能具有重要作用。在脂肪酸合成、膽固醇合成等生物合成過(guò)程中，NADPH作為供氫體參與反應(yīng)，為這些生物分子的合成提供還原當(dāng)量，保證了細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖所需物質(zhì)的合成。NADPH穩(wěn)態(tài)的維持是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，受到多種因素的精細(xì)調(diào)控。生成途徑中的關(guān)鍵酶如G6PD、MTHFD2、蘋果酸酶等的活性變化，以及消耗途徑中抗氧化酶和生物合成酶的需求變化，都會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)NADPH的水平。細(xì)胞還可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)適應(yīng)不同生理狀態(tài)下對(duì)NADPH的需求。在腫瘤細(xì)胞中，由于其快速增殖和生存的需要，往往會(huì)通過(guò)上調(diào)NADPH生成途徑中的關(guān)鍵酶表達(dá)，以及增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)等方式，來(lái)維持較高水平的NADPH穩(wěn)態(tài)，以滿足其代謝和生存的需求。2.3MTHFD2與NADPH穩(wěn)態(tài)的關(guān)聯(lián)MTHFD2作為線粒體一碳代謝途徑中的關(guān)鍵酶，與NADPH穩(wěn)態(tài)之間存在著緊密而復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在一碳代謝途徑中，MTHFD2通過(guò)其獨(dú)特的催化反應(yīng)，直接參與了NADPH的生成過(guò)程。MTHFD2具有亞甲基四氫葉酸脫氫酶和甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶的雙重酶活性，能夠催化亞甲基四氫葉酸（CH2-THF）氧化為10-甲?；臍淙~酸（10-CHO-THF）。在這一反應(yīng)過(guò)程中，MTHFD2以NAD+為輔酶，將CH2-THF上的氫原子轉(zhuǎn)移給NAD+，使其還原為NADH。雖然此反應(yīng)直接產(chǎn)生的是NADH，但線粒體中的煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（NNT）可以利用質(zhì)子電化學(xué)梯度，將NADH的電子轉(zhuǎn)移給NADP+，從而生成NADPH。這一過(guò)程使得MTHFD2成為一碳代謝途徑中NADPH生成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，為細(xì)胞提供了重要的還原當(dāng)量，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)NADPH的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。MTHFD2對(duì)NADPH穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用還體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的影響上。NADPH作為細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它可以通過(guò)谷胱甘肽還原酶（GR）將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為還原型谷胱甘肽（GSH），GSH能夠清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS），保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。當(dāng)MTHFD2表達(dá)或活性異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致NADPH生成減少，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)GSH水平降低，ROS積累，破壞細(xì)胞的氧化還原平衡，引發(fā)一系列氧化應(yīng)激相關(guān)的損傷，如DNA損傷、蛋白質(zhì)氧化修飾等，影響細(xì)胞的正常生理功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在腫瘤細(xì)胞中，由于其快速增殖和代謝活躍，對(duì)NADPH的需求更高，MTHFD2的高表達(dá)有助于維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)的NADPH穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力，使其能夠抵抗氧化應(yīng)激的損傷，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。MTHFD2還與其他代謝途徑相互作用，間接影響NADPH穩(wěn)態(tài)。磷酸戊糖途徑（PPP）是細(xì)胞生成NADPH的主要途徑之一，MTHFD2參與的一碳代謝途徑與PPP之間存在著密切的聯(lián)系。一碳代謝途徑為PPP提供了重要的中間產(chǎn)物，如5-磷酸核糖等，這些中間產(chǎn)物可以參與PPP的反應(yīng)，促進(jìn)NADPH的生成。5-磷酸核糖在PPP的非氧化階段可以經(jīng)過(guò)一系列轉(zhuǎn)酮基及轉(zhuǎn)醛基反應(yīng)，生成3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖，進(jìn)而重新進(jìn)入糖酵解途徑進(jìn)行代謝，實(shí)現(xiàn)了一碳代謝途徑與糖酵解途徑的相互聯(lián)系，也為NADPH的生成提供了更多的途徑和可能性。脂肪酸合成途徑也依賴于NADPH作為供氫體，MTHFD2通過(guò)調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)，影響脂肪酸合成的速率和效率，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在腫瘤細(xì)胞中，MTHFD2的高表達(dá)可以為脂肪酸合成提供充足的NADPH，促進(jìn)脂肪酸的合成，滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖對(duì)脂質(zhì)的需求，同時(shí)也有助于維持腫瘤細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和功能完整性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存能力。MTHFD2與NADPH穩(wěn)態(tài)之間存在著多方面的關(guān)聯(lián)，它通過(guò)直接參與NADPH的生成、影響細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡以及與其他代謝途徑相互作用等方式，維持著細(xì)胞內(nèi)NADPH的穩(wěn)態(tài)，對(duì)細(xì)胞的正常生理功能和腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。深入研究MTHFD2與NADPH穩(wěn)態(tài)的關(guān)聯(lián)機(jī)制，將為揭示腫瘤代謝重編程的本質(zhì)以及開(kāi)發(fā)新的腫瘤治療策略提供重要的理論依據(jù)。三、MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生的作用研究3.1MTHFD2在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)特征為了深入了解MTHFD2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，首先對(duì)MTHFD2在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)特征進(jìn)行系統(tǒng)研究。本研究收集了[X]例結(jié)直腸癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，患者的臨床病理資料涵蓋了年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等多方面信息。運(yùn)用免疫組化（IHC）技術(shù)，對(duì)MTHFD2在組織標(biāo)本中的表達(dá)水平及定位情況進(jìn)行檢測(cè)。免疫組化結(jié)果顯示，在癌旁正常組織中，MTHFD2呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)，細(xì)胞染色較淺，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少；而在結(jié)直腸癌組織中，MTHFD2表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞染色明顯加深，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多。通過(guò)對(duì)不同分期結(jié)直腸癌組織的分析發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤分期的進(jìn)展，從Ⅰ期到Ⅳ期，MTHFD2的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高（見(jiàn)圖2）。Ⅰ期結(jié)直腸癌組織中，MTHFD2陽(yáng)性表達(dá)率為[X1]%；Ⅱ期陽(yáng)性表達(dá)率升高至[X2]%；Ⅲ期進(jìn)一步上升到[X3]%；Ⅳ期陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到[X4]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明MTHFD2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的分期密切相關(guān)，提示其可能在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。[此處插入圖2：不同分期結(jié)直腸癌組織中MTHFD2免疫組化染色結(jié)果（×200）]為了進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組化的結(jié)果，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)MTHFD2在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中MTHFD2mRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，差異倍數(shù)達(dá)到[X5]倍（P<0.01）。Westernblot結(jié)果也表明，結(jié)直腸癌組織中MTHFD2蛋白的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，灰度值分析顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見(jiàn)圖3）。這些結(jié)果從不同層面證實(shí)了MTHFD2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)的現(xiàn)象，為后續(xù)研究其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。[此處插入圖3：MTHFD2在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，A為qRT-PCR檢測(cè)MTHFD2mRNA表達(dá)水平；B為Westernblot檢測(cè)MTHFD2蛋白表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01]在細(xì)胞系研究方面，選取了多種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系，包括HCT116、SW480、HT29、LOVO等，以及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460作為對(duì)照。通過(guò)qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)MTHFD2在這些細(xì)胞系中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在所有檢測(cè)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，MTHFD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460（P<0.01）。其中，HCT116細(xì)胞系中MTHFD2表達(dá)水平最高，其mRNA表達(dá)量是NCM460細(xì)胞系的[X6]倍，蛋白表達(dá)量也明顯高于其他細(xì)胞系；SW480和HT29細(xì)胞系中MTHFD2表達(dá)水平次之，LOVO細(xì)胞系中表達(dá)水平相對(duì)較低，但仍顯著高于正常細(xì)胞系（見(jiàn)圖4）。這些結(jié)果表明，MTHFD2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中普遍高表達(dá)，且不同細(xì)胞系之間表達(dá)水平存在差異，為后續(xù)選擇合適的細(xì)胞系進(jìn)行功能研究提供了依據(jù)。[此處插入圖4：MTHFD2在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系中mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，A為qRT-PCR檢測(cè)MTHFD2mRNA表達(dá)水平；B為Westernblot檢測(cè)MTHFD2蛋白表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步分析MTHFD2表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，將MTHFD2表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，MTHFD2表達(dá)水平與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在腫瘤分期方面，如前文所述，隨著腫瘤分期的升高，MTHFD2表達(dá)水平逐漸升高；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)THFD2表達(dá)水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X7]%和[X8]%（P<0.05）；在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)THFD2表達(dá)水平明顯高于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X9]%和[X10]%（P<0.05）。然而，MTHFD2表達(dá)水平與患者的年齡、性別和腫瘤部位無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。這些結(jié)果提示，MTHFD2可能在結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平可作為評(píng)估結(jié)直腸癌患者病情和預(yù)后的潛在指標(biāo)。3.2MTHFD2表達(dá)異常對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和存活的影響為了深入探究MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和存活的影響，本研究采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，構(gòu)建MTHFD2低表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系。針對(duì)MTHFD2基因設(shè)計(jì)了3條特異性的小干擾RNA（siRNA）序列，分別命名為si-MTHFD2-1、si-MTHFD2-2和si-MTHFD2-3，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照siRNA（si-NC）。將這些siRNA分別轉(zhuǎn)染至HCT116和SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，3條siRNA均能有效降低MTHFD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，其中si-MTHFD2-2的干擾效果最為顯著，可使MTHFD2mRNA表達(dá)水平降低約[X11]%（P<0.01），蛋白表達(dá)水平降低約[X12]%（P<0.01）（見(jiàn)圖5），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用si-MTHFD2-2進(jìn)行研究。[此處插入圖5：siRNA轉(zhuǎn)染后MTHFD2在HCT116和SW480細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，A為qRT-PCR檢測(cè)MTHFD2mRNA表達(dá)水平；B為Westernblot檢測(cè)MTHFD2蛋白表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01]利用CCK-8法檢測(cè)MTHFD2低表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。將轉(zhuǎn)染si-MTHFD2-2和si-NC的HCT116、SW480細(xì)胞分別接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，在不同時(shí)間點(diǎn)（0h、24h、48h、72h、96h）加入CCK-8試劑，孵育1-4h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度（OD）值。結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組細(xì)胞的增殖能力明顯低于si-NC組，在48h、72h和96h時(shí)，OD值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組細(xì)胞的增殖也受到顯著抑制，在72h和96h時(shí)，OD值與si-NC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見(jiàn)圖6）。這表明敲低MTHFD2表達(dá)能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力。[此處插入圖6：CCK-8法檢測(cè)MTHFD2低表達(dá)對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞增殖能力的影響，*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步驗(yàn)證MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)行EdU摻入實(shí)驗(yàn)。EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA復(fù)制過(guò)程中摻入到新合成的DNA中，通過(guò)熒光標(biāo)記的疊氮化物與EdU發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，可對(duì)增殖細(xì)胞進(jìn)行可視化檢測(cè)。將轉(zhuǎn)染si-MTHFD2-2和si-NC的HCT116、SW480細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后，加入EdU工作液繼續(xù)孵育2h，然后按照EdU檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色和檢測(cè)。結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯低于si-NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例也顯著低于si-NC組（P<0.01）（見(jiàn)圖7）。這進(jìn)一步證實(shí)了敲低MTHFD2表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。[此處插入圖7：EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MTHFD2低表達(dá)對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞增殖能力的影響，A為EdU染色結(jié)果（×200）；B為EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)分析；*P<0.05，**P<0.01]克隆形成實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)估細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力和克隆形成能力。將轉(zhuǎn)染si-MTHFD2-2和si-NC的HCT116、SW480細(xì)胞以低密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)10-14天后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，然后用甲醇固定15-20min，再用結(jié)晶紫染色10-15min，最后用清水沖洗，晾干后計(jì)數(shù)克隆數(shù)（≥50個(gè)細(xì)胞的克隆為有效克?。?。結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組的克隆形成數(shù)明顯少于si-NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組的克隆形成數(shù)也顯著低于si-NC組（P<0.01）（見(jiàn)圖8）。這表明MTHFD2表達(dá)下調(diào)可顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的克隆形成能力，影響細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖。[此處插入圖8：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MTHFD2低表達(dá)對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞克隆形成能力的影響，A為克隆形成結(jié)果；B為克隆形成數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；*P<0.05，**P<0.01]細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和組織正常功能具有重要意義。為了研究MTHFD2表達(dá)異常對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。將轉(zhuǎn)染si-MTHFD2-2和si-NC的HCT116、SW480細(xì)胞培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組早期凋亡（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡（AnnexinV+/PI+）細(xì)胞的比例之和為[X13]%，明顯高于si-NC組的[X14]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組凋亡細(xì)胞比例為[X15]%，顯著高于si-NC組的[X16]%（P<0.01）（見(jiàn)圖9）。這表明敲低MTHFD2表達(dá)可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞的存活能力。[此處插入圖9：AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)MTHFD2低表達(dá)對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞凋亡的影響，A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；B為凋亡細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)分析；*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步驗(yàn)證MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和存活的影響，構(gòu)建MTHFD2過(guò)表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系。將MTHFD2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-MTHFD2）和空質(zhì)粒（pcDNA3.1）分別轉(zhuǎn)染至HCT116和SW480細(xì)胞中，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組相比，pcDNA3.1-MTHFD2組MTHFD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。采用CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)MTHFD2過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果表明，MTHFD2過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)HCT116和SW480細(xì)胞的增殖能力，增加EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例和克隆形成數(shù)，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡（P<0.01）（相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖略）。綜上所述，MTHFD2表達(dá)異常對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和存活具有顯著影響。敲低MTHFD2表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，降低細(xì)胞的克隆形成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而MTHFD2過(guò)表達(dá)則促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和存活，表明MTHFD2在結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。3.3MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用驗(yàn)證為了深入探究MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用，本研究通過(guò)干擾MTHFD2表達(dá)，觀察NADPH穩(wěn)態(tài)及癌細(xì)胞增殖的變化，并進(jìn)一步補(bǔ)充NADPH來(lái)驗(yàn)證其對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響。在干擾MTHFD2表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，選取干擾效果最佳的si-MTHFD2-2轉(zhuǎn)染HCT116和SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NADPH和NADP+的含量。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-MTHFD2-2組細(xì)胞內(nèi)NADPH含量顯著降低，NADPH/NADP+比值也明顯下降（見(jiàn)圖10）。在HCT116細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組NADPH含量從si-NC組的[X17]nmol/mgprotein降至[X18]nmol/mgprotein，NADPH/NADP+比值從[X19]降至[X20]；在SW480細(xì)胞中，NADPH含量從[X21]nmol/mgprotein降至[X22]nmol/mgprotein，NADPH/NADP+比值從[X23]降至[X24]，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明敲低MTHFD2表達(dá)會(huì)破壞結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)的NADPH穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致NADPH水平顯著下降。[此處插入圖10：干擾MTHFD2表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)NADPH和NADP+含量及NADPH/NADP+比值的影響，A為HCT116細(xì)胞；B為SW480細(xì)胞；*P<0.05，**P<0.01]同時(shí)，利用CCK-8法檢測(cè)干擾MTHFD2表達(dá)后癌細(xì)胞的增殖能力變化。結(jié)果顯示，如前文所述，敲低MTHFD2表達(dá)可顯著抑制HCT116和SW480細(xì)胞的增殖能力，在48h、72h和96h時(shí)，si-MTHFD2-2組細(xì)胞的OD值明顯低于si-NC組（P<0.01）。這表明MTHFD2表達(dá)下調(diào)不僅影響NADPH穩(wěn)態(tài)，還對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生顯著抑制作用，提示MTHFD2可能通過(guò)調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)來(lái)影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NADPH在MTHFD2調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖中的作用，進(jìn)行了NADPH補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染si-MTHFD2-2的HCT116和SW480細(xì)胞分為兩組，一組為補(bǔ)充NADPH組，在培養(yǎng)基中添加終濃度為[X25]μM的NADPH；另一組為未補(bǔ)充NADPH組，作為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，在補(bǔ)充NADPH后，si-MTHFD2-2組細(xì)胞的增殖能力得到顯著恢復(fù)（見(jiàn)圖11）。在HCT116細(xì)胞中，補(bǔ)充NADPH組48h、72h和96h時(shí)的OD值分別為[X26]、[X27]和[X28]，明顯高于未補(bǔ)充NADPH組的[X29]、[X30]和[X31]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，補(bǔ)充NADPH組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的OD值也顯著高于未補(bǔ)充NADPH組（P<0.01）。這表明外源性補(bǔ)充NADPH能夠部分逆轉(zhuǎn)由于MTHFD2表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖抑制，進(jìn)一步證實(shí)了MTHFD2通過(guò)調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，NADPH在這一過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。[此處插入圖11：補(bǔ)充NADPH對(duì)干擾MTHFD2表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，A為HCT116細(xì)胞；B為SW480細(xì)胞；*P<0.05，**P<0.01]綜上所述，干擾MTHFD2表達(dá)會(huì)破壞結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)的NADPH穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致NADPH水平降低，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖能力；而外源性補(bǔ)充NADPH能夠部分恢復(fù)癌細(xì)胞的增殖能力，表明MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)在結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中對(duì)癌細(xì)胞增殖起到了重要的促進(jìn)作用。四、MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用研究4.1MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響為了探究MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。Transwell小室是一種常用的細(xì)胞體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)工具，其上層小室為無(wú)血清培養(yǎng)基，下層小室為含血清培養(yǎng)基，細(xì)胞會(huì)受到下層培養(yǎng)基中趨化因子的吸引而向小室下層遷移。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，小室的聚碳酸酯膜上預(yù)先鋪有基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需要分泌蛋白酶降解基質(zhì)膠才能穿過(guò)膜到達(dá)下層，因此侵襲實(shí)驗(yàn)可以更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的侵襲能力。首先，構(gòu)建MTHFD2低表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系。將干擾效果最佳的si-MTHFD2-2轉(zhuǎn)染至HCT116和SW480細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA（si-NC）的細(xì)胞組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為[X32]×105個(gè)/mL。在Transwell小室的上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)（遷移實(shí)驗(yàn)）或48小時(shí)（侵襲實(shí)驗(yàn)）。孵育結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞，然后將小室放入4%多聚甲醛中固定20-30分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-20分鐘，最后用清水沖洗，晾干后在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，在遷移實(shí)驗(yàn)中，HCT116細(xì)胞的si-MTHFD2-2組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為[X33]±[X34]個(gè)，明顯低于si-NC組的[X35]±[X36]個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；SW480細(xì)胞的si-MTHFD2-2組遷移細(xì)胞數(shù)為[X37]±[X38]個(gè)，顯著低于si-NC組的[X39]±[X40]個(gè)（P<0.01）（見(jiàn)圖12A、12B）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，HCT116細(xì)胞的si-MTHFD2-2組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為[X41]±[X42]個(gè)，顯著低于si-NC組的[X43]±[X44]個(gè)（P<0.01）；SW480細(xì)胞的si-MTHFD2-2組侵襲細(xì)胞數(shù)為[X45]±[X46]個(gè)，也明顯低于si-NC組的[X47]±[X48]個(gè)（P<0.01）（見(jiàn)圖12C、12D）。這表明敲低MTHFD2表達(dá)能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。[此處插入圖12：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MTHFD2低表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，A、B為遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，A為HCT116細(xì)胞，B為SW480細(xì)胞；C、D為侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，C為HCT116細(xì)胞，D為SW480細(xì)胞；*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步驗(yàn)證MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用，構(gòu)建MTHFD2過(guò)表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系。將MTHFD2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-MTHFD2）和空質(zhì)粒（pcDNA3.1）分別轉(zhuǎn)染至HCT116和SW480細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在遷移實(shí)驗(yàn)中，HCT116細(xì)胞的pcDNA3.1-MTHFD2組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為[X49]±[X50]個(gè)，明顯高于空質(zhì)粒組的[X51]±[X52]個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；SW480細(xì)胞的pcDNA3.1-MTHFD2組遷移細(xì)胞數(shù)為[X53]±[X54]個(gè)，顯著高于空質(zhì)粒組的[X55]±[X56]個(gè)（P<0.01）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，HCT116細(xì)胞的pcDNA3.1-MTHFD2組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為[X57]±[X58]個(gè)，顯著高于空質(zhì)粒組的[X59]±[X60]個(gè)（P<0.01）；SW480細(xì)胞的pcDNA3.1-MTHFD2組侵襲細(xì)胞數(shù)為[X61]±[X62]個(gè)，也明顯高于空質(zhì)粒組的[X63]±[X64]個(gè)（P<0.01）（相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖略）。這進(jìn)一步證實(shí)了MTHFD2過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力具有重要的調(diào)控作用。敲低MTHFD2表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而MTHFD2過(guò)表達(dá)則促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，表明MTHFD2在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。4.2MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去其極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如增強(qiáng)的遷移和侵襲能力。這一過(guò)程涉及多種分子和信號(hào)通路的改變，包括上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)，以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist等的調(diào)控。為了探究MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，本研究首先分析了MTHFD2表達(dá)改變對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響。通過(guò)Westernblot技術(shù)檢測(cè)干擾MTHFD2表達(dá)后HCT116和SW480細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-MTHFD2-2組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯降低（見(jiàn)圖13）。在HCT116細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組E-cadherin蛋白表達(dá)量相對(duì)si-NC組增加了[X65]倍（P<0.01），N-cadherin蛋白表達(dá)量降低了[X66]%（P<0.01），Vimentin蛋白表達(dá)量降低了[X67]%（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，E-cadherin蛋白表達(dá)量增加了[X68]倍（P<0.01），N-cadherin蛋白表達(dá)量降低了[X69]%（P<0.01），Vimentin蛋白表達(dá)量降低了[X70]%（P<0.01）。這表明敲低MTHFD2表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，使細(xì)胞向上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，從而降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。[此處插入圖13：干擾MTHFD2表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平的影響，A為HCT116細(xì)胞；B為SW480細(xì)胞；*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步驗(yàn)證MTHFD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的調(diào)控作用，構(gòu)建MTHFD2過(guò)表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組相比，pcDNA3.1-MTHFD2組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高（相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖略）。在HCT116細(xì)胞中，pcDNA3.1-MTHFD2組E-cadherin蛋白表達(dá)量相對(duì)空質(zhì)粒組降低了[X71]%（P<0.01），N-cadherin蛋白表達(dá)量增加了[X72]倍（P<0.01），Vimentin蛋白表達(dá)量增加了[X73]倍（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，E-cadherin蛋白表達(dá)量降低了[X74]%（P<0.01），N-cadherin蛋白表達(dá)量增加了[X75]倍（P<0.01），Vimentin蛋白表達(dá)量增加了[X76]倍（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了MTHFD2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，使細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。NADPH作為細(xì)胞內(nèi)重要的還原當(dāng)量，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為了研究MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)是否通過(guò)影響細(xì)胞氧化還原狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移，本研究檢測(cè)了干擾MTHFD2表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）水平的變化。采用2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，DCFH-DA本身無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被ROS氧化生成具有熒光的DCF，通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-MTHFD2-2組HCT116和SW480細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（見(jiàn)圖14）。在HCT116細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組DCF熒光強(qiáng)度相對(duì)si-NC組增加了[X77]%（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，DCF熒光強(qiáng)度增加了[X78]%（P<0.01）。這表明敲低MTHFD2表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NADPH水平降低，無(wú)法有效清除ROS，從而使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，破壞了細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)。[此處插入圖14：干擾MTHFD2表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，A為HCT116細(xì)胞；B為SW480細(xì)胞；*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步驗(yàn)證ROS在MTHFD2調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移中的作用，進(jìn)行了抗氧化劑處理實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染si-MTHFD2-2的HCT116和SW480細(xì)胞分為兩組，一組加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-Cysteine，NAC），另一組作為對(duì)照。NAC是一種常用的抗氧化劑，它可以提供還原當(dāng)量，清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，從而減輕氧化應(yīng)激。處理24小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，加入NAC后，si-MTHFD2-2組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低，接近si-NC組水平（見(jiàn)圖15A、15B）。同時(shí)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平降低（見(jiàn)圖15C、15D）。在HCT116細(xì)胞中，加入NAC后，DCF熒光強(qiáng)度相對(duì)未加NAC組降低了[X79]%（P<0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)量增加了[X80]倍（P<0.01），N-cadherin蛋白表達(dá)量降低了[X81]%（P<0.01），Vimentin蛋白表達(dá)量降低了[X82]%（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，DCF熒光強(qiáng)度降低了[X83]%（P<0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)量增加了[X84]倍（P<0.01），N-cadherin蛋白表達(dá)量降低了[X85]%（P<0.01），Vimentin蛋白表達(dá)量降低了[X86]%（P<0.01）。這表明清除ROS能夠部分逆轉(zhuǎn)由于MTHFD2表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)改變，進(jìn)一步證實(shí)了MTHFD2通過(guò)調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)來(lái)維持細(xì)胞氧化還原平衡，從而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移過(guò)程，ROS在這一過(guò)程中起到了重要的介導(dǎo)作用。[此處插入圖15：抗氧化劑NAC處理對(duì)干擾MTHFD2表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平及EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平的影響，A、B為ROS水平檢測(cè)結(jié)果，A為HCT116細(xì)胞，B為SW480細(xì)胞；C、D為EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，C為HCT116細(xì)胞，D為SW480細(xì)胞；*P<0.05，**P<0.01]在信號(hào)通路方面，本研究通過(guò)Westernblot技術(shù)檢測(cè)了干擾MTHFD2表達(dá)后結(jié)直腸癌細(xì)胞中與EMT相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化，如PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活、遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其激活可促進(jìn)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)EMT過(guò)程；MAPK信號(hào)通路包括ERK、JNK和p38MAPK等分支，它們參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等，在腫瘤轉(zhuǎn)移中也起到關(guān)鍵作用。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-MTHFD2-2組HCT116和SW480細(xì)胞中p-AKT（磷酸化AKT）和p-ERK（磷酸化ERK）蛋白表達(dá)水平顯著降低（見(jiàn)圖16）。在HCT116細(xì)胞中，si-MTHFD2-2組p-AKT蛋白表達(dá)量相對(duì)si-NC組降低了[X87]%（P<0.01），p-ERK蛋白表達(dá)量降低了[X88]%（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，p-AKT蛋白表達(dá)量降低了[X89]%（P<0.01），p-ERK蛋白表達(dá)量降低了[X90]%（P<0.01）。這表明敲低MTHFD2表達(dá)可抑制PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的激活，從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移過(guò)程。[此處插入圖16：干擾MTHFD2表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響，A為HCT116細(xì)胞；B為SW480細(xì)胞；*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路在MTHFD2調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移中的作用，采用信號(hào)通路抑制劑進(jìn)行處理實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染si-MTHFD2-2的HCT116和SW480細(xì)胞分別用PI3K抑制劑LY294002和MEK抑制劑U0126處理，LY294002可特異性抑制PI3K的活性，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路；U0126可特異性抑制MEK的活性，阻斷MAPK信號(hào)通路中ERK的激活。處理24小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力以及EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，與未處理組相比，LY294002和U0126處理組細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低（相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖略）。同時(shí)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平降低（相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖略）。這表明抑制PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路可進(jìn)一步抑制由于MTHFD2表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)以及EMT過(guò)程，進(jìn)一步證實(shí)了PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路在MTHFD2調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。綜上所述，MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。MTHFD2通過(guò)維持細(xì)胞內(nèi)NADPH穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，抑制ROS的積累，從而調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。MTHFD2還通過(guò)激活PI3K/AKT和MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些研究結(jié)果揭示了MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為結(jié)直腸癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。4.3體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移為了進(jìn)一步驗(yàn)證MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用，本研究構(gòu)建了小鼠轉(zhuǎn)移模型。選擇4-6周齡的BALB/c裸鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。將干擾MTHFD2表達(dá)的HCT116細(xì)胞（si-MTHFD2-2組）和對(duì)照組細(xì)胞（si-NC組）分別用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL。通過(guò)尾靜脈注射的方式，將200μL細(xì)胞懸液注入裸鼠體內(nèi)，每組注射6只裸鼠。在注射細(xì)胞后的第2周，開(kāi)始通過(guò)活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。對(duì)于表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞，在成像前腹腔注射D-熒光素鉀鹽（150mg/kg），10-15分鐘后將裸鼠置于活體成像系統(tǒng)中，進(jìn)行熒光信號(hào)采集。結(jié)果顯示，si-NC組裸鼠肺部及其他遠(yuǎn)處器官的熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于si-MTHFD2-2組，表明對(duì)照組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)（見(jiàn)圖17A）。在第4周，對(duì)裸鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察肺、肝等遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移灶情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si-NC組裸鼠肺部出現(xiàn)較多大小不一的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)為[X91]±[X92]個(gè)；而si-MTHFD2-2組裸鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少，平均為[X93]±[X94]個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見(jiàn)圖17B、17C）。在肝臟轉(zhuǎn)移方面，si-NC組有[X95]只裸鼠出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶呈灰白色，大小不等；而si-MTHFD2-2組僅有[X96]只裸鼠出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見(jiàn)圖17D）。[此處插入圖17：小鼠轉(zhuǎn)移模型中MTHFD2表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的影響，A為活體成像結(jié)果；B為肺部轉(zhuǎn)移灶肉眼觀察結(jié)果；C為肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；D為肝臟轉(zhuǎn)移情況統(tǒng)計(jì)分析；*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步分析MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用，對(duì)轉(zhuǎn)移灶組織進(jìn)行NADPH含量檢測(cè)和EMT相關(guān)標(biāo)志物的免疫組化分析。采用HPLC-MS技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)移灶組織中NADPH和NADP+的含量，結(jié)果顯示，si-NC組轉(zhuǎn)移灶組織中NADPH含量為[X97]nmol/mgprotein，NADPH/NADP+比值為[X98]；而si-MTHFD2-2組轉(zhuǎn)移灶組織中NADPH含量顯著降低，為[X99]nmol/mgprotein，NADPH/NADP+比值也降至[X100]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見(jiàn)圖18A）。免疫組化結(jié)果顯示，si-NC組轉(zhuǎn)移灶組織中E-cadherin表達(dá)水平較低，而N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平較高；si-MTHFD2-2組轉(zhuǎn)移灶組織中E-cadherin表達(dá)水平明顯升高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平顯著降低（見(jiàn)圖18B）。這表明敲低MTHFD2表達(dá)后，抑制了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，同時(shí)降低了轉(zhuǎn)移灶組織中的NADPH水平，逆轉(zhuǎn)了EMT過(guò)程，進(jìn)一步證實(shí)了MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的重要作用。[此處插入圖18：小鼠轉(zhuǎn)移模型中轉(zhuǎn)移灶組織NADPH含量及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)分析，A為轉(zhuǎn)移灶組織NADPH和NADP+含量及NADPH/NADP+比值檢測(cè)結(jié)果；B為轉(zhuǎn)移灶組織EMT相關(guān)標(biāo)志物免疫組化染色結(jié)果（×200）；*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步驗(yàn)證MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用，進(jìn)行了補(bǔ)充NADPH的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染si-MTHFD2-2的HCT116細(xì)胞分為兩組，一組在注射前用NADPH（終濃度為[X101]μM）預(yù)處理30分鐘，另一組作為對(duì)照。然后通過(guò)尾靜脈注射的方式將細(xì)胞注入裸鼠體內(nèi)，每組注射6只裸鼠。在注射后的第4周，對(duì)裸鼠進(jìn)行解剖，觀察肺部轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示，補(bǔ)充NADPH組裸鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)為[X102]±[X103]個(gè)，明顯多于未補(bǔ)充NADPH組的[X104]±[X105]個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見(jiàn)圖19）。這表明外源性補(bǔ)充NADPH能夠部分恢復(fù)由于MTHFD2表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移抑制，進(jìn)一步證實(shí)了MTHFD2通過(guò)調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。[此處插入圖19：補(bǔ)充NADPH對(duì)干擾MTHFD2表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響，A為肺部轉(zhuǎn)移灶肉眼觀察結(jié)果；B為肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；*P<0.05，**P<0.01]綜上所述，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MTHFD2表達(dá)下調(diào)可抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，降低轉(zhuǎn)移灶組織中的NADPH水平，逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程；而外源性補(bǔ)充NADPH能夠部分恢復(fù)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步驗(yàn)證了MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的重要作用，為結(jié)直腸癌的治療提供了重要的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制研究5.1MTHFD2的上游調(diào)控因子為了深入探究MTHFD2調(diào)控NADPH穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制，首先需要明確其上游調(diào)控因子。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，利用多種數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具，如JASPAR（/）、TRANSFAC（/pub/databases.html#transfac）等，對(duì)MTHFD2基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)可能與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核因子κB（NF-κB）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）等轉(zhuǎn)錄因子可能是MTHFD2的潛在上游調(diào)控因子。NF-κB是一種廣泛存在于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥、免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為了驗(yàn)證NF-κB是否參與調(diào)控MTHFD2的表達(dá)，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。采用siRNA干擾技術(shù)敲低結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480中NF-κB的表達(dá)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照siRNA（si-NC）組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)MTHFD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，敲低NF-κB表達(dá)后，MTHFD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（見(jiàn)圖20）。在HCT116細(xì)胞中，si-NF-κB組MTHFD2mRNA表達(dá)水平相對(duì)si-NC組降低了[X106]%（P<0.01），蛋白表達(dá)水平降低了[X107]%（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，MTHFD2mRNA表達(dá)水平降低了[X108]%（P<0.01），蛋白表達(dá)水平降低了[X109]%（P<0.01）。[此處插入圖20：敲低NF-κB表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中MTHFD2mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，A為HCT116細(xì)胞；B為SW480細(xì)胞；*P<0.05，**P<0.01]為了進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB對(duì)MTHFD2表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建包含MTHFD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pGL3-MTHFD2-promoter），將其與NF-κB表達(dá)質(zhì)粒或空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染NF-κB表達(dá)質(zhì)粒組的熒光素酶活性顯著升高（P<0.01），表明NF-κB能夠激活MTHFD2基因啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)MTHFD2的表達(dá)（見(jiàn)圖21）。[此處插入圖21：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)NF-κB對(duì)MTHFD2基因啟動(dòng)子活性的影響；*P<0.05，**P<0.01]為了探究NF-κB調(diào)控MTHFD2表達(dá)的具體結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)MTHFD2基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)可能的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pGL3-MTHFD2-promoter-mut）。將野生型和突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別與NF-κB表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著低于野生型，表明NF-κB通過(guò)與MTHFD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控MTHFD2的表達(dá)（相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖略）。缺氧是腫瘤微環(huán)境的重要特征之一，HIF-1α是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、存活和轉(zhuǎn)移等過(guò)程具有重要影響。為了研究HIF-1α對(duì)MTHFD