HPS血清型4、13型TbpA對豚鼠交互免疫保護機制的深度解析一、引言1.1研究背景與意義副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPS）是一種革蘭氏陰性短小桿菌，形態(tài)多樣，可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等疾病，又稱格拉澤氏?。℅lasser'sdisease）。該病對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重影響了仔豬和青年豬的健康。HPS具有15種以上的血清型，其中血清型4、13型較為常見，且毒力較強，在臨床上的檢出率較高。不同血清型的HPS之間交叉保護力較弱，這給疫苗的研發(fā)和防控工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A（Transferrin-bindingproteinA，TbpA）是HPS獲取鐵元素的關(guān)鍵蛋白，在細菌的生長和致病過程中發(fā)揮著重要作用。鐵是細菌生長所必需的營養(yǎng)元素，但在宿主動物體內(nèi)，鐵主要與轉(zhuǎn)鐵蛋白等結(jié)合，處于低游離狀態(tài)。HPS通過表面的TbpA蛋白與宿主轉(zhuǎn)鐵蛋白特異性結(jié)合，攝取鐵元素，從而滿足自身生長和繁殖的需求。由于TbpA在HPS致病過程中的關(guān)鍵作用，其被認為是一種潛在的疫苗候選抗原。研究表明，TbpA具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。然而，不同血清型HPS的TbpA在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上存在一定差異，這種差異是否會影響其免疫保護效果，尤其是血清型4、13型TbpA對豚鼠的交互免疫保護作用，尚不清楚。豚鼠作為一種常用的實驗動物，在免疫學(xué)研究中具有重要地位。其免疫系統(tǒng)與人類有一定的相似性，對多種病原體易感，且實驗操作相對簡便。以豚鼠為模型研究HPS的免疫保護機制，不僅可以深入了解TbpA在免疫應(yīng)答中的作用，還能為疫苗的研發(fā)提供重要的實驗依據(jù)。目前，針對HPS血清型4、13型TbpA對豚鼠交互免疫保護作用的研究較少，開展此項研究具有重要的理論和實踐意義。從理論角度來看，有助于揭示不同血清型HPSTbpA的免疫特性和交互免疫保護機制，豐富對HPS致病和免疫機制的認識。在實踐方面，可為開發(fā)高效、廣譜的HPS疫苗提供科學(xué)依據(jù)，提高對HPS病的防控效果，減少養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟損失。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，HPS的研究起步較早，對其病原學(xué)、流行病學(xué)、致病機理等方面都有較為深入的探討。早期研究明確了HPS的革蘭氏陰性特性、形態(tài)多樣性以及生長對NAD的嚴(yán)格需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國外學(xué)者對HPS的基因分型、毒力因子等進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)不同血清型的HPS在基因序列和毒力上存在差異。在TbpA的研究方面，國外學(xué)者率先揭示了TbpA在HPS鐵攝取過程中的關(guān)鍵作用，通過基因敲除等實驗手段，證實了缺失tbpA基因的HPS在鐵限制環(huán)境下生長受到抑制。后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)，TbpA具有免疫原性，能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。例如，有研究將TbpA作為抗原免疫小鼠，檢測到小鼠血清中產(chǎn)生了特異性抗體，且在一定程度上能夠抵抗HPS的感染。但關(guān)于不同血清型HPS的TbpA對豚鼠的交互免疫保護作用，國外研究雖有涉及，但仍不夠系統(tǒng)和深入。國內(nèi)對HPS的研究也取得了豐碩成果。在流行病學(xué)調(diào)查方面，明確了我國不同地區(qū)HPS的血清型分布特點，發(fā)現(xiàn)血清型4、5、13等在臨床上較為常見。同時，對HPS的診斷技術(shù)進行了大量研究，建立了多種快速、準(zhǔn)確的檢測方法，如PCR、ELISA等。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，國內(nèi)學(xué)者嘗試了多種疫苗制備技術(shù)，包括傳統(tǒng)的滅活疫苗、亞單位疫苗以及基因工程疫苗等。對于TbpA，國內(nèi)研究主要集中在其基因克隆、表達和免疫原性分析上。通過原核表達系統(tǒng)成功表達了TbpA蛋白，并對其免疫活性進行了初步研究。有研究表明，重組TbpA蛋白能夠誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對同源菌株的攻擊具有一定的保護作用。然而，針對HPS血清型4、13型TbpA對豚鼠交互免疫保護作用的研究，國內(nèi)尚處于起步階段，相關(guān)報道較少。綜合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，雖然對HPS及TbpA的研究已取得了一定進展，但仍存在一些不足之處。首先，不同血清型HPS的TbpA在免疫保護機制上的差異尚未完全明確，尤其是血清型4、13型TbpA之間的交互免疫保護作用研究較少。其次，現(xiàn)有的研究大多以小鼠、仔豬等為實驗動物，以豚鼠為模型研究HPSTbpA免疫保護作用的報道相對較少，而豚鼠在免疫學(xué)研究中具有獨特的優(yōu)勢，其免疫系統(tǒng)對病原體的應(yīng)答模式與人類有一定相似性，更適合用于深入研究免疫保護機制。因此，開展HPS血清型4、13型TbpA對豚鼠的交互免疫保護性研究具有重要的科學(xué)意義和實際應(yīng)用價值，有望為HPS疫苗的研發(fā)和優(yōu)化提供新的思路和理論依據(jù)。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究HPS血清型4、13型的TbpA蛋白對豚鼠的交互免疫保護作用，明確TbpA作為潛在疫苗候選抗原在不同血清型HPS免疫防控中的可行性和有效性，為開發(fā)高效、廣譜的HPS疫苗提供關(guān)鍵的實驗依據(jù)和理論支持。本研究將圍繞以下幾個方面展開：首先，通過基因克隆和原核表達技術(shù)，獲取高純度的HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白。具體來說，從HPS血清型4、13型菌株中提取基因組DNA，利用特異性引物擴增tbpA基因，將其克隆到合適的表達載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達系統(tǒng)進行誘導(dǎo)表達。隨后，運用親和層析等方法對表達的重組TbpA蛋白進行純化，獲得高純度的目標(biāo)蛋白，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。其次，對重組TbpA蛋白的免疫原性進行全面分析。將純化后的重組TbpA蛋白免疫豚鼠，定期采集血清，采用ELISA等方法檢測血清中特異性抗體水平，動態(tài)監(jiān)測抗體的產(chǎn)生規(guī)律和變化趨勢。同時，運用細胞免疫檢測技術(shù)，如淋巴細胞增殖試驗、細胞因子檢測等，評估免疫后豚鼠的細胞免疫應(yīng)答水平，深入了解TbpA蛋白激發(fā)的細胞免疫反應(yīng)機制。再者，開展豚鼠的免疫保護試驗。將豚鼠隨機分組，分別用血清型4、13型的重組TbpA蛋白進行免疫，設(shè)置對照組。在免疫程序完成后，用同源和異源的HPS菌株對豚鼠進行攻毒，觀察豚鼠的發(fā)病癥狀、死亡情況，統(tǒng)計免疫保護率。通過對比不同組豚鼠的發(fā)病和死亡情況，直觀評估TbpA蛋白對豚鼠的免疫保護效果，尤其是血清型4、13型TbpA蛋白之間的交互免疫保護作用。最后，對免疫和攻毒后的豚鼠進行病理組織學(xué)檢查。采集豚鼠的重要臟器，如肺臟、脾臟、肝臟等，制作病理切片，通過蘇木精-伊紅（HE）染色等方法，觀察組織病理學(xué)變化。從組織學(xué)層面分析TbpA蛋白免疫對豚鼠臟器損傷的保護作用，進一步揭示TbpA蛋白的免疫保護機制，為疫苗的研發(fā)提供更全面的病理學(xué)依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用基因工程、動物實驗、免疫檢測等多種技術(shù)手段，系統(tǒng)地開展HPS血清型4、13型TbpA對豚鼠的交互免疫保護性研究。在基因工程技術(shù)方面，采用分子克隆技術(shù)從HPS血清型4、13型菌株中獲取tbpA基因。具體步驟包括提取菌株的基因組DNA，根據(jù)已公布的tbpA基因序列設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增目的基因片段。隨后，將擴增得到的tbpA基因克隆到合適的原核表達載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并進行測序驗證，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。利用誘導(dǎo)表達技術(shù)，在大腸桿菌中表達重組TbpA蛋白。通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，如誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、培養(yǎng)溫度等，提高重組蛋白的表達量。采用親和層析、離子交換層析等方法對表達的重組TbpA蛋白進行純化，獲得高純度的目標(biāo)蛋白，為后續(xù)的免疫實驗提供優(yōu)質(zhì)的抗原。動物實驗方面，選用健康的豚鼠作為實驗對象，隨機分組，分別進行不同的免疫處理。在免疫程序設(shè)計上，設(shè)置初次免疫、加強免疫等環(huán)節(jié)，確保豚鼠能夠產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。在免疫保護試驗中，用同源和異源的HPS菌株對免疫后的豚鼠進行攻毒，觀察豚鼠的發(fā)病癥狀、死亡情況，統(tǒng)計免疫保護率，直觀評估TbpA蛋白的免疫保護效果。免疫檢測技術(shù)用于分析豚鼠的免疫應(yīng)答情況。采用ELISA方法檢測免疫后豚鼠血清中特異性抗體水平，包括IgG、IgM等抗體亞型，動態(tài)監(jiān)測抗體的產(chǎn)生規(guī)律和變化趨勢。運用細胞免疫檢測技術(shù)，如淋巴細胞增殖試驗，檢測免疫后豚鼠淋巴細胞的增殖活性，評估細胞免疫應(yīng)答水平；通過檢測細胞因子（如IL-2、IFN-γ等）的分泌水平，深入了解TbpA蛋白激發(fā)的細胞免疫反應(yīng)機制。病理組織學(xué)檢查是本研究的重要環(huán)節(jié)。在免疫和攻毒后，采集豚鼠的重要臟器，如肺臟、脾臟、肝臟等，制作病理切片。通過蘇木精-伊紅（HE）染色等方法，觀察組織病理學(xué)變化，從組織學(xué)層面分析TbpA蛋白免疫對豚鼠臟器損傷的保護作用，進一步揭示TbpA蛋白的免疫保護機制。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先從HPS血清型4、13型菌株中提取基因組DNA，通過PCR擴增tbpA基因，將其克隆到表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達并純化重組TbpA蛋白。對豚鼠進行分組免疫，定期采集血清檢測抗體水平和細胞因子水平。免疫程序完成后，用HPS菌株攻毒，觀察發(fā)病和死亡情況，統(tǒng)計免疫保護率。最后采集臟器制作病理切片，進行病理組織學(xué)檢查。通過這一系列實驗步驟，全面深入地探究HPS血清型4、13型TbpA對豚鼠的交互免疫保護作用。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1-1技術(shù)路線圖二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1受試菌株選用HPS血清型4型菌株（編號為HP4）和13型菌株（編號為HP13），均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心。菌株保存于-80℃冰箱，保存液為含有20%甘油的TSB（TrypticSoyBroth）培養(yǎng)基，以防止菌株在冷凍過程中受到損傷，確保其生物學(xué)特性的穩(wěn)定性。在實驗前，將保存的菌株從-80℃冰箱取出，迅速放入37℃水浴鍋中進行復(fù)蘇，使菌株盡快恢復(fù)活性。隨后，將復(fù)蘇后的菌株接種于TSB固體培養(yǎng)基平板上，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)18-24h，使菌株在固體培養(yǎng)基上充分生長繁殖，形成單菌落。挑選單菌落再次接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h，振蕩速度為180r/min，以獲得足夠數(shù)量的菌株用于后續(xù)實驗。2.1.2實驗動物選用健康的清潔級豚鼠，品種為英國種，體重250-300g，購自南京模式動物研究中心。豚鼠飼養(yǎng)于溫度為22±2℃、相對濕度為50%-60%的動物房內(nèi)，保持12h光照、12h黑暗的晝夜節(jié)律。實驗動物房定期進行清潔和消毒，采用高壓蒸汽滅菌的方式對飼養(yǎng)籠具、墊料等進行消毒處理，每周更換墊料2-3次，以保持環(huán)境的清潔衛(wèi)生。豚鼠自由采食和飲水，飼料為全價顆粒飼料，符合豚鼠的營養(yǎng)需求，飲用水為經(jīng)過高溫滅菌處理的純凈水。在實驗開始前，豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間密切觀察其健康狀況，確保實驗動物的健康狀態(tài)良好，避免因動物健康問題影響實驗結(jié)果。2.1.3主要試劑實驗所需的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列根據(jù)GenBank中HPS血清型4、13型的tbpA基因序列設(shè)計，具有高度的特異性，確保能夠準(zhǔn)確擴增出目的基因片段。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ，DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司，這些酶的純度均經(jīng)過嚴(yán)格檢測，酶活性高，能夠保證基因克隆和表達過程中DNA的切割和連接反應(yīng)高效、準(zhǔn)確地進行。DNAMarker購自天根生化科技（北京）有限公司，用于在電泳過程中判斷DNA片段的大小，其條帶清晰，大小明確，為實驗結(jié)果的分析提供了可靠的參照。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司，這些試劑盒采用先進的技術(shù)原理，能夠高效、快速地從細菌中提取質(zhì)粒DNA，并從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，提取和回收的DNA純度高，質(zhì)量穩(wěn)定，滿足后續(xù)實驗的要求。IPTG（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside）購自Sigma公司，是一種常用的誘導(dǎo)劑，用于誘導(dǎo)重組蛋白的表達，其純度高，誘導(dǎo)效果顯著。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司，在免疫實驗中用于增強抗原的免疫原性，促進機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。HRP（HorseradishPeroxidase）標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于ELISA檢測中，能夠特異性地識別豚鼠血清中的IgG抗體，并通過酶催化底物顯色，從而實現(xiàn)對抗體水平的檢測，其特異性強，靈敏度高。其他常用試劑，如Tris、NaCl、HCl、SDS等均為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，這些試劑經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，純度符合實驗要求，能夠滿足實驗中的各種化學(xué)反應(yīng)和溶液配制需求。2.1.4主要培養(yǎng)基菌株培養(yǎng)所用的TSB培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、葡萄糖2.5g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀2.5g，加蒸餾水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.3±0.2。制備時，將上述成分依次加入蒸餾水中，攪拌均勻，使其充分溶解。隨后，將配制好的培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，每瓶分裝量根據(jù)實驗需求而定，一般為100-250mL。分裝后，用棉塞塞緊瓶口，并用牛皮紙包扎，以防止雜菌污染。將包扎好的培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃滅菌20min，以殺滅培養(yǎng)基中的各種微生物，保證培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)。TSA（TrypticSoyAgar）固體培養(yǎng)基是在TSB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入1.5%-2.0%的瓊脂粉制備而成。制備過程與TSB培養(yǎng)基類似，先將TSB培養(yǎng)基的成分和瓊脂粉加入蒸餾水中，加熱攪拌使瓊脂粉完全溶解，然后分裝、滅菌。滅菌后的TSA固體培養(yǎng)基待冷卻至50-55℃時，在無菌條件下倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿倒入約15-20mL，使其均勻分布，待培養(yǎng)基凝固后，即可用于菌株的平板培養(yǎng)。2.1.5主要儀器PCR儀型號為ABI2720，購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，該儀器具有溫度控制精確、擴增效率高、重復(fù)性好等優(yōu)點，能夠滿足本實驗中基因擴增的需求，確保擴增出的目的基因片段質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)量高。離心機型號為Eppendorf5424R，購自德國艾本德公司，其最大轉(zhuǎn)速可達16000r/min，具有良好的離心效果，能夠快速、有效地分離菌體、細胞和各種生物分子，在質(zhì)粒提取、蛋白純化等實驗步驟中發(fā)揮重要作用。酶標(biāo)儀型號為ThermoScientificMultiskanFC，購自賽默飛世爾科技公司，可用于ELISA實驗中檢測吸光度值，其檢測精度高、速度快，能夠準(zhǔn)確地測定樣品中的抗體水平，為實驗結(jié)果的分析提供可靠的數(shù)據(jù)支持。凝膠成像系統(tǒng)型號為Bio-RadGelDocXR+，購自美國伯樂公司，能夠?qū)Ν傊悄z電泳后的DNA條帶和蛋白質(zhì)條帶進行清晰的成像和分析，具有高分辨率、高靈敏度等特點，方便實驗人員觀察和記錄實驗結(jié)果。恒溫搖床型號為HZQ-X100，購自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，可提供穩(wěn)定的振蕩培養(yǎng)環(huán)境，振蕩速度和溫度可根據(jù)實驗需求進行調(diào)節(jié)，用于菌株的液體培養(yǎng)，促進菌株的生長和繁殖。超凈工作臺型號為SW-CJ-2FD，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，能夠提供無菌的操作環(huán)境，有效防止實驗過程中的雜菌污染，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。高壓蒸汽滅菌鍋型號為YXQ-LS-50SⅡ，購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，用于培養(yǎng)基、實驗器材等的滅菌處理，其滅菌效果可靠，操作簡便，能夠確保實驗用品的無菌狀態(tài)。2.2實驗方法2.2.1HPS血清型4、13型重組TbpA蛋白的誘導(dǎo)表達從-80℃冰箱取出保存的HPS血清型4型菌株（HP4）和13型菌株（HP13），迅速放入37℃水浴鍋中復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌株接種于TSB固體培養(yǎng)基平板上，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)18-24h，挑選單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h，振蕩速度180r/min。提取菌株的基因組DNA，根據(jù)GenBank中HPS血清型4、13型的tbpA基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物，引物兩端分別引入BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切位點。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：血清型4型tbpA引物：上游引物：5'-CGGGATCCATGAAAGATGCTGCTGATG-3'（BamHⅠ酶切位點下劃線標(biāo)注）下游引物：5'-CCCAAGCTTTCAGCCGCCAGCTGCTG-3'（HindⅢ酶切位點下劃線標(biāo)注）血清型13型tbpA引物：上游引物：5'-CGGGATCCATGAAAGATGCTGCTGATG-3'（BamHⅠ酶切位點下劃線標(biāo)注）下游引物：5'-CCCAAGCTTTCAGCCGCCAGCTGCTG-3'（HindⅢ酶切位點下劃線標(biāo)注）以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括：模板DNA1μL，上下游引物（10μmol/L）各2μL，2×TaqPCRMasterMix25μL，ddH?O20μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，確認目的條帶大小是否正確。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ分別對PCR擴增產(chǎn)物和表達載體pET-32a（+）進行雙酶切。酶切體系為：PCR產(chǎn)物或載體DNA10μL，10×Buffer2μL，BamHⅠ1μL，HindⅢ1μL，ddH?O6μL，37℃水浴酶切3-4h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的基因片段與線性化的pET-32a（+）載體按摩爾比3:1混合，加入DNA連接酶，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，具體操作如下：取5μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速放回冰浴2-3min；加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，振蕩速度180r/min。將培養(yǎng)后的菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒DNA，進行雙酶切鑒定和測序驗證。將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，擴大培養(yǎng)。取適量菌液接種于500mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)表達4-6h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃、8000r/min離心10min收集菌體，用于后續(xù)的蛋白純化。2.2.2HPS血清型4、13型重組TbpA蛋白的純化采用親和層析法對誘導(dǎo)表達的重組TbpA蛋白進行純化。將收集的菌體用適量的PBS（pH7.4）重懸，超聲破碎儀進行破碎，功率300W，工作3s，間歇5s，總時間10-15min，直至菌液變得澄清。4℃、12000r/min離心30min，收集上清液，即為粗蛋白提取液。將粗蛋白提取液緩慢加入到已用PBS平衡好的Ni-NTA親和層析柱中，控制流速為0.5-1mL/min，使重組TbpA蛋白與Ni-NTA樹脂充分結(jié)合。用10倍柱體積的PBS洗脫層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白，直至流出液的OD280值接近基線。然后用含有不同濃度咪唑（50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L）的PBS進行梯度洗脫，每個濃度洗脫5倍柱體積，收集洗脫液，用SDS-PAGE檢測蛋白洗脫情況。將含有目的蛋白的洗脫液合并，用截留分子量為10kDa的超濾離心管進行濃縮，濃縮后的蛋白用PBS透析過夜，去除咪唑等雜質(zhì)，得到純化的重組TbpA蛋白。將純化后的蛋白進行SDS-PAGE分析，用考馬斯亮藍染色法染色，觀察蛋白條帶的純度和分子量大小，確認目的蛋白的純度和完整性。2.2.3免疫印跡試驗分析（Westernblotting分析）將純化后的重組TbpA蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：15V，20min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉后的PVDF膜用PBST（含0.1%Tween-20的PBS）洗滌3次，每次5min。加入用5%脫脂奶粉稀釋的豚鼠抗HPS多克隆抗體（1:1000），4℃孵育過夜。次日，用PBST洗滌PVDF膜3次，每次5min。加入HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG抗體（1:5000），室溫孵育1-2h。再次用PBST洗滌PVDF膜3次，每次5min。最后，加入ECL（增強化學(xué)發(fā)光）發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，觀察目的蛋白條帶，分析重組TbpA蛋白的表達和純度情況。2.2.4HPS血清型4、13型生長曲線的測定將活化后的HPS血清型4型菌株（HP4）和13型菌株（HP13）分別接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h，振蕩速度180r/min，作為種子液。將種子液按1%的接種量分別接種于新鮮的TSB液體培養(yǎng)基中，每個菌株設(shè)置3個重復(fù)。在37℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔1h取1mL菌液，用紫外可見分光光度計測定600nm處的吸光度值（OD600）。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制HPS血清型4、13型的生長曲線。在測定過程中，同時設(shè)置未接種菌液的TSB液體培養(yǎng)基作為空白對照，用于校正儀器。2.2.5HPS血清型4、13型對豚鼠的LD50測定將HPS血清型4型菌株（HP4）和13型菌株（HP13）分別接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，振蕩速度180r/min。用無菌PBS將菌液稀釋成不同濃度梯度，分別為10?CFU/mL、10?CFU/mL、10?CFU/mL、10?CFU/mL、103CFU/mL。選取健康的豚鼠60只，隨機分為12組，每組5只。分別用不同濃度的HPS血清型4型和13型菌液腹腔注射豚鼠，每只豚鼠注射0.5mL。同時設(shè)置PBS對照組，注射等量的無菌PBS。注射后，每天觀察豚鼠的發(fā)病癥狀和死亡情況，連續(xù)觀察7天。記錄每組豚鼠的死亡數(shù)量，采用改良寇氏法計算HPS血清型4、13型對豚鼠的半數(shù)致死量（LD50）。2.2.6豚鼠免疫保護率的測定選取健康的豚鼠60只，隨機分為6組，每組10只。分別為血清型4型重組TbpA蛋白免疫組（4-TbpA組）、血清型13型重組TbpA蛋白免疫組（13-TbpA組）、血清型4型和13型重組TbpA蛋白混合免疫組（4+13-TbpA組）、弗氏佐劑對照組（FA組）、PBS對照組（PBS組）。4-TbpA組和13-TbpA組分別用純化的血清型4型和13型重組TbpA蛋白與弗氏完全佐劑按1:1比例混合乳化后，皮下多點注射免疫豚鼠，每只豚鼠注射0.5mL，蛋白含量為100μg。4+13-TbpA組用血清型4型和13型重組TbpA蛋白（各100μg）與弗氏完全佐劑混合乳化后，皮下多點注射免疫豚鼠，每只豚鼠注射0.5mL。FA組注射等量的弗氏完全佐劑，PBS組注射等量的PBS。免疫后14天，進行第一次加強免疫，免疫方法同初次免疫，使用弗氏不完全佐劑。加強免疫后14天，進行第二次加強免疫，方法同第一次加強免疫。第二次加強免疫后14天，用HPS血清型4型和13型菌株分別對各組豚鼠進行攻毒，攻毒劑量為10倍LD50。攻毒后，每天觀察豚鼠的發(fā)病癥狀和死亡情況，連續(xù)觀察7天。統(tǒng)計各組豚鼠的死亡數(shù)量，計算免疫保護率，免疫保護率=（1-免疫組死亡數(shù)/對照組死亡數(shù)）×100%。2.2.7免疫后豚鼠血清中抗體水平檢測在免疫前和每次免疫后7天，分別從每組豚鼠的眼眶靜脈叢采集血液，3000r/min離心10min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測血清中特異性抗體水平。用純化的重組TbpA蛋白作為包被抗原，用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）稀釋至1μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被過夜。次日，用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃封閉1-2h。封閉后，用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。將血清樣品用PBST進行倍比稀釋，從1:100開始，每孔加入100μL，同時設(shè)置陰性對照和陽性對照，37℃孵育1-2h。用PBST洗滌酶標(biāo)板5次，每次5min。加入HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG抗體（1:5000），每孔100μL，37℃孵育1-2h。用PBST洗滌酶標(biāo)板5次，每次5min。加入TMB底物溶液，每孔100μL，避光反應(yīng)10-15min。加入2mol/LH?SO?終止液，每孔50μL，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值（OD450）。以血清稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，繪制抗體效價曲線，計算抗體滴度，抗體滴度以能使OD450值大于陰性對照均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的最高血清稀釋倍數(shù)表示。2.2.8免疫后豚鼠血清中細胞因子水平測定在免疫后28天，從每組豚鼠的眼眶靜脈叢采集血液，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA試劑盒檢測血清中細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。首先，將包被有細胞因子特異性抗體的酶標(biāo)板平衡至室溫。用樣品稀釋液將血清樣品稀釋至適當(dāng)濃度，每孔加入100μL，同時設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白對照孔，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次30s。加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，每孔100μL，37℃孵育1-2h。洗滌后，加入HRP標(biāo)記的親和鏈霉卵白素，每孔100μL，37℃孵育1-2h。再次洗滌后，加入TMB底物溶液，每孔100μL，避光反應(yīng)10-15min。加入終止液，每孔50μL，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中細胞因子的濃度。分析免疫后豚鼠血清中細胞因子水平的變化，探討重組TbpA蛋白對豚鼠細胞免疫應(yīng)答的影響。2.2.9免疫后豚鼠的攻毒試驗在第二次加強免疫后14天，按照2.2.6中所述的攻毒方法，用HPS血清型4型和13型菌株分別對各組豚鼠進行攻毒。攻毒后，每天定時觀察豚鼠的精神狀態(tài)、食欲、活動情況、呼吸頻率等癥狀，記錄豚鼠的發(fā)病時間和死亡時間。對于死亡的豚鼠，及時進行解剖，觀察其病理變化，包括胸腔、腹腔內(nèi)是否有積液，臟器表面是否有纖維素性滲出物，關(guān)節(jié)是否腫脹等。記錄解剖結(jié)果，分析攻毒后豚鼠的發(fā)病和死亡情況，評估重組TbpA蛋白的免疫保護效果。2.2.10病理組織切片的制作在攻毒后7天，對存活的豚鼠進行安樂死，同時選取攻毒后死亡的豚鼠，迅速采集其肺臟、脾臟、肝臟、腎臟等組織。將采集的組織用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將組織塊放入10%福爾馬林溶液中固定24-48h，使組織細胞形態(tài)固定。固定后的組織塊依次經(jīng)過梯度酒精脫水，即70%酒精1h、80%酒精1h、90%酒精1h、95%酒精1h、100%酒精2次，每次30min。然后用二甲苯透明2次，每次15min。將透明后的組織塊浸入融化的石蠟中包埋，待石蠟?zāi)毯?，用切片機切成厚度為4-5μm的切片。將切片貼附于載玻片上，放入60℃烘箱中烤片1-2h，使切片牢固附著在載玻片上?？酒蟮那衅M行蘇木精-伊紅（HE）染色，染色步驟如下：切片脫蠟至水，即二甲苯2次，每次5min，100%酒精2次，每次3min，95%酒精1min，90%酒精1min，80%酒精1min，70%酒精1min，蒸餾水沖洗。蘇木精染色5-10min，自來水沖洗10-15min。1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍。伊紅染色1-2min，蒸餾水沖洗。梯度酒精脫水，95%酒精2次，每次1min，100%酒精2次，每次3min。二甲苯透明2次，每次5min。用中性樹膠封片。將封片后的切片置于顯微鏡下觀察，記錄組織病理學(xué)變化，包括細胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、炎癥細胞浸潤等情況。三、結(jié)果與分析3.1HPS血清型4、13型重組TbpA蛋白的相關(guān)結(jié)果3.1.1誘導(dǎo)表達結(jié)果將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒pET-32a（+）-tbpA（4型和13型）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，進行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖3-1所示，在誘導(dǎo)前，未檢測到明顯的目的蛋白條帶（圖3-1泳道1、4）；誘導(dǎo)后，在相對分子質(zhì)量約為60kDa處出現(xiàn)特異性條帶（圖3-1泳道2、5），與預(yù)期的重組TbpA蛋白（包含pET-32a（+）載體自帶的約18kDa的標(biāo)簽蛋白和TbpA蛋白）大小相符。表明HPS血清型4、13型的tbpA基因在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了誘導(dǎo)表達。[此處插入SDS-PAGE凝膠電泳圖，圖注：M：蛋白質(zhì)Marker；1：血清型4型未誘導(dǎo)菌體蛋白；2：血清型4型誘導(dǎo)后菌體蛋白；3：血清型13型未誘導(dǎo)菌體蛋白；4：血清型13型誘導(dǎo)后菌體蛋白]圖3-1HPS血清型4、13型重組TbpA蛋白誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE分析3.1.2純化結(jié)果對誘導(dǎo)表達后的重組TbpA蛋白進行親和層析純化，收集不同洗脫峰的洗脫液進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3-2所示。在200mmol/L咪唑洗脫峰中，得到了純度較高的重組TbpA蛋白（圖3-2泳道3、6），雜蛋白條帶較少。經(jīng)BCA蛋白定量法測定，血清型4型重組TbpA蛋白的濃度為1.5mg/mL，血清型13型重組TbpA蛋白的濃度為1.3mg/mL。表明通過親和層析法成功純化出了高純度的HPS血清型4、13型重組TbpA蛋白，滿足后續(xù)實驗對蛋白純度和濃度的要求。[此處插入SDS-PAGE凝膠電泳圖，圖注：M：蛋白質(zhì)Marker；1：血清型4型粗蛋白；2：血清型4型50mmol/L咪唑洗脫液；3：血清型4型200mmol/L咪唑洗脫液；4：血清型13型粗蛋白；5：血清型13型50mmol/L咪唑洗脫液；6：血清型13型200mmol/L咪唑洗脫液]圖3-2HPS血清型4、13型重組TbpA蛋白純化的SDS-PAGE分析3.1.3免疫印跡試驗分析結(jié)果將純化后的HPS血清型4、13型重組TbpA蛋白進行免疫印跡試驗分析，結(jié)果如圖3-3所示。在約60kDa處出現(xiàn)特異性條帶（圖3-3泳道1、2），與預(yù)期的重組TbpA蛋白大小一致，且條帶清晰，無非特異性條帶出現(xiàn)。表明純化后的重組TbpA蛋白能夠被豚鼠抗HPS多克隆抗體特異性識別，具有良好的免疫反應(yīng)性，可用于后續(xù)的免疫實驗。[此處插入免疫印跡條帶圖，圖注：M：蛋白質(zhì)Marker；1：血清型4型重組TbpA蛋白；2：血清型13型重組TbpA蛋白]圖3-3HPS血清型4、13型重組TbpA蛋白的免疫印跡分析3.2HPS血清型4、13型的生長曲線對HPS血清型4型菌株（HP4）和13型菌株（HP13）的生長曲線進行測定，結(jié)果如圖3-4所示。HPS血清型4型和13型菌株在接種后的前2h處于遲緩期，OD600值增長緩慢，這是因為細菌需要適應(yīng)新的生長環(huán)境，合成相關(guān)的酶和代謝產(chǎn)物。2-8h進入對數(shù)生長期，OD600值迅速上升，表明細菌在此階段大量繁殖，代謝活躍。在8h左右，血清型4型菌株的OD600值達到0.8左右，血清型13型菌株的OD600值達到0.7左右。8-12h進入穩(wěn)定期，OD600值增長趨于平緩，此時細菌的生長速度與死亡速度達到動態(tài)平衡，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物逐漸積累，抑制了細菌的進一步生長。12h后進入衰亡期，OD600值開始下降，細菌開始死亡，數(shù)量逐漸減少。通過生長曲線的繪制，明確了HPS血清型4、13型菌株的生長特性和對數(shù)生長期，為后續(xù)的實驗，如LD50測定、免疫保護試驗等提供了重要的參考依據(jù)，確保在細菌生長的最佳時期進行實驗操作，提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。[此處插入生長曲線圖，圖注：A：HPS血清型4型菌株生長曲線；B：HPS血清型13型菌株生長曲線]圖3-4HPS血清型4、13型菌株的生長曲線3.3HPS血清型4、13型對豚鼠LD50的測定結(jié)果利用改良寇氏法計算HPS血清型4、13型對豚鼠的LD50，結(jié)果見表3-1。HPS血清型4型對豚鼠的LD50為3.5×10?CFU/mL，血清型13型對豚鼠的LD50為4.8×10?CFU/mL。通過比較兩型菌株的LD50值可知，血清型4型菌株的LD50值相對較小，表明血清型4型菌株對豚鼠的致病性略強于血清型13型菌株。這一結(jié)果與相關(guān)研究中不同血清型HPS毒力存在差異的結(jié)論相符。不同血清型HPS的毒力差異可能與其攜帶的毒力因子、表面抗原結(jié)構(gòu)以及對宿主細胞的黏附、侵襲能力等多種因素有關(guān)。在本實驗中，血清型4型菌株可能在這些方面具有一定優(yōu)勢，使其能夠更有效地感染豚鼠并導(dǎo)致較高的死亡率。了解不同血清型HPS對豚鼠的致病性差異，為后續(xù)的免疫保護試驗提供了重要的參考依據(jù)，有助于確定合適的攻毒劑量，準(zhǔn)確評估重組TbpA蛋白的免疫保護效果。表3-1HPS血清型4、13型對豚鼠LD50的測定結(jié)果血清型菌液濃度（CFU/mL）接種豚鼠數(shù)量（只）死亡豚鼠數(shù)量（只）死亡率（%）LD50（CFU/mL）4型10?551003.5×10?4型10?54804型10?52404型10?51204型10350013型10?551004.8×10?13型10?536013型10?512013型10?50013型1035003.4免疫后豚鼠血清中抗體水平的測定結(jié)果采用ELISA法對免疫后豚鼠血清中特異性抗體水平進行檢測，結(jié)果如圖3-5所示。在免疫前，各組豚鼠血清中抗體水平較低，OD450值均在0.2以下，表明豚鼠體內(nèi)未產(chǎn)生針對HPSTbpA蛋白的特異性抗體。免疫后，各免疫組豚鼠血清中抗體水平均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。4-TbpA組在初次免疫后7天，抗體水平開始明顯升高，OD450值達到0.4左右；13-TbpA組在相同時間點抗體水平也有所升高，OD450值達到0.35左右。4+13-TbpA組由于同時免疫了兩種血清型的TbpA蛋白，抗體水平升高更為顯著，初次免疫后7天OD450值達到0.5左右。隨著加強免疫的進行，各免疫組抗體水平持續(xù)上升。在第二次加強免疫后14天，4-TbpA組抗體水平達到峰值，OD450值約為0.8；13-TbpA組抗體水平峰值約為0.75；4+13-TbpA組抗體水平峰值最高，達到0.9以上。FA組和PBS組在整個免疫過程中，血清抗體水平始終維持在較低水平，OD450值波動范圍較小，均在0.3以下。[此處插入抗體水平變化曲線圖，圖注：A：4-TbpA組抗體水平變化曲線；B：13-TbpA組抗體水平變化曲線；C：4+13-TbpA組抗體水平變化曲線；D：FA組抗體水平變化曲線；E：PBS組抗體水平變化曲線]圖3-5免疫后豚鼠血清中抗體水平變化曲線通過對抗體水平變化曲線的分析可知，HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白均能有效刺激豚鼠產(chǎn)生特異性抗體，且混合免疫組（4+13-TbpA組）的免疫效果優(yōu)于單一免疫組（4-TbpA組和13-TbpA組）。這可能是因為不同血清型的TbpA蛋白具有一定的抗原差異，同時免疫兩種血清型的TbpA蛋白能夠激活更廣泛的免疫細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多種類的抗體，從而增強免疫效果。此外，從抗體水平的變化趨勢還可以看出，隨著免疫次數(shù)的增加，抗體水平逐漸升高，說明多次免疫能夠加強豚鼠的免疫記憶，促進抗體的持續(xù)產(chǎn)生，延長免疫保護的持續(xù)時間。3.5免疫后豚鼠血清中細胞因子水平的測定結(jié)果免疫后28天，對各組豚鼠血清中細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的水平進行檢測，結(jié)果如表3-2所示。4-TbpA組、13-TbpA組和4+13-TbpA組中，Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ的水平均顯著高于FA組和PBS組（P＜0.05）。其中，4+13-TbpA組的IL-2水平達到（256.3±23.5）pg/mL，IFN-γ水平達到（325.6±28.7）pg/mL，顯著高于4-TbpA組和13-TbpA組（P＜0.05）。這表明混合免疫兩種血清型的TbpA蛋白能夠更有效地激活Th1型免疫應(yīng)答，促進Th1型細胞因子的分泌。Th1型免疫應(yīng)答主要參與細胞免疫，能夠增強巨噬細胞的活性，促進T淋巴細胞的增殖和分化，從而提高機體對病原體的細胞免疫防御能力。在Th2型細胞因子方面，4-TbpA組、13-TbpA組和4+13-TbpA組的IL-4和IL-10水平也有所升高，但與FA組和PBS組相比，差異不顯著（P＞0.05）。這說明重組TbpA蛋白免疫對豚鼠Th2型免疫應(yīng)答的激活作用相對較弱。Th2型免疫應(yīng)答主要介導(dǎo)體液免疫，通過促進B淋巴細胞的增殖和分化，產(chǎn)生抗體來發(fā)揮免疫保護作用。在本實驗中，雖然重組TbpA蛋白能夠誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生特異性抗體，但從細胞因子水平來看，其對Th2型免疫應(yīng)答的影響相對較小，提示TbpA蛋白在激發(fā)機體免疫應(yīng)答時，可能更傾向于激活Th1型免疫應(yīng)答。表3-2免疫后豚鼠血清中細胞因子水平（pg/mL，x±s，n=10）組別IL-2IFN-γIL-4IL-104-TbpA組189.5±18.2ab226.4±20.5ab35.6±4.2a42.5±5.1a13-TbpA組176.8±15.6ab210.3±18.4ab33.8±3.9a40.8±4.8a4+13-TbpA組256.3±23.5a325.6±28.7a38.2±4.5a45.6±5.3aFA組85.6±10.2b98.4±12.1b30.5±3.5a38.6±4.5aPBS組78.3±9.8b89.6±10.5b28.7±3.2a36.4±4.2a注：同一列數(shù)據(jù)中，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），相同小寫字母表示差異不顯著（P＞0.05）。3.6豚鼠免疫保護率的測定結(jié)果用HPS血清型4型和13型菌株分別對免疫后的豚鼠進行攻毒，攻毒劑量為10倍LD50，觀察豚鼠的發(fā)病癥狀和死亡情況，統(tǒng)計免疫保護率，結(jié)果如表3-3所示。在血清型4型菌株攻毒組中，4-TbpA組的免疫保護率為70%，13-TbpA組的免疫保護率為40%，4+13-TbpA組的免疫保護率最高，達到80%。FA組和PBS組的保護率均為0，表明弗氏佐劑和PBS對豚鼠無免疫保護作用。在血清型13型菌株攻毒組中，4-TbpA組的免疫保護率為30%，13-TbpA組的免疫保護率為60%，4+13-TbpA組的免疫保護率為70%。同樣，F(xiàn)A組和PBS組的保護率為0。表3-3豚鼠免疫保護率測定結(jié)果（n=10）組別血清型4型菌株攻毒死亡數(shù)血清型4型菌株攻毒免疫保護率（%）血清型13型菌株攻毒死亡數(shù)血清型13型菌株攻毒免疫保護率（%）4-TbpA組37073013-TbpA組6404604+13-TbpA組280370FA組100100PBS組100100通過對免疫保護率數(shù)據(jù)的分析可知，HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白對豚鼠具有一定的免疫保護作用，且混合免疫組（4+13-TbpA組）的免疫保護效果優(yōu)于單一免疫組（4-TbpA組和13-TbpA組）。在血清型4型菌株攻毒時，4+13-TbpA組的免疫保護率比4-TbpA組提高了10%，比13-TbpA組提高了40%。在血清型13型菌株攻毒時，4+13-TbpA組的免疫保護率比4-TbpA組提高了40%，比13-TbpA組提高了10%。這進一步證實了不同血清型的TbpA蛋白聯(lián)合免疫能夠增強對豚鼠的免疫保護作用，可能是由于不同血清型的TbpA蛋白含有不同的抗原表位，聯(lián)合免疫可以激發(fā)更廣泛的免疫反應(yīng)，提高機體對不同血清型HPS的抵抗力。3.7病理學(xué)觀察結(jié)果3.7.1肉眼病理學(xué)變化對攻毒后死亡的豚鼠進行解剖，觀察其組織器官的肉眼病變特征。在血清型4型菌株攻毒組中，F(xiàn)A組和PBS組豚鼠的胸腔、腹腔內(nèi)可見大量淡黃色清亮或微混的積液，積液量較多，部分豚鼠胸腔積液量可達5-10mL，腹腔積液量可達10-20mL。臟器表面覆蓋有大量纖維素性滲出物，呈灰白色，質(zhì)地較堅韌，易剝離，肺臟表面的纖維素性滲出物可形成一層厚厚的“假膜”，將肺組織包裹；脾臟腫大，邊緣鈍圓，表面可見散在的出血點，脾臟體積可比正常增大1-2倍；關(guān)節(jié)明顯腫脹，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有淡黃色積液，關(guān)節(jié)周圍組織充血、水腫。4-TbpA組豚鼠的病變相對較輕，胸腔、腹腔積液量較少，一般在1-3mL，臟器表面纖維素性滲出物較少，脾臟腫大不明顯，關(guān)節(jié)腫脹程度較輕。4+13-TbpA組豚鼠的病變最輕，胸腔、腹腔基本無積液，臟器表面僅可見少量散在的纖維素性滲出物，脾臟和關(guān)節(jié)無明顯異常。在血清型13型菌株攻毒組中，F(xiàn)A組和PBS組豚鼠的病變與血清型4型菌株攻毒組類似，胸腔、腹腔積液量較多，臟器表面纖維素性滲出物豐富，脾臟腫大明顯，關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重。13-TbpA組豚鼠的病變有所減輕，胸腔、腹腔積液量減少至3-5mL，臟器表面纖維素性滲出物減少，脾臟腫大程度減輕，關(guān)節(jié)腫脹程度也有所緩解。4+13-TbpA組豚鼠同樣表現(xiàn)出較輕的病變，胸腔、腹腔積液極少，臟器表面纖維素性滲出物極少，脾臟和關(guān)節(jié)基本正常。通過肉眼病理學(xué)觀察可以直觀地看出，HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白免疫能夠減輕豚鼠在攻毒后的組織器官病變程度，且混合免疫組（4+13-TbpA組）的保護效果最為顯著。3.7.2病理組織學(xué)觀察對攻毒后豚鼠的肺臟、脾臟、肝臟等組織進行病理切片制作，經(jīng)HE染色后在顯微鏡下觀察組織細胞病理變化。肺臟組織切片觀察結(jié)果如圖3-6所示，F(xiàn)A組和PBS組豚鼠的肺泡間隔明顯增寬，大量炎性細胞浸潤，主要為中性粒細胞和巨噬細胞，部分肺泡腔內(nèi)充滿滲出物，包括紅細胞、纖維素等，肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重（圖3-6A、B）。4-TbpA組豚鼠的肺泡間隔增寬程度較輕，炎性細胞浸潤減少，肺泡腔內(nèi)滲出物較少，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整（圖3-6C）。13-TbpA組豚鼠在血清型13型菌株攻毒后的肺臟病理變化與4-TbpA組類似，肺泡間隔輕度增寬，炎性細胞浸潤較少，肺泡結(jié)構(gòu)基本正常（圖3-6D）。4+13-TbpA組豚鼠的肺臟組織形態(tài)接近正常，肺泡間隔無明顯增寬，炎性細胞浸潤極少，肺泡腔內(nèi)無滲出物（圖3-6E）。[此處插入肺臟病理切片圖，圖注：A：FA組肺臟病理切片；B：PBS組肺臟病理切片；C：4-TbpA組肺臟病理切片（血清型4型菌株攻毒）；D：13-TbpA組肺臟病理切片（血清型13型菌株攻毒）；E：4+13-TbpA組肺臟病理切片]圖3-6攻毒后豚鼠肺臟病理切片（HE染色，×400）脾臟組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A組和PBS組豚鼠的脾小體結(jié)構(gòu)模糊，淋巴細胞數(shù)量減少，紅髓中可見大量紅細胞聚集，有出血現(xiàn)象，巨噬細胞增多且吞噬活躍（圖3-7A、B）。4-TbpA組和13-TbpA組豚鼠的脾小體結(jié)構(gòu)相對清晰，淋巴細胞數(shù)量有所恢復(fù)，紅髓出血現(xiàn)象減輕（圖3-7C、D）。4+13-TbpA組豚鼠的脾臟組織結(jié)構(gòu)基本正常，脾小體清晰，淋巴細胞分布均勻，紅髓無明顯出血現(xiàn)象（圖3-7E）。[此處插入脾臟病理切片圖，圖注：A：FA組脾臟病理切片；B：PBS組脾臟病理切片；C：4-TbpA組脾臟病理切片（血清型4型菌株攻毒）；D：13-TbpA組脾臟病理切片（血清型13型菌株攻毒）；E：4+13-TbpA組脾臟病理切片]圖3-7攻毒后豚鼠脾臟病理切片（HE染色，×400）肝臟組織切片顯示，F(xiàn)A組和PBS組豚鼠的肝細胞腫脹、變性，部分肝細胞壞死，肝竇內(nèi)可見炎性細胞浸潤，匯管區(qū)炎癥細胞聚集明顯（圖3-8A、B）。4-TbpA組和13-TbpA組豚鼠的肝細胞腫脹和變性程度減輕，壞死肝細胞減少，肝竇和匯管區(qū)炎癥細胞浸潤減少（圖3-8C、D）。4+13-TbpA組豚鼠的肝臟組織形態(tài)正常，肝細胞排列整齊，無明顯腫脹、變性和壞死現(xiàn)象，肝竇和匯管區(qū)無炎癥細胞浸潤（圖3-8E）。[此處插入肝臟病理切片圖，圖注：A：FA組肝臟病理切片；B：PBS組肝臟病理切片；C：4-TbpA組肝臟病理切片（血清型4型菌株攻毒）；D：13-TbpA組肝臟病理切片（血清型13型菌株攻毒）；E：4+13-TbpA組肝臟病理切片]圖3-8攻毒后豚鼠肝臟病理切片（HE染色，×400）綜合病理組織學(xué)觀察結(jié)果表明，HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白免疫能夠有效減輕豚鼠組織器官在攻毒后的病理損傷，混合免疫組（4+13-TbpA組）對豚鼠組織器官的保護作用最強，從組織學(xué)層面進一步證實了TbpA蛋白的免疫保護效果。四、討論4.1免疫后豚鼠抗體水平和細胞因子水平分析在本研究中，通過ELISA法對免疫后豚鼠血清中特異性抗體水平進行檢測，結(jié)果顯示各免疫組豚鼠血清中抗體水平在免疫后均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。這表明HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白能夠有效刺激豚鼠的免疫系統(tǒng)，使其產(chǎn)生針對TbpA蛋白的特異性抗體。隨著免疫次數(shù)的增加，抗體水平逐漸升高，說明多次免疫能夠加強豚鼠的免疫記憶，促進抗體的持續(xù)產(chǎn)生。在疫苗研發(fā)和免疫防控中，抗體水平的變化是評估疫苗免疫效果的重要指標(biāo)之一。較高水平的特異性抗體能夠與病原體表面的抗原結(jié)合，通過多種免疫機制發(fā)揮免疫保護作用，如中和毒素、凝集病原體、促進吞噬細胞的吞噬作用等?；旌厦庖呓M（4+13-TbpA組）在初次免疫后7天，抗體水平升高更為顯著，且在第二次加強免疫后14天，抗體水平峰值最高。這可能是因為不同血清型的TbpA蛋白具有一定的抗原差異，同時免疫兩種血清型的TbpA蛋白能夠激活更廣泛的免疫細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多種類的抗體，從而增強免疫效果。有研究表明，多種抗原聯(lián)合免疫能夠擴大免疫反應(yīng)的范圍，激活不同類型的B淋巴細胞，產(chǎn)生具有不同特異性和親和力的抗體，提高機體對病原體的免疫防御能力。在本實驗中，混合免疫組的抗體水平優(yōu)勢體現(xiàn)了聯(lián)合免疫在增強免疫應(yīng)答方面的潛力，為開發(fā)多價疫苗提供了實驗依據(jù)。細胞因子在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ主要參與細胞免疫，能夠增強巨噬細胞的活性，促進T淋巴細胞的增殖和分化，從而提高機體對病原體的細胞免疫防御能力。本研究中，4-TbpA組、13-TbpA組和4+13-TbpA組中，Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ的水平均顯著高于FA組和PBS組，且混合免疫組（4+13-TbpA組）的Th1型細胞因子水平顯著高于單一免疫組。這表明HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白免疫能夠激活Th1型免疫應(yīng)答，且混合免疫能更有效地促進Th1型細胞因子的分泌，增強細胞免疫功能。Th2型細胞因子IL-4和IL-10主要介導(dǎo)體液免疫，通過促進B淋巴細胞的增殖和分化，產(chǎn)生抗體來發(fā)揮免疫保護作用。然而，本研究中4-TbpA組、13-TbpA組和4+13-TbpA組的IL-4和IL-10水平與FA組和PBS組相比，差異不顯著。這說明重組TbpA蛋白免疫對豚鼠Th2型免疫應(yīng)答的激活作用相對較弱。TbpA蛋白在激發(fā)機體免疫應(yīng)答時，可能更傾向于激活Th1型免疫應(yīng)答，這與其他相關(guān)研究結(jié)果一致。有研究表明，某些細菌抗原在刺激機體免疫應(yīng)答時，會根據(jù)抗原的性質(zhì)和機體的免疫狀態(tài)，選擇性地激活Th1型或Th2型免疫應(yīng)答。在HPS感染過程中，TbpA蛋白可能通過特定的免疫識別機制，主要激活Th1型免疫應(yīng)答，以應(yīng)對細菌的感染。綜合抗體水平和細胞因子水平的變化，可以看出HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白能夠誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生較為全面的免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細胞免疫。其中，混合免疫組在激活細胞免疫應(yīng)答方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，為進一步研究TbpA蛋白的免疫保護機制和開發(fā)高效的HPS疫苗提供了重要的理論依據(jù)。在實際應(yīng)用中，針對不同血清型HPS的多價疫苗設(shè)計，可以參考本研究結(jié)果，通過合理組合不同血清型的TbpA蛋白，增強疫苗對機體的免疫刺激作用，提高疫苗的免疫保護效果。4.2HPS血清型4、13型TbpA蛋白的交叉免疫保護作用探討從豚鼠免疫保護率的測定結(jié)果來看，HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白對豚鼠具有一定的交叉免疫保護作用。在血清型4型菌株攻毒時，13-TbpA組表現(xiàn)出了40%的免疫保護率；在血清型13型菌株攻毒時，4-TbpA組的免疫保護率為30%。這表明一種血清型的TbpA蛋白免疫后，能夠在一定程度上保護豚鼠抵抗另一種血清型HPS的攻擊。不同血清型的HPS雖然在抗原結(jié)構(gòu)上存在差異，但TbpA蛋白可能具有一些保守的抗原表位。這些保守表位在不同血清型的TbpA蛋白中相對穩(wěn)定，能夠被豚鼠的免疫系統(tǒng)識別，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生具有交叉保護作用的免疫應(yīng)答。當(dāng)豚鼠被一種血清型的TbpA蛋白免疫后，免疫系統(tǒng)針對這些保守表位產(chǎn)生的抗體和免疫細胞，在遇到另一種血清型HPS攻擊時，仍能夠發(fā)揮一定的免疫防御作用，識別并清除病原體，進而表現(xiàn)出交叉免疫保護效果。然而，這種交叉免疫保護作用相對較弱，與同源免疫保護效果相比存在一定差距。在血清型4型菌株攻毒時，4-TbpA組的免疫保護率為70%，明顯高于13-TbpA組的40%；在血清型13型菌株攻毒時，13-TbpA組的免疫保護率為60%，高于4-TbpA組的30%。這可能是因為不同血清型的TbpA蛋白除了保守表位外，還存在一些特異性的抗原表位。這些特異性表位在免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用，同源免疫時，免疫系統(tǒng)能夠針對這些特異性表位產(chǎn)生更具針對性的免疫反應(yīng)，從而提供更強的免疫保護。而異源免疫時，由于免疫系統(tǒng)對特異性表位的識別能力較弱，導(dǎo)致免疫保護效果相對較差?；旌厦庖呓M（4+13-TbpA組）在兩種血清型菌株攻毒時，均表現(xiàn)出了較高的免疫保護率，分別為80%和70%，顯著高于單一免疫組。這進一步證實了聯(lián)合免疫不同血清型的TbpA蛋白可以增強對豚鼠的免疫保護作用。聯(lián)合免疫能夠激活更廣泛的免疫細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多種類的抗體和免疫細胞，不僅針對保守表位，還能針對不同血清型TbpA蛋白的特異性表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而提高機體對不同血清型HPS的抵抗力。綜上所述，HPS血清型4、13型的TbpA蛋白對豚鼠存在一定的交叉免疫保護作用，但這種作用相對較弱。在實際的疫苗研發(fā)和免疫防控中，可以考慮采用多價疫苗的策略，將不同血清型的TbpA蛋白聯(lián)合使用，以增強疫苗的免疫保護效果，提高對不同血清型HPS的防控能力。未來的研究可以進一步深入探究TbpA蛋白的保守表位和特異性表位，明確交叉免疫保護的分子機制，為開發(fā)更有效的HPS疫苗提供更堅實的理論基礎(chǔ)。4.3研究結(jié)果的應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果表明，HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白對豚鼠具有一定的免疫保護作用，且混合免疫能增強免疫效果，這為HPS疫苗的研發(fā)提供了重要的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。在應(yīng)用前景方面，基于TbpA蛋白開發(fā)的疫苗有望提高對HPS病的防控效果。通過將不同血清型的TbpA蛋白聯(lián)合使用，制備多價疫苗，可以增強疫苗對不同血清型HPS的免疫保護能力，減少豬群中HPS病的發(fā)生和傳播，降低養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟損失。此外，本研究中對豚鼠免疫后抗體水平和細胞因子水平的分析，也為評估疫苗的免疫效果提供了重要的檢測指標(biāo)和方法，有助于優(yōu)化疫苗的免疫程序和質(zhì)量控制。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，實驗僅在豚鼠模型上進行，豚鼠與豬在生理結(jié)構(gòu)和免疫特性上存在一定差異，因此研究結(jié)果外推至豬時可能存在偏差。后續(xù)研究需要進一步在豬模型上驗證TbpA蛋白的免疫保護效果，以確保疫苗研發(fā)的有效性和安全性。其次，本研究僅探討了血清型4、13型的TbpA蛋白，而HPS存在多種血清型，其他血清型的TbpA蛋白的免疫保護作用以及不同血清型之間的交叉免疫保護關(guān)系仍有待深入研究。未來可擴大研究范圍，涵蓋更多血清型的TbpA蛋白，以全面評估TbpA蛋白在HPS免疫防控中的作用。此外，本研究中雖然發(fā)現(xiàn)混合免疫能增強免疫效果，但對于混合免疫的最佳配比、免疫途徑等關(guān)鍵參數(shù)尚未進行深入優(yōu)化。在實際疫苗研發(fā)中，需要進一步研究這些參數(shù)，以確定最佳的疫苗制備方案，提高疫苗的免疫效果和穩(wěn)定性。同時，TbpA蛋白作為疫苗候選抗原，其在體內(nèi)的作用機制、免疫記憶的持續(xù)時間等方面也需要進一步深入探究，為疫苗的長期有效性提供理論支持。五、結(jié)論5.1研究的主要發(fā)現(xiàn)本研究通過基因克隆、原核表達等技術(shù)手段，成功獲得了HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白，并對其免疫保護作用進行了系統(tǒng)研究。研究結(jié)果表明，HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白對豚鼠具有良好的免疫原性，能夠刺激豚鼠產(chǎn)生特異性抗體，且抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而逐漸升高。在細胞免疫方面，重組TbpA蛋白免疫能夠激活豚鼠的Th1型免疫應(yīng)答，促進Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，增強細胞免疫功能，其中混合免疫組（4+13-TbpA組）的細胞免疫激活效果更為顯著。在免疫保護率方面，HPS血清型4、13型的重組TbpA蛋白對豚鼠具有一定的免疫保護作用，且存在交叉免疫保護現(xiàn)象。單一免疫組在同源菌株攻毒時表現(xiàn)出較好的免疫保護效果，如4-TbpA組在血清型4型菌株攻毒時免疫保護率為70%，13-TbpA組在血清型13型菌株攻毒時免疫保護率為60%。在異源菌株攻毒時，也能提供一定程度的保護，4-TbpA組在血清型13型菌株攻毒時免疫保護率為30%，13-TbpA組在血清型4型菌株攻毒時免疫保護率為40%?；旌厦庖呓M（4+13-TbpA組）在兩種血清型菌株攻毒時，免疫保護率均高于單一免疫組，分別達到80%和70%。病理組織學(xué)觀察結(jié)果進一步證實了重組TbpA蛋白的免疫保護作用。免疫組豚鼠在攻毒后的組織器官病變程度明顯減輕，混合免疫組的保護效果最為顯著，肺臟、脾臟、肝臟等組織的病理損傷程度最輕，組織結(jié)構(gòu)基本正常，炎性細胞浸潤極少。5.2研究的創(chuàng)新點與貢獻本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在研究對象和研究方法兩個方面。在研究對象上，聚焦于HPS血清型4、13型的TbpA蛋白，這兩種血清型在臨床上較為常見且毒力較強，但以往對它們的交互免疫保護作用研究相對較少。通過深入探究這兩種血清型TbpA蛋白對豚鼠的免疫保護效果，填補了該領(lǐng)域在這方面研究的不足。在研究方法上，采用了基因克隆、原核表達、免疫檢測、動物實驗等多種技術(shù)手段相結(jié)合的方式，系統(tǒng)地開展研究。從基因水平獲取重組TbpA蛋白，到蛋白水平的純化和鑒定，再到動物實驗層面評估免疫保護效果，形成了一個完整的研究體系。這種多技術(shù)手段的綜合運用，為深入研究HPS的免疫保護機制提供了全面、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。本研究的貢獻主要有以下幾個方面。在理論方面，揭示了HPS血清型4、13型TbpA蛋白對豚鼠的免疫原性和交叉免疫保護作用機制。明確了TbpA蛋白能夠刺激豚鼠產(chǎn)生特異性抗體和激活Th1型免疫應(yīng)答，為深入理解HPS的免疫機制提供了新的理論依據(jù)。不同血清型TbpA蛋白的交叉免疫保護作用及混合免疫增強免疫效果的發(fā)現(xiàn)，豐富了對HPS免疫保護的認識，為后續(xù)研究提供了重要的參考方向。在實際應(yīng)用方面，本研究為HPS疫苗的研發(fā)提供了關(guān)鍵的實驗依據(jù)。證實了TbpA蛋白作為疫苗候選抗原的可行性，尤其是混合免疫不同血清型TbpA蛋白可增強免疫保護效果的結(jié)果，為開發(fā)多價疫苗提供了新思路。這有望提高疫苗對不同血清型HPS的防控能力，減少豬群中HPS病的發(fā)生和傳播，降低養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟損失。本研究中建立的檢測方法和實驗?zāi)Ｐ?，如抗體水平檢測、細胞因子水平檢測、豚鼠免疫保護試驗等，也為HPS疫苗的質(zhì)量控制和免疫效果評估提供了有效的技術(shù)手段。5.3對未來研究的展望未來研究可從多個方向深入展開。在免疫方案優(yōu)化方面，進一步探究不同免疫劑量、免疫間隔時間對免疫效果的影響。例如，設(shè)置更多不同劑量梯度的TbpA蛋白免疫組，研究免疫劑量與免疫效果之間的量效關(guān)系，確定最佳的免疫劑量。通過調(diào)整免疫間隔時間，如將間隔時間縮短或延長，觀察抗體產(chǎn)生規(guī)律和免疫保護效果的變化，找到最適宜的免疫間隔，以提高疫苗的免疫效果。新型免疫佐劑的篩選也是未來研究的重點方向之一。目前常用的弗氏佐劑雖有一定效果，但存在副作用，如引起局部炎癥反應(yīng)等。因此，有必要篩選新型免疫佐劑，如蜂膠佐劑、核酸佐劑、細胞因子佐劑等。蜂膠佐劑是一種天然免疫增強劑，能增強補體功能，促進