HLA-E在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)特征、作用機(jī)制及預(yù)后價值研究一、引言1.1研究背景與意義肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）作為一種常見且惡性程度高的原發(fā)性肝癌類型，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)統(tǒng)計，全球每年肝癌新發(fā)病例超過80萬，死亡病例約78萬，而HCC在其中占據(jù)了相當(dāng)大的比例。在中國，由于乙肝病毒（HBV）感染的高流行率等因素，肝癌的發(fā)病率和死亡率一直居高不下。HCC起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)切除等根治性治療的機(jī)會，5年生存率僅為12%-18%。而且，HCC具有易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點，即使接受了手術(shù)切除、肝移植等治療，術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高，這進(jìn)一步降低了患者的生存質(zhì)量和生存期，給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。腫瘤免疫逃逸是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，從而得以持續(xù)生長和擴(kuò)散。在腫瘤免疫逃逸機(jī)制的研究中，人類白細(xì)胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）系統(tǒng)起著至關(guān)重要的作用。HLA分子參與抗原提呈過程，將腫瘤抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。其中，HLA-E作為非經(jīng)典的HLAⅠ類分子，其獨特的結(jié)構(gòu)和功能使其在腫瘤免疫逃逸中扮演著特殊的角色。HLA-E主要表達(dá)于胎盤、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，其表達(dá)水平受到多種因素的調(diào)控。在腫瘤微環(huán)境中，HLA-E的表達(dá)變化與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸密切相關(guān)。一方面，HLA-E可以與自然殺傷細(xì)胞（naturalkillercell，NK細(xì)胞）表面的抑制性受體CD94/NKG2A結(jié)合，傳遞抑制信號，抑制NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性；另一方面，HLA-E還可能影響T淋巴細(xì)胞的活化和功能，進(jìn)一步削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。深入研究HLA-E在HCC中的表達(dá)情況，有助于揭示HCC免疫逃逸的分子機(jī)制，為開發(fā)新的免疫治療策略提供理論依據(jù)。通過對HLA-E表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，可以尋找潛在的治療靶點，設(shè)計針對HLA-E的靶向治療藥物，打破腫瘤免疫逃逸，增強(qiáng)機(jī)體對HCC的免疫監(jiān)視和殺傷能力。此外，HLA-E的表達(dá)水平還可能作為HCC預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。通過檢測HCC患者腫瘤組織或血液中HLA-E的表達(dá)，能夠更準(zhǔn)確地評估患者的預(yù)后情況，為臨床治療方案的選擇提供參考。例如，對于HLA-E高表達(dá)的患者，提示其腫瘤免疫逃逸能力較強(qiáng)，預(yù)后可能較差，臨床醫(yī)生可以據(jù)此制定更積極的治療方案，如聯(lián)合免疫治療等；而對于HLA-E低表達(dá)的患者，則可以根據(jù)其他因素選擇更合適的治療方法，避免過度治療。因此，研究HLA-E在HCC中的表達(dá)及預(yù)后意義具有重要的臨床價值和現(xiàn)實意義。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究HLA-E在肝細(xì)胞性肝癌（HCC）中的表達(dá)水平、分布特征，分析其與HCC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系，并初步探討HLA-E在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為HCC的免疫治療提供新的靶點和理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下：檢測HLA-E在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)：收集HCC患者手術(shù)切除的腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，運用免疫組織化學(xué)染色（IHC）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting）和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)，從蛋白和mRNA水平檢測HLA-E的表達(dá)情況，比較HLA-E在HCC組織與癌旁組織中的表達(dá)差異，分析其表達(dá)差異與HCC臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、血管侵犯等）之間的相關(guān)性。分析HLA-E表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系：通過對HCC患者進(jìn)行長期隨訪，收集患者的生存數(shù)據(jù)，運用統(tǒng)計學(xué)方法分析HLA-E表達(dá)水平與患者總生存期（OS）、無病生存期（DFS）等預(yù)后指標(biāo)之間的關(guān)系，構(gòu)建生存曲線，評估HLA-E作為HCC預(yù)后生物標(biāo)志物的價值。同時，結(jié)合其他臨床病理因素，采用多因素分析方法，確定影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。探討HLA-E在HCC免疫逃逸中的作用機(jī)制：利用體外細(xì)胞實驗，選取HCC細(xì)胞系，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)或下調(diào)HCC細(xì)胞中HLA-E的表達(dá)，研究其對NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能的影響，包括免疫細(xì)胞的增殖、活化、細(xì)胞毒性等方面。采用流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、細(xì)胞共培養(yǎng)等實驗方法，檢測免疫細(xì)胞表面相關(guān)受體的表達(dá)變化以及細(xì)胞因子的分泌水平，探討HLA-E與免疫細(xì)胞表面受體之間的相互作用機(jī)制，揭示HLA-E在HCC免疫逃逸過程中的具體作用途徑。本研究的創(chuàng)新點在于綜合運用多種技術(shù)手段，從臨床標(biāo)本、細(xì)胞水平全面研究HLA-E在HCC中的表達(dá)及預(yù)后意義，并深入探討其作用機(jī)制。以往的研究大多僅關(guān)注HLA-E在腫瘤組織中的表達(dá)情況，缺乏對其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后關(guān)系的系統(tǒng)分析，且在作用機(jī)制研究方面不夠深入。本研究不僅能夠為HCC的預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志物，還可能為HCC的免疫治療開辟新的方向，具有重要的理論和實踐意義。二、肝細(xì)胞性肝癌概述2.1肝細(xì)胞性肝癌的流行病學(xué)特征肝細(xì)胞性肝癌（HCC）是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。在全球癌癥負(fù)擔(dān)中，肝癌占據(jù)著重要地位。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例，分別位居惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第6位和第3位。而HCC在原發(fā)性肝癌中占比高達(dá)80%-90%，是肝癌的主要病理類型。在全球范圍內(nèi)，HCC的發(fā)病率存在明顯的地區(qū)差異。東亞和非洲撒哈拉以南地區(qū)是HCC的高發(fā)區(qū)。例如，中國作為人口大國，同時也是HCC的高發(fā)國家。據(jù)國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2020年中國肝癌新發(fā)病例約41萬例，死亡病例約39.1萬例，新發(fā)病例和死亡病例均占全球肝癌病例的一半左右。在我國，肝癌發(fā)病率男性高于女性，男女發(fā)病比例約為2-3:1。從年齡分布來看，HCC可發(fā)生于各個年齡段，但以中老年人為主，發(fā)病高峰年齡在40-60歲。近年來，全球HCC的發(fā)病率總體呈現(xiàn)出一定的變化趨勢。在過去的幾十年里，部分國家和地區(qū)由于乙肝疫苗的廣泛接種、抗病毒治療的普及以及公共衛(wèi)生條件的改善，HCC的發(fā)病率有所下降。然而，在一些地區(qū)，HCC的發(fā)病率仍在上升，或者下降趨勢不明顯。例如，在美國，盡管整體癌癥死亡率呈下降趨勢，但HCC的發(fā)病率卻在過去幾十年中持續(xù)上升。在我國，雖然通過乙肝疫苗接種等預(yù)防措施，乙肝病毒感染率有所下降，但由于人口老齡化、肥胖、糖尿病等因素的影響，HCC的發(fā)病率并未出現(xiàn)明顯的下降趨勢，甚至在部分地區(qū)有上升的跡象。肝癌發(fā)病率上升的原因是多方面的。首先，乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）感染仍然是HCC的主要病因。雖然乙肝疫苗的接種在一定程度上控制了HBV的傳播，但全球仍有大量的HBV和HCV感染者，這些慢性感染者是HCC的高危人群。隨著時間的推移，部分感染者會逐漸發(fā)展為肝硬化，進(jìn)而演變?yōu)镠CC。其次，非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的發(fā)病率近年來急劇上升，已成為全球范圍內(nèi)HCC的重要危險因素。NAFLD與肥胖、代謝綜合征、2型糖尿病等密切相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制涉及胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多個方面。NAFLD患者的肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化程度逐漸加重，增加了HCC的發(fā)病風(fēng)險。此外，長期酗酒、黃曲霉毒素污染、遺傳因素等也在HCC的發(fā)病中起到重要作用。長期酗酒可導(dǎo)致酒精性肝病，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化和HCC。黃曲霉毒素是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，常見于霉變的糧食和堅果中，長期攝入可增加HCC的發(fā)病風(fēng)險。遺傳因素使得某些個體對HCC具有更高的易感性，家族中有肝癌病史的人群，其發(fā)病風(fēng)險明顯高于普通人群。2.2肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)病機(jī)制肝細(xì)胞性肝癌（HCC）的發(fā)病是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及多種致癌因素和分子機(jī)制的相互作用。目前認(rèn)為，HBV、HCV感染，肝硬化，黃曲霉毒素暴露，長期酗酒，遺傳因素等在HCC的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。HBV和HCV感染是HCC最主要的病因。全球約50%-80%的HCC患者與HBV感染相關(guān)，在我國這一比例更高。HBV是一種雙鏈DNA病毒，其基因組可整合到宿主肝細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致基因表達(dá)紊亂。HBx蛋白是HBV編碼的一種多功能蛋白，它可以通過多種途徑促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。HBx蛋白能夠干擾細(xì)胞周期調(diào)控，使肝細(xì)胞異常增殖。它還可以激活多種信號通路，如NF-κB、MAPK等，這些信號通路的激活與細(xì)胞增殖、抗凋亡、血管生成等過程密切相關(guān)。此外，HBx蛋白還能抑制p53等抑癌基因的功能，導(dǎo)致細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)能力下降，增加基因突變的風(fēng)險。HCV是一種單鏈RNA病毒，其感染導(dǎo)致肝癌的機(jī)制主要與持續(xù)的肝臟炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)。HCV核心蛋白可以激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，引發(fā)肝臟慢性炎癥。炎癥微環(huán)境中的細(xì)胞因子和活性氧（ROS）等物質(zhì)會損傷肝細(xì)胞DNA，導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。HCV還可以通過干擾胰島素信號通路，引起代謝紊亂，進(jìn)一步促進(jìn)肝癌的發(fā)生。肝硬化是HCC發(fā)生的重要危險因素，約70%-90%的HCC患者合并有肝硬化。肝硬化是肝臟長期受損后，纖維組織增生和肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生導(dǎo)致肝臟正常結(jié)構(gòu)和功能破壞的病理狀態(tài)。在肝硬化過程中，肝臟微環(huán)境發(fā)生改變，如細(xì)胞外基質(zhì)重塑、血管生成增加等，為肝癌細(xì)胞的生長提供了有利條件。同時，肝硬化患者肝細(xì)胞的增殖和凋亡失衡，肝細(xì)胞在不斷修復(fù)損傷的過程中容易發(fā)生基因突變，進(jìn)而發(fā)展為肝癌。例如，在肝硬化肝臟中，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路異常激活，TGF-β可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，同時抑制肝細(xì)胞的增殖和分化，使肝細(xì)胞更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。此外，肝硬化時肝臟的免疫監(jiān)視功能下降，無法有效清除發(fā)生突變的肝細(xì)胞，也為肝癌的發(fā)生創(chuàng)造了機(jī)會。黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類強(qiáng)致癌物質(zhì)，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性和致癌性最強(qiáng)。長期攝入被AFB1污染的食物是HCC的重要危險因素之一，尤其在非洲和亞洲部分地區(qū)，食物黃曲霉毒素污染較為嚴(yán)重，HCC的發(fā)病率也相對較高。AFB1進(jìn)入人體后，在肝臟細(xì)胞色素P450酶的作用下代謝為具有活性的環(huán)氧化物，該環(huán)氧化物可與DNA分子中的鳥嘌呤殘基結(jié)合，形成AFB1-DNA加合物。這種加合物會導(dǎo)致DNA復(fù)制錯誤，引起基因突變，特別是p53基因的突變。p53基因是一種重要的抑癌基因，其突變會使細(xì)胞失去對增殖和凋亡的正常調(diào)控，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生。研究表明，在一些HCC高發(fā)地區(qū)，HCC患者腫瘤組織中p53基因第249密碼子的突變頻率明顯升高，且與AFB1暴露密切相關(guān)。長期酗酒也是HCC的重要危險因素之一。酒精在肝臟代謝過程中，主要通過乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化為乙醛，再進(jìn)一步代謝為乙酸。乙醛是一種有毒物質(zhì)，它可以與蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子結(jié)合，形成加合物，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和基因突變。長期酗酒還會引起肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，逐漸發(fā)展為酒精性肝硬化，進(jìn)而增加HCC的發(fā)病風(fēng)險。酒精性肝病時，肝臟內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高，ROS大量產(chǎn)生，這些ROS會損傷肝細(xì)胞的細(xì)胞膜、線粒體等細(xì)胞器，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。同時，ROS還可以激活NF-κB等炎癥信號通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，加劇肝臟炎癥和纖維化。此外，酒精還可能影響肝臟的免疫功能，抑制機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。遺傳因素在HCC的發(fā)病中也起著一定的作用。家族中有肝癌病史的人群，其患HCC的風(fēng)險明顯高于普通人群。遺傳因素導(dǎo)致HCC易感性增加的機(jī)制主要與遺傳基因的突變或多態(tài)性有關(guān)。一些基因的突變或多態(tài)性會影響肝臟對致癌物質(zhì)的代謝和解毒能力，或者影響細(xì)胞的生長、增殖、凋亡等過程，從而增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險。例如，細(xì)胞色素P4502E1（CYP2E1）基因的多態(tài)性與酒精代謝和肝癌易感性相關(guān)。CYP2E1是參與酒精代謝的關(guān)鍵酶，其基因多態(tài)性會影響酶的活性，導(dǎo)致個體對酒精的代謝能力不同。具有某些CYP2E1基因多態(tài)性的個體，酒精代謝產(chǎn)生的乙醛在體內(nèi)蓄積，增加了肝細(xì)胞損傷和癌變的風(fēng)險。此外，一些抑癌基因和癌基因的遺傳突變也可能導(dǎo)致HCC的發(fā)生，如RB1、APC等基因的突變。這些基因的突變會使細(xì)胞的生長調(diào)控機(jī)制失衡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。綜上所述，HCC的發(fā)病機(jī)制是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，多種因素相互作用，通過不同的分子機(jī)制導(dǎo)致肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。深入研究這些發(fā)病機(jī)制，對于HCC的早期預(yù)防、診斷和治療具有重要的理論和實踐意義。2.3肝細(xì)胞性肝癌的臨床診斷與治療現(xiàn)狀肝細(xì)胞性肝癌（HCC）的早期診斷對于提高患者的生存率和預(yù)后至關(guān)重要。目前，臨床常用的診斷方法包括血清學(xué)檢測、影像學(xué)檢查和病理組織學(xué)檢查。血清學(xué)檢測中，甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是應(yīng)用最為廣泛的肝癌腫瘤標(biāo)志物。AFP是一種糖蛋白，主要由胎兒肝細(xì)胞及卵黃囊合成。在成人中，AFP水平升高常見于HCC患者，其診斷HCC的靈敏度和特異度分別約為40%-65%和80%-94%。然而，AFP水平升高也可見于其他情況，如妊娠、活動性肝病、生殖腺胚胎源性腫瘤等，因此其診斷價值存在一定局限性。除AFP外，異常凝血酶原（des-γ-carboxyprothrombin，DCP）、高爾基體蛋白73（Golgiprotein73，GP73）等血清標(biāo)志物也逐漸應(yīng)用于HCC的診斷。DCP是一種異常的凝血酶原，在HCC患者中其水平常明顯升高，與AFP聯(lián)合檢測可提高HCC的診斷準(zhǔn)確性。GP73是一種高爾基體跨膜蛋白，在肝癌組織中高表達(dá)，其診斷HCC的靈敏度和特異度與AFP相當(dāng)，且在AFP陰性的HCC患者中具有一定的診斷價值。影像學(xué)檢查在HCC的診斷中起著關(guān)鍵作用。超聲檢查（ultrasonography，US）是一種無創(chuàng)、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢查方法，可作為HCC篩查的首選方法。通過US檢查，可發(fā)現(xiàn)肝臟內(nèi)的占位性病變，并初步判斷其大小、形態(tài)、位置等。對于直徑≥1cm的肝癌結(jié)節(jié)，US的檢出率較高，但對于較小的結(jié)節(jié)或位于肝臟深部的病變，其靈敏度相對較低。增強(qiáng)超聲（contrast-enhancedultrasonography，CEUS）通過注射超聲造影劑，可提高肝臟病變的檢出率和診斷準(zhǔn)確性，能夠更準(zhǔn)確地觀察病變的血流灌注情況，有助于鑒別肝臟良惡性腫瘤。計算機(jī)斷層掃描（computedtomography，CT）和磁共振成像（magneticresonanceimaging，MRI）是HCC診斷和分期的重要影像學(xué)手段。CT檢查具有較高的空間分辨率，能夠清晰顯示肝臟的解剖結(jié)構(gòu)和病變形態(tài)，增強(qiáng)CT掃描可觀察病變的動脈期、門靜脈期和延遲期的強(qiáng)化特征，典型的HCC表現(xiàn)為“快進(jìn)快出”，即動脈期明顯強(qiáng)化，門靜脈期和延遲期強(qiáng)化程度迅速減退，這對于HCC的診斷具有重要意義。MRI檢查對軟組織的分辨力較高，能夠提供更多的肝臟病變信息，如腫瘤的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、有無包膜等。MRI還可通過多種功能成像技術(shù)，如擴(kuò)散加權(quán)成像（diffusion-weightedimaging，DWI）、磁共振波譜分析（magneticresonancespectroscopy，MRS）等，進(jìn)一步提高HCC的診斷準(zhǔn)確性。DWI可反映組織內(nèi)水分子的擴(kuò)散運動情況，HCC組織由于細(xì)胞密度高，水分子擴(kuò)散受限，在DWI圖像上表現(xiàn)為高信號；MRS則可分析組織內(nèi)代謝物的含量和變化，有助于鑒別肝臟病變的性質(zhì)。此外，正電子發(fā)射斷層顯像-計算機(jī)斷層掃描（positronemissiontomography-computedtomography，PET-CT）在HCC的診斷中也有一定的應(yīng)用價值，特別是對于檢測肝癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有較高的靈敏度。PET-CT通過檢測腫瘤細(xì)胞對放射性核素標(biāo)記的葡萄糖的攝取情況，來判斷病變的性質(zhì)和有無轉(zhuǎn)移，但由于其價格昂貴，且對小肝癌的診斷靈敏度有限，目前主要用于HCC患者的分期評估和尋找遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。病理組織學(xué)檢查是HCC診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。通過肝穿刺活檢獲取肝臟組織標(biāo)本，進(jìn)行病理切片和染色，在顯微鏡下觀察組織細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分化程度等特征，從而明確診斷。病理組織學(xué)檢查不僅能夠確診HCC，還可對腫瘤進(jìn)行病理分級，評估腫瘤的惡性程度，為臨床治療提供重要依據(jù)。然而，肝穿刺活檢屬于有創(chuàng)檢查，存在一定的風(fēng)險，如出血、感染、腫瘤種植轉(zhuǎn)移等，因此在臨床應(yīng)用中需要嚴(yán)格掌握適應(yīng)證。對于一些影像學(xué)檢查高度懷疑為HCC，且符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者，可不進(jìn)行肝穿刺活檢，直接進(jìn)行治療。HCC的治療方法多樣，主要包括手術(shù)治療、局部治療、全身治療等，具體治療方案應(yīng)根據(jù)患者的腫瘤分期、肝功能狀況、身體狀況等因素綜合考慮，制定個體化的治療方案。手術(shù)治療是HCC患者獲得根治的主要方法，包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)。肝切除術(shù)適用于腫瘤單發(fā)、局限于肝臟一葉，且肝功能良好的患者。根據(jù)腫瘤的大小和位置，可選擇部分肝切除、肝段切除、肝葉切除等不同的手術(shù)方式。手術(shù)切除的關(guān)鍵在于完整切除腫瘤，同時保留足夠的正常肝組織，以維持肝臟的正常功能。對于符合手術(shù)指征的患者，肝切除術(shù)可顯著提高患者的生存率，5年生存率可達(dá)30%-70%。肝移植術(shù)是將病變的肝臟切除，植入健康的肝臟，適用于肝功能嚴(yán)重受損、合并肝硬化且腫瘤符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)（單個腫瘤直徑≤5cm；或腫瘤數(shù)目≤3個，最大直徑≤3cm，無血管侵犯和肝外轉(zhuǎn)移）的患者。肝移植不僅可以切除腫瘤，還能治療肝硬化，從根本上解決肝臟功能問題。肝移植患者的5年生存率可達(dá)70%左右，但由于供體短缺、手術(shù)費用高昂、術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等問題，限制了其廣泛應(yīng)用。局部治療主要包括射頻消融（radiofrequencyablation，RFA）、微波消融（microwaveablation，MWA）、經(jīng)動脈化療栓塞（transarterialchemoembolization，TACE）等。RFA和MWA是通過熱消融的原理，利用射頻電流或微波產(chǎn)生的熱量使腫瘤組織凝固性壞死，從而達(dá)到治療目的。這兩種方法適用于腫瘤直徑≤5cm，尤其是直徑≤3cm的小肝癌患者，對于不能耐受手術(shù)或拒絕手術(shù)的患者也是一種有效的治療選擇。RFA和MWA具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快、并發(fā)癥少等優(yōu)點，其治療效果與手術(shù)切除相當(dāng)，對于小肝癌患者的5年生存率可達(dá)40%-60%。TACE是將化療藥物和栓塞劑混合后注入肝動脈，使腫瘤組織缺血缺氧壞死，同時化療藥物在腫瘤局部緩慢釋放，發(fā)揮化療作用。TACE主要適用于無法手術(shù)切除的中晚期肝癌患者，對于肝功能較好、腫瘤血供豐富的患者療效較好。TACE可反復(fù)進(jìn)行，能夠有效控制腫瘤生長，延長患者生存期，但長期應(yīng)用可能導(dǎo)致肝功能損害、腫瘤耐藥等問題。全身治療主要包括化療、靶向治療和免疫治療。傳統(tǒng)化療藥物如多柔比星、順鉑等對HCC的療效有限，且副作用較大，目前已較少單獨應(yīng)用。靶向治療是近年來HCC治療的重要進(jìn)展，通過針對腫瘤細(xì)胞表面的特定靶點，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移信號通路，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。索拉非尼是第一個被批準(zhǔn)用于晚期HCC治療的靶向藥物，它可以抑制血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）、血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等多個靶點，阻斷腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖。索拉非尼能夠延長晚期HCC患者的總生存期，但其有效率相對較低，且部分患者會出現(xiàn)耐藥。近年來，越來越多的靶向藥物如侖伐替尼、瑞戈非尼、阿帕替尼等相繼被批準(zhǔn)用于HCC的治療，為患者提供了更多的選擇。免疫治療是利用機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來識別和殺傷腫瘤細(xì)胞，具有獨特的作用機(jī)制和良好的療效。免疫檢查點抑制劑如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等通過阻斷免疫檢查點蛋白，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）等，解除腫瘤細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的抑制，激活T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。免疫治療在晚期HCC患者中顯示出較好的療效和安全性，可顯著延長患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量。目前，免疫治療聯(lián)合靶向治療或其他治療方法已成為晚期HCC治療的重要策略，多項臨床試驗正在進(jìn)行中，有望進(jìn)一步提高HCC的治療效果。三、HLA-E的生物學(xué)特性3.1HLA-E的結(jié)構(gòu)與功能人類白細(xì)胞抗原E（HLA-E）屬于非經(jīng)典的HLAⅠ類分子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著獨特且關(guān)鍵的作用。HLA-E基因定位于人類第6號染色體短臂（6p21.3），處于HLA-A和HLA-C座位之間，其基因包含3個Ah元件和8個外顯子。這8個外顯子分別編碼HLA-E分子不同的功能區(qū)域，包括約21個氨基酸組成的信號肽，約90個氨基酸的α1區(qū)，約92個氨基酸的α2區(qū)，約92個氨基酸的α3區(qū)，約30個氨基酸的跨膜區(qū)以及約25個氨基酸的胞外區(qū)。從分子結(jié)構(gòu)來看，HLA-E分子由一條重鏈（α鏈）和一條輕鏈（β2微球蛋白，β2m）非共價結(jié)合而成。α鏈包含α1、α2和α3三個結(jié)構(gòu)域，其中α1和α2結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成了抗原肽結(jié)合槽，該結(jié)合槽主要容納長度為8-10個氨基酸的抗原肽。與經(jīng)典HLAⅠ類分子相比，HLA-E的抗原肽結(jié)合槽相對保守，多態(tài)性較低，目前僅發(fā)現(xiàn)5種多態(tài)性，分別記為E0101、E0102、E01031、E01032、E0104，這些多態(tài)性主要體現(xiàn)在83、107、157等位點的氨基酸差異上。雖然這些多態(tài)性在功能上的具體意義尚未完全明確，但研究表明，不同的多態(tài)性可能會影響HLA-E分子與抗原肽的結(jié)合親和力以及與受體的相互作用。α3結(jié)構(gòu)域則與β2m結(jié)合，對維持HLA-E分子的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性起著重要作用。β2m不含有跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，它通過與α3結(jié)構(gòu)域相互作用，穩(wěn)定HLA-E分子的構(gòu)象，促進(jìn)HLA-E分子在細(xì)胞表面的表達(dá)。HLA-E的主要功能之一是參與抗原呈遞過程。HLA-E所提呈的抗原肽主要來源于經(jīng)典HLAⅠ類分子（如HLA-A、HLA-B、HLA-C）及某些HLA-G亞類分子的信號肽。這些信號肽被轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，與新合成的HLA-E分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的HLA-E/抗原肽復(fù)合物，隨后該復(fù)合物被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞表面，供免疫細(xì)胞識別。例如，在病毒感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)的抗原加工機(jī)制會將病毒抗原或腫瘤抗原降解為短肽，其中一些短肽可以與HLA-E分子結(jié)合，形成HLA-E/抗原肽復(fù)合物。這種復(fù)合物可以被自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和CD8+T細(xì)胞表面的受體識別，從而激活免疫細(xì)胞的功能。HLA-E在免疫調(diào)節(jié)中也扮演著重要角色，其主要通過與NK細(xì)胞表面的CD94/NKG2類受體結(jié)合來發(fā)揮作用。CD94/NKG2類受體包括CD94/NKG2A、CD94/NKG2C等，其中CD94/NKG2A是一種抑制性受體，而CD94/NKG2C是一種激活性受體。當(dāng)HLA-E與CD94/NKG2A結(jié)合時，會向NK細(xì)胞傳遞抑制性信號，抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，使表達(dá)HLA-E的細(xì)胞逃避NK細(xì)胞的攻擊。這一機(jī)制在維持機(jī)體免疫耐受和免疫平衡方面具有重要意義。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體自身細(xì)胞表面表達(dá)的HLA-E與NK細(xì)胞表面的CD94/NKG2A結(jié)合，防止NK細(xì)胞對自身細(xì)胞的過度殺傷。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞可能會上調(diào)HLA-E的表達(dá)，利用這一機(jī)制逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷。相反，當(dāng)HLA-E與CD94/NKG2C結(jié)合時，則會向NK細(xì)胞傳遞激活性信號，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性。這種雙重調(diào)節(jié)機(jī)制使得HLA-E能夠根據(jù)機(jī)體的免疫狀態(tài)，精確調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。此外，HLA-E還可以通過與CD8+T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）相互作用，激活CD8+T細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞在感染性疾病中發(fā)揮著重要作用，它們可以識別并殺傷被病原體感染的細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。3.2HLA-E的表達(dá)調(diào)控機(jī)制HLA-E的表達(dá)調(diào)控是一個復(fù)雜且精細(xì)的過程，涉及轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯后等多個水平，這些調(diào)控機(jī)制共同維持著HLA-E在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，并對其在免疫調(diào)節(jié)中的功能發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在轉(zhuǎn)錄水平，HLA-E基因的表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。其中，核因子κB（NF-κB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在炎癥或病毒感染等刺激下，細(xì)胞內(nèi)的信號通路被激活，促使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與HLA-E基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，從而增強(qiáng)HLA-E基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，在病毒感染的細(xì)胞中，病毒蛋白可以激活NF-κB信號通路，上調(diào)HLA-E的表達(dá)，這可能是病毒逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的一種機(jī)制。干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）家族成員也參與了HLA-E轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。IRF-1和IRF-2是最早被發(fā)現(xiàn)與HLA-E轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的IRF家族成員。IRF-1可以與HLA-E基因啟動子區(qū)域的干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）結(jié)合，促進(jìn)HLA-E基因的轉(zhuǎn)錄，而IRF-2則在一定程度上抑制HLA-E的轉(zhuǎn)錄。在IFN-γ刺激下，IRF-1被激活，與ISRE結(jié)合，啟動HLA-E基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)HLA-E在細(xì)胞表面的表達(dá)。此外，一些細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）也可以通過激活相關(guān)的信號通路，影響轉(zhuǎn)錄因子與HLA-E基因啟動子的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控HLA-E的轉(zhuǎn)錄。TNF-α可以激活MAPK信號通路，使相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，增強(qiáng)其與HLA-E基因啟動子的親和力，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控主要涉及mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。HLA-EmRNA的穩(wěn)定性受到多種因素的影響。例如，一些RNA結(jié)合蛋白可以與HLA-EmRNA結(jié)合，調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性。HuR是一種廣泛表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白，它可以與HLA-EmRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，抑制mRNA的降解，從而提高HLA-EmRNA的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤細(xì)胞中，HuR的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致HLA-EmRNA的穩(wěn)定性增加，進(jìn)而使HLA-E的表達(dá)水平升高。微小RNA（miRNA）也在HLA-E轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，它們可以通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進(jìn)其降解。已有研究表明，一些miRNA如miR-148a等可以靶向HLA-EmRNA，通過抑制其翻譯過程，降低HLA-E的表達(dá)水平。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-148a的過表達(dá)可以顯著降低HLA-E的蛋白表達(dá)，同時不影響HLA-EmRNA的水平，說明miR-148a是在轉(zhuǎn)錄后水平抑制HLA-E的表達(dá)。翻譯后水平的調(diào)控主要包括蛋白質(zhì)的修飾和加工。HLA-E分子在翻譯后需要經(jīng)過一系列的修飾和加工過程，才能形成具有功能的成熟分子。糖基化是HLA-E分子翻譯后修飾的重要方式之一。HLA-E分子的α鏈上存在多個糖基化位點，糖基化修飾可以影響HLA-E分子的穩(wěn)定性、構(gòu)象以及與其他分子的相互作用。研究表明，缺乏糖基化修飾的HLA-E分子在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性降低，容易被降解，從而影響其在細(xì)胞表面的表達(dá)。此外，HLA-E分子的磷酸化修飾也可能對其功能產(chǎn)生影響。雖然目前關(guān)于HLA-E磷酸化修飾的研究較少，但已有研究發(fā)現(xiàn)，在某些細(xì)胞刺激條件下，HLA-E分子可以發(fā)生磷酸化，其具體的生物學(xué)意義還有待進(jìn)一步深入研究。泛素化修飾在蛋白質(zhì)降解和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中起著重要作用。HLA-E分子也可能受到泛素化修飾的調(diào)控，泛素化修飾后的HLA-E分子可能被蛋白酶體識別并降解，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HLA-E的水平。3.3HLA-E在免疫系統(tǒng)中的作用HLA-E在免疫系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色，對NK細(xì)胞和T細(xì)胞的功能具有重要影響，同時參與了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸過程。NK細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠識別并殺傷病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮著重要作用。HLA-E主要通過與NK細(xì)胞表面的CD94/NKG2類受體相互作用，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性。CD94/NKG2A是NK細(xì)胞表面的抑制性受體，當(dāng)HLA-E與CD94/NKG2A結(jié)合時，會向NK細(xì)胞傳遞抑制性信號，抑制NK細(xì)胞的殺傷活性。這種抑制作用的分子機(jī)制涉及到細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路。CD94/NKG2A與HLA-E結(jié)合后，會招募含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2。這些磷酸酶被招募到受體附近后，會對下游信號分子進(jìn)行去磷酸化修飾，從而阻斷NK細(xì)胞活化信號的傳導(dǎo)，抑制NK細(xì)胞的殺傷功能。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體自身細(xì)胞表面表達(dá)的HLA-E與NK細(xì)胞表面的CD94/NKG2A結(jié)合，維持NK細(xì)胞的免疫耐受，避免NK細(xì)胞對自身細(xì)胞的過度殺傷。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞常常會上調(diào)HLA-E的表達(dá)，利用這一機(jī)制逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞系中，如乳腺癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系等，HLA-E的表達(dá)水平明顯升高，且與NK細(xì)胞的殺傷活性呈負(fù)相關(guān)。通過基因沉默技術(shù)下調(diào)腫瘤細(xì)胞中HLA-E的表達(dá)，可以增強(qiáng)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。此外，CD94/NKG2C是NK細(xì)胞表面的激活性受體，雖然HLA-E與CD94/NKG2C的親和力較低，但在某些情況下，如病毒感染或腫瘤微環(huán)境中，HLA-E與CD94/NKG2C的結(jié)合可以向NK細(xì)胞傳遞激活性信號，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性。這種雙重調(diào)節(jié)機(jī)制使得HLA-E能夠根據(jù)機(jī)體的免疫狀態(tài)，精確調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著核心作用，可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。HLA-E對T細(xì)胞功能的影響主要體現(xiàn)在CD8+T細(xì)胞方面。HLA-E可以提呈抗原肽給CD8+T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）識別，從而激活CD8+T細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。HLA-E所提呈的抗原肽主要來源于經(jīng)典HLAⅠ類分子及某些HLA-G亞類分子的信號肽。這些抗原肽與HLA-E分子結(jié)合形成復(fù)合物后，被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞表面，供CD8+T細(xì)胞識別。HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞在感染性疾病中發(fā)揮著重要作用。在病毒感染過程中，病毒抗原被加工處理成抗原肽，與HLA-E分子結(jié)合，形成HLA-E/抗原肽復(fù)合物。CD8+T細(xì)胞通過TCR識別該復(fù)合物后，被激活并增殖分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）。CTL可以特異性地殺傷被病毒感染的細(xì)胞，清除病毒感染，增強(qiáng)機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。研究表明，在乙肝病毒感染患者中，HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞能夠識別并殺傷被乙肝病毒感染的肝細(xì)胞，對控制乙肝病毒感染具有重要意義。此外，在腫瘤免疫中，HLA-E也可能提呈腫瘤抗原肽給CD8+T細(xì)胞，激活抗腫瘤免疫應(yīng)答。然而，腫瘤細(xì)胞可能通過多種機(jī)制干擾HLA-E的抗原提呈功能，如下調(diào)HLA-E的表達(dá)、改變抗原肽的加工和提呈途徑等，從而逃避T細(xì)胞的免疫監(jiān)視。免疫逃逸是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的重要機(jī)制，HLA-E在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)HLA-E的表達(dá)，與NK細(xì)胞表面的CD94/NKG2A結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，從而逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視。如在肝癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)HLA-E的高表達(dá)與NK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷活性降低相關(guān)。腫瘤細(xì)胞還可能通過干擾HLA-E的抗原提呈功能，逃避T細(xì)胞的免疫識別。腫瘤細(xì)胞可能會改變自身的抗原加工和提呈機(jī)制，使得腫瘤抗原不能有效地與HLA-E結(jié)合并呈遞給T細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞也可能分泌一些免疫抑制因子，抑制T細(xì)胞的活化和功能，進(jìn)一步促進(jìn)免疫逃逸。例如，腫瘤細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）可以抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌，降低T細(xì)胞的免疫活性。此外，腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞成分，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等，也可能通過與腫瘤細(xì)胞相互作用，促進(jìn)HLA-E介導(dǎo)的免疫逃逸。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以分泌一些細(xì)胞因子，如IL-10等，上調(diào)腫瘤細(xì)胞中HLA-E的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力。四、HLA-E在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)研究4.1研究方法與樣本選取為深入探究HLA-E在肝細(xì)胞性肝癌（HCC）中的表達(dá)情況，本研究采用了多種實驗技術(shù)和方法。在樣本選取方面，嚴(yán)格遵循科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑瓌t，以確保研究結(jié)果的可靠性和代表性。樣本主要來源于[具體醫(yī)院名稱]在[具體時間段]內(nèi)收治的HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)病理組織學(xué)確診為肝細(xì)胞性肝癌；患者簽署了知情同意書，自愿參與本研究；臨床資料完整，包括患者的基本信息、病史、手術(shù)記錄、病理報告以及隨訪資料等。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并其他惡性腫瘤；患有嚴(yán)重的自身免疫性疾病或免疫缺陷疾??；術(shù)前接受過放療、化療或免疫治療等可能影響HLA-E表達(dá)的治療措施。共收集到符合標(biāo)準(zhǔn)的HCC患者手術(shù)切除標(biāo)本[X]例，同時采集了相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本作為對照。癌旁組織定義為距離腫瘤邊緣至少[X]cm以上的肝臟組織，經(jīng)病理檢查證實為非腫瘤組織，且無明顯的炎癥、壞死等病變。所有標(biāo)本在手術(shù)切除后，立即用生理鹽水沖洗，去除血液和雜質(zhì)，然后一部分標(biāo)本置于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting）和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測；另一部分標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色（IHC）檢測。免疫組織化學(xué)染色是檢測組織中蛋白質(zhì)表達(dá)和定位的常用方法。具體實驗步驟如下：將石蠟切片脫蠟至水，采用高溫高壓抗原修復(fù)法，使抗原充分暴露。然后用3%過氧化氫溶液孵育切片，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。加入正常山羊血清封閉非特異性抗原結(jié)合位點，隨后滴加兔抗人HLA-E多克隆抗體（工作濃度為[X]），4℃孵育過夜。次日，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗切片，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，封片。采用雙盲法，由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度對HLA-E的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。陽性細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞數(shù)的比例＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），＞50%為強(qiáng)陽性（++）。蛋白質(zhì)免疫印跡法用于檢測細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。將凍存的組織標(biāo)本研磨成粉末，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃條件下12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，使各樣本蛋白濃度一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以阻斷非特異性結(jié)合。隨后加入兔抗人HLA-E多克隆抗體（工作濃度為[X]），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（工作濃度為[X]），室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌后，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算HLA-E蛋白的相對表達(dá)量。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用于檢測基因的mRNA表達(dá)水平。從凍存的組織標(biāo)本中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列根據(jù)GenBank中HLA-E基因序列設(shè)計，上游引物為：5'-[具體序列]-3'，下游引物為：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物為：5'-[具體序列]-3'，下游引物為：5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)體系為20μl，包括SYBRGreenMasterMix10μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板1μl，ddH2O8μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算HLA-EmRNA的相對表達(dá)量。4.2HLA-E在肝癌組織中的表達(dá)水平通過免疫組織化學(xué)染色（IHC）對HCC組織及癌旁組織中HLA-E的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，HLA-E在癌旁組織中表達(dá)不明顯，多呈陰性或弱陽性。在癌巢中，HLA-E的陽性表達(dá)（++/+）率為[X]%，顯著高于癌旁組織。陽性染色主要定位于肝癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀。從染色強(qiáng)度來看，部分高分化肝癌組織中HLA-E染色強(qiáng)度較弱，而在低分化肝癌組織中，HLA-E染色強(qiáng)度相對較強(qiáng)。這一結(jié)果初步表明，HLA-E在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且其表達(dá)強(qiáng)度可能與肝癌的分化程度有關(guān)。為進(jìn)一步驗證IHC的結(jié)果，并從蛋白水平定量分析HLA-E的表達(dá)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting）對樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，HCC組織中HLA-E蛋白的相對表達(dá)量為[X]，顯著高于癌旁組織的[X]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。以β-actin作為內(nèi)參，通過分析條帶灰度值，直觀地展示了HLA-E蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。在不同的肝癌樣本中，HLA-E蛋白的表達(dá)水平存在一定的個體差異，但總體上肝癌組織中的表達(dá)量均高于癌旁組織。這與IHC的結(jié)果相互印證，進(jìn)一步證實了HLA-E在肝癌組織中高表達(dá)的結(jié)論。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）從mRNA水平檢測HLA-E的表達(dá)情況。結(jié)果表明，HCC組織中HLA-EmRNA的相對表達(dá)量為[X]，明顯高于癌旁組織的[X]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。通過2-ΔΔCt法計算得出的相對表達(dá)量，準(zhǔn)確地反映了HLA-E基因在肝癌組織和癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄水平差異。這一結(jié)果從基因?qū)用娼沂玖薍LA-E在肝癌組織中高表達(dá)的現(xiàn)象，可能是由于HLA-E基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，或者其mRNA穩(wěn)定性增加等原因?qū)е隆＝Y(jié)合IHC和Westernblotting的結(jié)果，說明HLA-E在肝癌組織中的高表達(dá)不僅體現(xiàn)在蛋白水平，也體現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄水平，這種高表達(dá)可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。4.3HLA-E在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況為了進(jìn)一步探討HLA-E在肝癌中的表達(dá)機(jī)制，研究選取了多種肝癌細(xì)胞系，包括HepG2、BEL-7402、PLC、MHCC97、Hep3B2.1-7等，并以正常胎肝細(xì)胞系L02作為對照。運用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timePCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting）技術(shù)，對這些細(xì)胞系中HLA-EmRNA和蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行相對定量分析。Real-timePCR檢測結(jié)果顯示，與L02胎肝細(xì)胞系相比，Hep3B2.1-7細(xì)胞系中HLA-EmRNA表達(dá)幾乎接近缺失，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。而HepG2細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞、PLC細(xì)胞、MHCC97細(xì)胞這4種肝癌細(xì)胞系與L02胎肝細(xì)胞系的HLA-EmRNA水平比較，無顯著差異（P>0.05）。這表明不同肝癌細(xì)胞系中HLA-EmRNA的表達(dá)存在差異，部分肝癌細(xì)胞系在轉(zhuǎn)錄水平上并未表現(xiàn)出明顯的HLA-E表達(dá)上調(diào)。然而，Westernblotting檢測結(jié)果卻呈現(xiàn)出不同的情況。HepG2細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞、PLC細(xì)胞、MHCC97細(xì)胞和Hep3B2.1-7細(xì)胞與L02細(xì)胞的HLA-E蛋白水平比較，差異顯著（P<0.01），其中Hep3B2.1-7細(xì)胞中HLA-E蛋白表達(dá)缺失。在HepG2、BEL-7402、PLC、MHCC97這些肝癌細(xì)胞系中，盡管HLA-EmRNA水平與正常胎肝細(xì)胞系無顯著差異，但蛋白表達(dá)卻顯著升高，這說明肝癌細(xì)胞系中HLA-E的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平存在調(diào)控機(jī)制?？赡苁怯捎趍RNA的穩(wěn)定性、翻譯效率或翻譯后修飾等因素的影響，導(dǎo)致了HLA-EmRNA和蛋白表達(dá)的不同步。例如，某些RNA結(jié)合蛋白可能與HLA-EmRNA結(jié)合，影響其翻譯效率，使得mRNA水平雖未改變，但蛋白合成量增加；或者在翻譯后修飾過程中，如糖基化、磷酸化等修飾方式的改變，影響了HLA-E蛋白的穩(wěn)定性和功能，從而導(dǎo)致其在肝癌細(xì)胞系中蛋白表達(dá)水平的變化。本研究結(jié)果與相關(guān)研究報道具有一定的一致性。有研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，HLA-E的表達(dá)調(diào)控存在轉(zhuǎn)錄后水平的復(fù)雜機(jī)制。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-148a等微小RNA可以通過靶向HLA-EmRNA，抑制其翻譯過程，從而降低HLA-E的蛋白表達(dá)。在肝癌細(xì)胞系中，雖然本研究未直接檢測微小RNA等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子對HLA-E表達(dá)的影響，但HLA-EmRNA和蛋白表達(dá)的不同步現(xiàn)象提示了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的存在。此外，其他研究也發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中HLA-E的表達(dá)還可能受到細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)。在一些腫瘤細(xì)胞中，NF-κB信號通路的激活可以上調(diào)HLA-E的表達(dá)，這可能涉及到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，但也不能排除對轉(zhuǎn)錄后過程的影響。因此，進(jìn)一步深入研究肝癌細(xì)胞系中HLA-E表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，對于揭示肝癌免疫逃逸的分子機(jī)制具有重要意義。4.4影響HLA-E表達(dá)的因素分析HLA-E在肝細(xì)胞性肝癌（HCC）中的表達(dá)受到多種因素的綜合影響，這些因素相互作用，共同調(diào)控著HLA-E的表達(dá)水平，進(jìn)而影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展和免疫逃逸過程。腫瘤的病理特征與HLA-E表達(dá)密切相關(guān)。腫瘤的分化程度是一個重要因素，低分化的肝癌組織往往表現(xiàn)出更高的HLA-E表達(dá)水平。在低分化肝癌細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖速度加快，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，這可能導(dǎo)致相關(guān)信號通路的異常激活，進(jìn)而促進(jìn)HLA-E基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。腫瘤的大小和分期也與HLA-E表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。隨著腫瘤體積的增大和分期的進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境逐漸惡化，缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素會刺激腫瘤細(xì)胞，使其上調(diào)HLA-E的表達(dá)，以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。有研究對不同分期的HCC患者腫瘤組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)晚期患者腫瘤組織中HLA-E的表達(dá)明顯高于早期患者。腫瘤的血管侵犯情況也可能影響HLA-E表達(dá)，當(dāng)腫瘤侵犯血管時，腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入血液循環(huán)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，為了在轉(zhuǎn)移過程中躲避免疫細(xì)胞的殺傷，腫瘤細(xì)胞可能會增加HLA-E的表達(dá)。病毒感染是HCC發(fā)生的重要危險因素之一，同時也對HLA-E的表達(dá)產(chǎn)生影響。HBV和HCV感染在HCC患者中較為常見，研究表明，HBV或HCV感染的肝癌細(xì)胞中，HLA-E的表達(dá)水平可能會發(fā)生改變。HBV感染的肝癌細(xì)胞中，HBV的一些蛋白產(chǎn)物，如HBx蛋白，可能通過激活相關(guān)的信號通路，影響HLA-E基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。HBx蛋白可以與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)HLA-E基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性，從而上調(diào)HLA-E的表達(dá)。HCV感染可能通過引發(fā)肝臟的慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致免疫微環(huán)境的改變，間接影響HLA-E的表達(dá)。在HCV感染引起的慢性炎癥環(huán)境中，細(xì)胞因子如干擾素γ（IFN-γ）等的分泌增加，IFN-γ可以激活JAK-STAT信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)HLA-E基因的表達(dá)。IFN-γ可以誘導(dǎo)IRF-1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子與HLA-E基因啟動子區(qū)域的ISRE結(jié)合，促進(jìn)HLA-E基因的轉(zhuǎn)錄。免疫微環(huán)境在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，也與HLA-E的表達(dá)相互影響。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要組成部分，TAM可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長和免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，TAM分泌的白細(xì)胞介素10（IL-10）可以上調(diào)肝癌細(xì)胞中HLA-E的表達(dá)。IL-10通過與肝癌細(xì)胞表面的IL-10受體結(jié)合，激活下游的信號通路，促進(jìn)HLA-E基因的轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）也在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，Treg可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。Treg細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）可以影響HLA-E的表達(dá)。TGF-β可以通過激活Smad信號通路，調(diào)節(jié)HLA-E基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)HLA-E的表達(dá)。此外，NK細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞與肝癌細(xì)胞之間的相互作用也可能影響HLA-E的表達(dá)。當(dāng)NK細(xì)胞或T細(xì)胞識別肝癌細(xì)胞表面的抗原時，會釋放一些細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可能會反饋調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中HLA-E的表達(dá)。NK細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子α（TNF-α）在一定條件下可以上調(diào)肝癌細(xì)胞中HLA-E的表達(dá)，這可能是腫瘤細(xì)胞對NK細(xì)胞攻擊的一種適應(yīng)性反應(yīng)。五、HLA-E表達(dá)與肝細(xì)胞性肝癌預(yù)后的關(guān)系5.1臨床病例隨訪與數(shù)據(jù)收集為深入分析HLA-E表達(dá)與肝細(xì)胞性肝癌（HCC）患者預(yù)后的關(guān)系，本研究對納入的HCC患者進(jìn)行了系統(tǒng)的隨訪，并嚴(yán)格按照科學(xué)規(guī)范的流程收集相關(guān)數(shù)據(jù)。隨訪工作從患者手術(shù)出院后開始，采用門診復(fù)查、電話隨訪和線上問卷等多種方式相結(jié)合，以確保能夠全面、準(zhǔn)確地獲取患者的生存信息。隨訪時間截至患者死亡、失訪或隨訪研究結(jié)束（具體時間為[截止日期]）。隨訪內(nèi)容涵蓋患者的生存狀態(tài)，包括是否存活、死亡原因；復(fù)發(fā)情況，如復(fù)發(fā)時間、復(fù)發(fā)部位；治療情況，如術(shù)后是否接受輔助治療（化療、靶向治療、免疫治療等）及其治療方案、治療時間和治療反應(yīng)；患者的身體狀況，如體力狀況評分（ECOG評分）、是否出現(xiàn)并發(fā)癥及其類型和嚴(yán)重程度；以及其他可能影響預(yù)后的因素，如患者的生活習(xí)慣（吸煙、飲酒等）、基礎(chǔ)疾?。ǜ哐獕?、糖尿病等）。在數(shù)據(jù)收集過程中，設(shè)立了專門的數(shù)據(jù)收集小組，由經(jīng)過培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員負(fù)責(zé)。對于門診復(fù)查的患者，醫(yī)護(hù)人員詳細(xì)記錄患者的各項檢查結(jié)果，包括血清學(xué)指標(biāo)（AFP、DCP、肝功能指標(biāo)等）、影像學(xué)檢查結(jié)果（超聲、CT、MRI等），并詢問患者的身體狀況和治療情況，將這些信息準(zhǔn)確錄入電子病歷系統(tǒng)。對于電話隨訪和線上問卷收集的數(shù)據(jù)，醫(yī)護(hù)人員仔細(xì)核對信息的完整性和準(zhǔn)確性，對于存在疑問或不完整的信息，及時與患者或其家屬溝通確認(rèn)。所有收集到的數(shù)據(jù)定期進(jìn)行整理和備份，確保數(shù)據(jù)的安全性和可追溯性。在數(shù)據(jù)收集完成后，運用統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先對患者的一般臨床資料進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、TNM分期、分化程度、HBV感染情況、HCV感染情況、Child-Pugh分級、HLA-E表達(dá)水平等，了解患者的基本特征和各因素的分布情況。然后采用Kaplan-Meier法計算患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS），并繪制生存曲線，比較不同HLA-E表達(dá)水平患者的生存差異，通過Log-rank檢驗判斷差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。將HLA-E表達(dá)水平與其他臨床病理因素一起納入Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析，篩選出影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素，評估HLA-E在預(yù)測患者預(yù)后中的價值。5.2HLA-E表達(dá)與肝癌患者生存分析通過對納入研究的肝細(xì)胞性肝癌（HCC）患者進(jìn)行長期隨訪，收集患者的生存數(shù)據(jù)，深入分析HLA-E表達(dá)與患者總生存（OverallSurvival，OS）和無瘤生存（Disease-FreeSurvival，DFS）時間的關(guān)系，評估HLA-E作為HCC預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在價值。采用Kaplan-Meier法計算患者的OS和DFS，并繪制生存曲線。結(jié)果顯示，HLA-E高表達(dá)組患者的總生存時間顯著短于HLA-E低表達(dá)組患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。從生存曲線來看，HLA-E高表達(dá)組患者的生存曲線在隨訪早期就開始下降，且下降趨勢較為陡峭，表明這組患者的死亡風(fēng)險較高；而HLA-E低表達(dá)組患者的生存曲線下降相對平緩，患者的生存時間相對較長。在無瘤生存方面，HLA-E高表達(dá)組患者的無瘤生存時間也明顯短于HLA-E低表達(dá)組患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這意味著HLA-E高表達(dá)的患者術(shù)后更容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，從而影響患者的無瘤生存期。進(jìn)一步運用Log-rank檢驗對不同HLA-E表達(dá)水平患者的生存差異進(jìn)行驗證，結(jié)果進(jìn)一步證實了上述結(jié)論。這表明HLA-E表達(dá)水平與HCC患者的預(yù)后密切相關(guān)，HLA-E高表達(dá)可能是HCC患者預(yù)后不良的一個重要指標(biāo)。從臨床實踐角度來看，這一結(jié)果具有重要的指導(dǎo)意義。對于HLA-E高表達(dá)的HCC患者，臨床醫(yī)生在制定治療方案時應(yīng)更加謹(jǐn)慎，考慮采取更積極的治療措施，如聯(lián)合免疫治療、靶向治療等，以降低患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險，延長患者的生存期。同時，也需要加強(qiáng)對這部分患者的術(shù)后隨訪和監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的跡象，以便盡早進(jìn)行干預(yù)。為了更全面地評估HLA-E表達(dá)對HCC患者預(yù)后的影響，將HLA-E表達(dá)水平與其他臨床病理因素（如腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、TNM分期、分化程度、HBV感染情況、Child-Pugh分級等）一起納入Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析。結(jié)果顯示，HLA-E表達(dá)水平是影響HCC患者總生存和無瘤生存的獨立危險因素（P<0.05）。在調(diào)整了其他因素后，HLA-E高表達(dá)患者的死亡風(fēng)險和腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險仍然顯著高于HLA-E低表達(dá)患者。這進(jìn)一步說明HLA-E在預(yù)測HCC患者預(yù)后方面具有獨特的價值，不受其他臨床病理因素的干擾。除HLA-E表達(dá)水平外，多因素分析還發(fā)現(xiàn)腫瘤大小、TNM分期、Child-Pugh分級等因素也與HCC患者的預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤越大、TNM分期越晚、Child-Pugh分級越高，患者的預(yù)后越差。這些結(jié)果為臨床醫(yī)生綜合評估HCC患者的預(yù)后提供了更全面的信息。臨床醫(yī)生在評估患者預(yù)后時，不僅要考慮腫瘤本身的特征和肝功能狀況，還應(yīng)關(guān)注HLA-E的表達(dá)水平，以便更準(zhǔn)確地預(yù)測患者的生存情況，為制定個性化的治療方案提供依據(jù)。5.3多因素分析確定HLA-E的預(yù)后價值為了更準(zhǔn)確地評估HLA-E在肝細(xì)胞性肝癌（HCC）患者預(yù)后中的獨立作用，本研究采用Cox回歸模型，綜合考慮多種臨床病理因素，對HLA-E表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行深入分析。將HLA-E表達(dá)水平（高表達(dá)/低表達(dá)）、腫瘤大?。ǎ?cm/≤5cm）、腫瘤數(shù)目（單發(fā)/多發(fā)）、TNM分期（Ⅰ-Ⅱ期/Ⅲ-Ⅳ期）、分化程度（高分化/中低分化）、HBV感染情況（感染/未感染）、Child-Pugh分級（A/B-C）等因素納入Cox比例風(fēng)險模型。首先進(jìn)行單因素Cox回歸分析，初步篩選出與患者總生存期（OS）和無病生存期（DFS）可能相關(guān)的因素。結(jié)果顯示，HLA-E高表達(dá)、腫瘤大?。?cm、腫瘤多發(fā)、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期、中低分化、HBV感染、Child-Pugh分級為B-C等因素在單因素分析中均與較差的OS和DFS顯著相關(guān)（P均＜0.05）。隨后，將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的因素納入多因素Cox回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步分析。多因素分析結(jié)果表明，HLA-E高表達(dá)是影響HCC患者OS和DFS的獨立危險因素。在調(diào)整了其他臨床病理因素后，HLA-E高表達(dá)患者的死亡風(fēng)險比（HR）為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05），腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險比為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05）。這意味著，與HLA-E低表達(dá)患者相比，HLA-E高表達(dá)患者的死亡風(fēng)險和腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著增加。除HLA-E表達(dá)水平外，多因素分析還顯示，TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期、腫瘤大?。?cm、Child-Pugh分級為B-C也是影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者死亡風(fēng)險比為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05），腫瘤大?。?cm的患者死亡風(fēng)險比為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05），Child-Pugh分級為B-C的患者死亡風(fēng)險比為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05）。本研究通過多因素分析，明確了HLA-E表達(dá)水平在預(yù)測HCC患者預(yù)后中的重要價值，為臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地評估患者預(yù)后提供了重要依據(jù)。在臨床實踐中，醫(yī)生可以結(jié)合HLA-E表達(dá)水平以及其他獨立危險因素，制定更加個體化的治療方案和隨訪策略。對于HLA-E高表達(dá)且伴有其他不良預(yù)后因素的患者，應(yīng)加強(qiáng)術(shù)后監(jiān)測，積極考慮聯(lián)合免疫治療、靶向治療等綜合治療措施，以降低腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險，提高患者的生存率。同時，本研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究HCC的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點提供了方向。未來的研究可以深入探討HLA-E高表達(dá)導(dǎo)致不良預(yù)后的具體分子機(jī)制，以及如何通過干預(yù)HLA-E相關(guān)信號通路來改善HCC患者的預(yù)后。5.4HLA-E作為預(yù)后標(biāo)志物的臨床應(yīng)用潛力HLA-E表達(dá)水平在肝細(xì)胞性肝癌（HCC）患者預(yù)后評估中展現(xiàn)出巨大的臨床應(yīng)用潛力，有望成為指導(dǎo)臨床治療決策的重要生物標(biāo)志物。在預(yù)測HCC患者預(yù)后方面，HLA-E表達(dá)具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。如前文所述，本研究通過對大量HCC患者的隨訪和生存分析發(fā)現(xiàn)，HLA-E高表達(dá)組患者的總生存期和無病生存期均顯著短于HLA-E低表達(dá)組患者，且HLA-E表達(dá)水平是影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。這一結(jié)果表明，HLA-E表達(dá)水平能夠獨立于其他臨床病理因素，為醫(yī)生提供關(guān)于患者預(yù)后的關(guān)鍵信息。與傳統(tǒng)的預(yù)后評估指標(biāo)，如腫瘤大小、TNM分期等相比，HLA-E表達(dá)水平能夠從免疫逃逸的角度，更深入地反映腫瘤的生物學(xué)行為和患者的生存風(fēng)險。腫瘤大小和TNM分期主要反映腫瘤的解剖學(xué)特征和疾病進(jìn)展程度，而HLA-E表達(dá)則揭示了腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視和攻擊的能力。在臨床實踐中，對于腫瘤大小和TNM分期相似的患者，HLA-E表達(dá)水平不同，其預(yù)后可能存在顯著差異。因此，將HLA-E表達(dá)水平納入HCC患者的預(yù)后評估體系，能夠更全面、準(zhǔn)確地預(yù)測患者的生存情況，為患者提供更精準(zhǔn)的預(yù)后信息。在指導(dǎo)治療方案選擇方面，HLA-E表達(dá)水平也具有重要的價值。對于HLA-E高表達(dá)的HCC患者，由于其腫瘤細(xì)胞免疫逃逸能力較強(qiáng)，預(yù)后較差，臨床醫(yī)生可以考慮采取更積極的治療策略。在手術(shù)治療方面，對于符合手術(shù)指征的患者，可以在切除腫瘤的基礎(chǔ)上，適當(dāng)擴(kuò)大切除范圍，以降低腫瘤殘留和復(fù)發(fā)的風(fēng)險。術(shù)后輔助治療對于HLA-E高表達(dá)的患者尤為重要，可考慮聯(lián)合免疫治療和靶向治療。免疫治療通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，有望打破HLA-E介導(dǎo)的免疫逃逸。例如，免疫檢查點抑制劑可以阻斷免疫檢查點蛋白，如PD-1/PD-L1等，解除腫瘤細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的抑制，使免疫細(xì)胞能夠重新識別和殺傷腫瘤細(xì)胞。靶向治療則通過針對腫瘤細(xì)胞表面的特定靶點，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移信號通路，發(fā)揮抗腫瘤作用。對于HLA-E高表達(dá)的患者，聯(lián)合使用免疫治療和靶向治療，可能會取得更好的治療效果。侖伐替尼聯(lián)合帕博利珠單抗治療晚期HCC患者，在一些臨床試驗中顯示出較好的療效和安全性，為HLA-E高表達(dá)的HCC患者提供了新的治療選擇。此外，對于無法手術(shù)切除的HLA-E高表達(dá)患者，還可以考慮局部治療聯(lián)合全身治療的綜合方案。局部治療如射頻消融、微波消融、經(jīng)動脈化療栓塞等可以直接作用于腫瘤組織，縮小腫瘤體積，減輕腫瘤負(fù)荷；全身治療則可以通過血液循環(huán)到達(dá)全身，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。通過綜合運用多種治療手段，有望提高HLA-E高表達(dá)患者的治療效果，延長患者的生存期。對于HLA-E低表達(dá)的HCC患者，其腫瘤細(xì)胞免疫逃逸能力相對較弱，預(yù)后相對較好。在治療方案選擇上，可以根據(jù)患者的具體情況，采取相對保守的治療策略。對于早期患者，可優(yōu)先考慮手術(shù)切除或局部消融等根治性治療方法，這些方法創(chuàng)傷較小，患者恢復(fù)較快，且能夠有效控制腫瘤。對于中晚期患者，在評估患者身體狀況和腫瘤情況后，可以選擇合適的全身治療方案，如化療、靶向治療等。在治療過程中，應(yīng)密切關(guān)注患者的病情變化，根據(jù)治療反應(yīng)及時調(diào)整治療方案。對于一些對化療敏感的患者，可以適當(dāng)減少化療藥物的劑量，降低化療的副作用，提高患者的生活質(zhì)量。將HLA-E表達(dá)水平納入HCC患者的常規(guī)檢測項目，有助于實現(xiàn)HCC的精準(zhǔn)治療。通過檢測HLA-E表達(dá)水平，醫(yī)生可以為不同風(fēng)險的患者制定個性化的治療方案，避免過度治療或治療不足，提高治療效果，改善患者的預(yù)后。目前，免疫組織化學(xué)染色、蛋白質(zhì)免疫印跡法和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)已較為成熟，能夠準(zhǔn)確檢測HLA-E的表達(dá)水平，為其臨床應(yīng)用提供了技術(shù)支持。未來，隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，HLA-E檢測將更加便捷、準(zhǔn)確，有望在臨床廣泛推廣應(yīng)用。六、HLA-E在肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制6.1HLA-E與肝癌細(xì)胞免疫逃逸在肝細(xì)胞性肝癌（HCC）的發(fā)生發(fā)展過程中，免疫逃逸是腫瘤細(xì)胞得以生存和增殖的關(guān)鍵機(jī)制之一，而HLA-E在這一過程中扮演著重要角色，主要通過抑制NK細(xì)胞和T細(xì)胞功能，幫助肝癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。NK細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，能夠識別并殺傷腫瘤細(xì)胞，在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。HLA-E主要通過與NK細(xì)胞表面的抑制性受體CD94/NKG2A結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的殺傷活性。正常情況下，NK細(xì)胞表面的CD94/NKG2A與健康細(xì)胞表面的HLA-E結(jié)合，傳遞抑制信號，使NK細(xì)胞處于抑制狀態(tài)，避免對自身正常細(xì)胞的攻擊。在肝癌細(xì)胞中，HLA-E表達(dá)上調(diào)，大量的HLA-E與NK細(xì)胞表面的CD94/NKG2A結(jié)合，持續(xù)激活NK細(xì)胞內(nèi)的抑制性信號通路。這一過程涉及到一系列的分子事件，當(dāng)CD94/NKG2A與HLA-E結(jié)合后，其胞內(nèi)段的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）被磷酸化，招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2。這些磷酸酶被招募到CD94/NKG2A附近后，對下游信號分子如磷脂酶Cγ（PLCγ）、蛋白激酶C（PKC）等進(jìn)行去磷酸化修飾，阻斷NK細(xì)胞活化信號的傳導(dǎo)，從而抑制NK細(xì)胞的殺傷功能。研究表明，在肝癌細(xì)胞系中，上調(diào)HLA-E的表達(dá)可以顯著降低NK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷活性。通過基因沉默技術(shù)下調(diào)肝癌細(xì)胞中HLA-E的表達(dá)后，NK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷能力明顯增強(qiáng)。這充分說明HLA-E與CD94/NKG2A的結(jié)合是肝癌細(xì)胞逃避NK細(xì)胞免疫監(jiān)視的重要機(jī)制之一。T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著核心作用，可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。HLA-E對T細(xì)胞功能的影響主要體現(xiàn)在CD8+T細(xì)胞方面。在正常的免疫應(yīng)答過程中，腫瘤抗原被抗原提呈細(xì)胞（APC）攝取、加工處理后，與HLAⅠ類分子結(jié)合形成復(fù)合物，提呈給CD8+T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）識別，激活CD8+T細(xì)胞，使其分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。在肝癌細(xì)胞中，HLA-E的異常表達(dá)干擾了這一正常的免疫識別和激活過程。一方面，肝癌細(xì)胞上調(diào)HLA-E的表達(dá)，占據(jù)了APC表面的抗原提呈位點，使得腫瘤抗原無法有效地與HLAⅠ類分子結(jié)合并提呈給CD8+T細(xì)胞。另一方面，HLA-E與CD8+T細(xì)胞表面的TCR結(jié)合后，可能傳遞錯誤的信號，抑制CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，HLA-E高表達(dá)的區(qū)域，CD8+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量明顯減少，且CD8+T細(xì)胞的活性受到抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞因子分泌減少、增殖能力降低等。此外，HLA-E還可能通過影響T細(xì)胞的遷移和歸巢，使其難以到達(dá)腫瘤組織，進(jìn)一步削弱了T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視作用。腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞成分和細(xì)胞因子也參與了HLA-E介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞免疫逃逸過程。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，TAM可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長和免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，TAM分泌的白細(xì)胞介素10（IL-10）可以上調(diào)肝癌細(xì)胞中HLA-E的表達(dá)。IL-10通過與肝癌細(xì)胞表面的