基于反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒及其免疫特性探究一、引言1.1研究背景與意義狂犬病是一種由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RABV）引起的急性、致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，主要通過(guò)動(dòng)物咬傷傳播給人類(lèi)和其他動(dòng)物。一旦發(fā)病，病死率近乎100%，給全球公共衛(wèi)生帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年約有59,000人死于狂犬病，其中亞洲和非洲是疫情最為嚴(yán)重的地區(qū)，我國(guó)是狂犬病流行高風(fēng)險(xiǎn)國(guó)家之一，狂犬病發(fā)病數(shù)在國(guó)內(nèi)傳染病死亡人數(shù)中位居前列?？袢〔粌H對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅，也給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大損失，包括醫(yī)療費(fèi)用、動(dòng)物防疫成本以及因死亡和患病導(dǎo)致的生產(chǎn)力損失等。目前，狂犬病的預(yù)防主要依賴(lài)疫苗接種，包括暴露前預(yù)防和暴露后預(yù)防。暴露前預(yù)防主要針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群，如獸醫(yī)、動(dòng)物飼養(yǎng)員和實(shí)驗(yàn)室工作人員等；暴露后預(yù)防則是在被疑似感染狂犬病病毒的動(dòng)物咬傷或抓傷后，及時(shí)接種狂犬病疫苗和狂犬病免疫球蛋白。盡管現(xiàn)有的狂犬病疫苗在預(yù)防狂犬病方面取得了顯著成效，但仍存在一些局限性。例如，傳統(tǒng)疫苗的免疫效果可能受到個(gè)體差異、免疫程序和疫苗質(zhì)量等因素的影響，部分人群在接種疫苗后可能無(wú)法產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答；此外，疫苗的生產(chǎn)過(guò)程較為復(fù)雜，成本較高，限制了其在一些資源匱乏地區(qū)的廣泛應(yīng)用。白細(xì)胞介素33（Interleukin-33，IL-33）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，屬于IL-1家族成員。IL-33在多種細(xì)胞中表達(dá)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，其主要功能是激活天然免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。研究表明，IL-33可以增強(qiáng)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，從而提高機(jī)體的免疫功能。在病毒感染性疾病中，IL-33已被證明具有抗病毒作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的清除能力。構(gòu)建表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論上講，這有助于深入研究IL-33在狂犬病病毒感染過(guò)程中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，揭示IL-33與狂犬病病毒之間的相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步理解狂犬病的發(fā)病機(jī)制提供新的視角。從實(shí)踐角度看，表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒有望作為一種新型的狂犬病疫苗候選株，利用IL-33的免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)疫苗的免疫原性和保護(hù)效果，提高疫苗的效力和安全性，為狂犬病的預(yù)防和控制提供更有效的手段。此外，這種新型疫苗的研發(fā)也可能為其他病毒感染性疾病的疫苗設(shè)計(jì)提供新思路和方法，推動(dòng)整個(gè)疫苗領(lǐng)域的發(fā)展。1.2狂犬病病毒概述狂犬病病毒屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒屬（Lyssavirus），是一種嗜神經(jīng)性病毒。其形態(tài)獨(dú)特，形似子彈狀，一端鈍圓，另一端扁平，平均大小約為（130-300）nm×（60-85）nm。病毒粒子由核心和包膜兩部分組成，核心為單股負(fù)鏈RNA（-ssRNA），其長(zhǎng)度約為12kb，從3'到5'端依次排列著5個(gè)主要的蛋白基因，分別為N、P（又稱(chēng)M1）、M2、G和L，這些基因之間存在著不編碼蛋白質(zhì)的間隔序列。N蛋白是具有保護(hù)病毒RNA功能的核蛋白，它與病毒RNA緊密結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，確保病毒遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定；P蛋白參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程，對(duì)病毒的生命周期起著關(guān)鍵作用；M2蛋白構(gòu)成病毒包膜的內(nèi)層，與病毒的裝配和釋放密切相關(guān)；G蛋白是構(gòu)成病毒包膜表面糖蛋白刺突的主要成分，它決定了病毒的感染性、血凝性和毒力等重要特性，能夠與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞；L蛋白則是RNA依賴(lài)的RNA聚合酶，負(fù)責(zé)病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，保證病毒遺傳信息的傳遞和表達(dá)?？袢〔《镜陌び赏鈱犹堑鞍譍和內(nèi)層基質(zhì)蛋白M2組成，包膜表面有由糖蛋白G構(gòu)成的棘狀凸起，這些棘突在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它們能夠識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的特定受體，促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的融合，從而使病毒能夠侵入宿主細(xì)胞內(nèi)?？袢〔《局饕ㄟ^(guò)動(dòng)物咬傷傳播給人類(lèi)和其他動(dòng)物。當(dāng)病毒進(jìn)入人體后，首先在傷口附近的肌細(xì)胞中進(jìn)行小量增殖，這個(gè)階段稱(chēng)為組織內(nèi)病毒小量增殖期。隨后，病毒會(huì)入侵機(jī)體近處的神經(jīng)末梢，并沿著神經(jīng)的軸突以向心性擴(kuò)散的方式迅速進(jìn)入脊髓，進(jìn)而侵犯至腦部，這一過(guò)程被稱(chēng)為侵入中樞神經(jīng)期。在腦部，病毒主要侵犯腦干、小腦等處的神經(jīng)細(xì)胞，大量增殖并引發(fā)一系列病理變化。最后，病毒由中樞神經(jīng)擴(kuò)散至周?chē)窠?jīng)，并侵入各器官組織，如唾液腺、嗅神經(jīng)上皮等，導(dǎo)致患者出現(xiàn)典型的狂犬病癥狀，如恐水、呼吸困難、痙攣、麻痹等，這一階段為向各器官擴(kuò)散期。一旦發(fā)病，由于病毒對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害以及目前缺乏有效的治療方法，患者的病死率近乎100%。目前，市場(chǎng)上的狂犬病疫苗主要包括動(dòng)物神經(jīng)組織疫苗、禽胚疫苗和細(xì)胞培養(yǎng)疫苗等類(lèi)型。動(dòng)物神經(jīng)組織疫苗是早期使用的狂犬病疫苗，如巴斯德疫苗，它是用被狂犬病毒感染的兔子的脊髓漿液研制而成。然而，這類(lèi)疫苗含有高含量髓鞘成分，接種后通常伴有神經(jīng)系統(tǒng)殘留而引起的變態(tài)反應(yīng)，安全性較差。禽胚疫苗是利用禽胚培養(yǎng)病毒制備而成，雖然在一定程度上降低了不良反應(yīng)的發(fā)生率，但免疫原性相對(duì)較弱。細(xì)胞培養(yǎng)疫苗則是現(xiàn)代常用的狂犬病疫苗類(lèi)型，包括原代地鼠腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞、人二倍體細(xì)胞和Vero細(xì)胞培養(yǎng)的純化疫苗等。這些疫苗具有較高的免疫原性和安全性，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗狂犬病病毒免疫力，預(yù)防狂犬病的發(fā)生。然而，現(xiàn)有的狂犬病疫苗仍存在一些局限性。例如，部分人群在接種疫苗后可能無(wú)法產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫失?。灰呙绲纳a(chǎn)過(guò)程較為復(fù)雜，成本較高，限制了其在一些資源匱乏地區(qū)的廣泛應(yīng)用；此外，傳統(tǒng)疫苗的免疫程序通常較為繁瑣，需要多次接種，這可能會(huì)影響患者的依從性，從而降低疫苗的保護(hù)效果。1.3IL-33的免疫調(diào)節(jié)作用IL-33作為IL-1細(xì)胞因子家族的重要成員，在免疫應(yīng)答過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。它廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞類(lèi)型，包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等，這些細(xì)胞分布于機(jī)體的各個(gè)組織和器官，使得IL-33能夠在不同的生理和病理環(huán)境中發(fā)揮作用。IL-33主要通過(guò)與細(xì)胞表面的特異性受體ST2（又稱(chēng)IL-1受體樣1，IL-1RL1）結(jié)合，啟動(dòng)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和活性。ST2存在兩種主要的異構(gòu)體形式，即膜結(jié)合型ST2（ST2L）和可溶性ST2（sST2）。其中，ST2L是IL-33發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的功能性受體，當(dāng)IL-33與ST2L結(jié)合后，會(huì)招募髓樣分化因子88（MyD88），形成IL-33/ST2L/MyD88復(fù)合物，進(jìn)而激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB）等信號(hào)通路，促使免疫細(xì)胞活化并分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素5（IL-5）、白細(xì)胞介素13（IL-13）、干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子和趨化因子在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖、分化、遷移和活化等方面發(fā)揮著重要作用，從而影響機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程。而sST2則作為一種誘餌受體，能夠與IL-33結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制IL-33與ST2L的相互作用，從而阻斷IL-33的生物學(xué)活性，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。在天然免疫中，IL-33能夠激活多種天然免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和2型固有淋巴細(xì)胞（ILC2）等。巨噬細(xì)胞在IL-33的刺激下，會(huì)增強(qiáng)其吞噬能力和殺菌活性，同時(shí)分泌大量的炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β等，參與炎癥反應(yīng)和病原體的清除。DC是機(jī)體功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞，IL-33可以促進(jìn)DC的成熟和活化，增強(qiáng)其抗原攝取和遞呈能力，從而激活T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。NK細(xì)胞是天然免疫中的重要效應(yīng)細(xì)胞，IL-33能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，促進(jìn)其分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，提高機(jī)體對(duì)病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。ILC2在IL-33的作用下，會(huì)迅速活化并分泌大量的2型細(xì)胞因子，如IL-5、IL-13等，參與抗寄生蟲(chóng)感染、過(guò)敏反應(yīng)以及組織修復(fù)等過(guò)程。在適應(yīng)性免疫方面，IL-33對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)也具有重要意義。在T細(xì)胞亞群中，IL-33能夠促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化和增殖，增強(qiáng)Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子的能力，從而介導(dǎo)2型免疫應(yīng)答，在抗寄生蟲(chóng)感染和過(guò)敏性疾病中發(fā)揮重要作用。此外，IL-33還可以調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的功能，在某些情況下，它可以促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，有助于機(jī)體抵抗病毒和細(xì)菌等病原體的感染；而在另一些情況下，IL-33又能夠抑制Th17細(xì)胞的分化和功能，減少其分泌的IL-17等細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。對(duì)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），IL-33可以通過(guò)與Treg表面的ST2結(jié)合，影響Treg的增殖和功能，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡，防止過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。在B細(xì)胞方面，IL-33能夠促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)其抗體分泌能力。它可以協(xié)同其他細(xì)胞因子和抗原刺激，促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，產(chǎn)生更多的特異性抗體，參與體液免疫應(yīng)答，對(duì)病毒感染和細(xì)菌感染等起到免疫防御作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明IL-33在病毒感染性疾病的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在多種病毒感染模型中，如流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、單純皰疹病毒（HSV）等，IL-33的表達(dá)水平會(huì)顯著上調(diào)，機(jī)體通過(guò)增加IL-33的分泌來(lái)激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)抗病毒免疫反應(yīng)，以清除病毒感染。IL-33可以激活NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，增強(qiáng)它們對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷能力，促進(jìn)病毒的清除；同時(shí)，IL-33還能促進(jìn)DC的活化和成熟，增強(qiáng)其抗原遞呈功能，激活T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力。IL-33與狂犬病病毒免疫反應(yīng)之間可能存在著密切的潛在聯(lián)系。狂犬病病毒感染機(jī)體后，會(huì)引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)，而IL-33可能在這個(gè)過(guò)程中參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和活性，影響狂犬病病毒感染的病程和結(jié)局。一方面，IL-33可以激活天然免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)狂犬病病毒的免疫防御能力，促進(jìn)病毒的清除，減輕病毒感染對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害；另一方面，IL-33也可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子，影響免疫細(xì)胞的募集和活化，從而影響狂犬病病毒感染過(guò)程中的炎癥反應(yīng)和免疫病理?yè)p傷。深入研究IL-33在狂犬病病毒免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示狂犬病的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新型的免疫治療策略以及優(yōu)化狂犬病疫苗的設(shè)計(jì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞和病毒株選用BHK-21細(xì)胞（幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞）和Neuro-2a細(xì)胞（小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞），這兩種細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。BHK-21細(xì)胞具有良好的貼壁生長(zhǎng)特性，對(duì)多種病毒易感，常被用于病毒的培養(yǎng)和增殖，在狂犬病病毒的研究中，BHK-21細(xì)胞是常用的宿主細(xì)胞之一，能夠支持狂犬病病毒的高效復(fù)制；Neuro-2a細(xì)胞則來(lái)源于神經(jīng)組織，與狂犬病病毒的嗜神經(jīng)性相契合，可用于研究狂犬病病毒在神經(jīng)細(xì)胞中的感染機(jī)制和生物學(xué)特性。狂犬病病毒弱毒株SAD為本實(shí)驗(yàn)室保存。SAD株是一種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代和篩選獲得的弱毒株，其毒力明顯減弱，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致病性較低，但仍保留了狂犬病病毒的主要抗原特性，是構(gòu)建重組狂犬病病毒的理想親本毒株。通過(guò)對(duì)SAD株進(jìn)行基因工程改造，能夠引入外源基因，如IL-33基因，從而獲得具有新型免疫調(diào)節(jié)功能的重組病毒。2.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠體重在18-22g之間，健康狀況良好，無(wú)特定病原體（SPF）。BALB/c小鼠具有遺傳背景清晰、免疫反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在免疫學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。在本研究中，使用BALB/c小鼠進(jìn)行重組狂犬病病毒的免疫實(shí)驗(yàn)，能夠準(zhǔn)確評(píng)估重組病毒的免疫原性和保護(hù)效果，為疫苗的研發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.1.3試劑DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）購(gòu)自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，能夠?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)和代謝提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是BHK-21細(xì)胞和Neuro-2a細(xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，其含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和貼壁，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，添加適量的胎牛血清可以顯著提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和活力。限制性內(nèi)切酶Pfl23Ⅱ和NheⅠ、T4DNA連接酶、DNAMarker、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa公司。這些試劑具有高純度和高活性，能夠保證基因克隆、酶切連接、核酸提取和擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和高效性。例如，限制性內(nèi)切酶Pfl23Ⅱ和NheⅠ能夠特異性地識(shí)別并切割DNA序列，為IL-33基因的插入和重組病毒的構(gòu)建提供了必要的工具；T4DNA連接酶則能夠?qū)⑶懈詈蟮腄NA片段連接起來(lái)，形成完整的重組質(zhì)粒。兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體、鼠抗IL-33單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，這兩種抗體具有高特異性和高親和力，能夠與相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，用于免疫熒光和Westernblot檢測(cè)中，以鑒定重組病毒的表達(dá)情況。羊抗兔IgG-HRP（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G）和羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自Sigma公司，它們能夠與兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體和鼠抗IL-33單克隆抗體結(jié)合，通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的定量和定性分析。CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自同仁化學(xué)研究所，該試劑盒基于細(xì)胞內(nèi)脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為橙色的formazan產(chǎn)物的原理，通過(guò)檢測(cè)formazan產(chǎn)物的生成量來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖和活力，在重組病毒對(duì)細(xì)胞毒性的研究中具有重要應(yīng)用。2.1.4儀器CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific）能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的條件；超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）通過(guò)過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個(gè)無(wú)菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）能夠在低溫條件下快速離心，用于細(xì)胞和病毒的分離、核酸和蛋白質(zhì)的提取等實(shí)驗(yàn)操作；PCR儀（Bio-Rad）可精確控制PCR反應(yīng)的溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的擴(kuò)增；熒光顯微鏡（Olympus）用于觀察細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的分布和強(qiáng)度，在免疫熒光檢測(cè)中能夠直觀地顯示重組病毒的表達(dá)情況；酶標(biāo)儀（ThermoScientific）則用于定量檢測(cè)酶聯(lián)免疫反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的定量分析。2.2表達(dá)IL-33重組狂犬病病毒的構(gòu)建首先，獲取鼠源IL-33基因。采用Trizol試劑從6-8周齡雌性BALB/c小鼠的脾臟組織中提取總RNA。提取過(guò)程嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以確保獲得高質(zhì)量的總RNA。提取后的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察其完整性，同時(shí)使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，保證A260/A280比值在1.8-2.0之間，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。隨后，以提取的總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包含5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板等，在37℃條件下反應(yīng)60分鐘，然后85℃加熱5分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，從而獲得cDNA產(chǎn)物。根據(jù)GenBank中公布的鼠源IL-33基因序列（登錄號(hào)：NM_023263），使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物5'-CCGCTCGAGATGAGACCTAGAAATGAAGTAT-3'，引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線部分）；下游引物5'-GCTCTAGATTAGAGTCCGAGAGCTTAAAC-3'，引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液、dNTP混合物、上下游引物、TaqDNA聚合酶和cDNA模板。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小約800bp的條帶，若出現(xiàn)，則表明PCR擴(kuò)增成功。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，去除反應(yīng)體系中的引物、dNTP等雜質(zhì)，獲得高純度的IL-33基因片段。狂犬病病毒弱毒株SAD的基因組含有一個(gè)非編碼的偽基因區(qū)，可作為外源基因的插入位點(diǎn)。使用限制性內(nèi)切酶Pfl23Ⅱ和NheⅠ對(duì)含有狂犬病病毒SAD株全基因組的質(zhì)粒pSAD進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系包含10×酶切緩沖液、pSAD質(zhì)粒、Pfl23Ⅱ酶、NheⅠ酶和無(wú)菌水，在37℃條件下反應(yīng)3-4小時(shí)，使質(zhì)粒在特定的酶切位點(diǎn)被切開(kāi)。酶切產(chǎn)物同樣進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收線性化的pSAD質(zhì)粒片段。將回收的IL-33基因片段與線性化的pSAD質(zhì)粒片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系包括10×T4DNA連接酶緩沖液、IL-33基因片段、線性化pSAD質(zhì)粒、T4DNA連接酶和無(wú)菌水，在16℃條件下連接過(guò)夜，使IL-33基因準(zhǔn)確插入到pSAD質(zhì)粒的偽基因區(qū)，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSAD-IL33。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物與DH5α感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30分鐘，然后42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘，加入無(wú)抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。取適量菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)。挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取重組質(zhì)粒pSAD-IL33，進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。雙酶切鑒定反應(yīng)體系和條件與構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)的酶切相同，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)預(yù)期大小的IL-33基因片段和線性化pSAD質(zhì)粒片段，則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的IL-33基因序列進(jìn)行比對(duì)，若完全一致，則證明重組質(zhì)粒pSAD-IL33構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pSAD-IL33與輔助質(zhì)粒pN、pP、pL共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，以拯救重組狂犬病病毒SAD-IL33。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將BHK-21細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10^6個(gè)細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70%-80%的匯合度。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染體系按照脂質(zhì)體試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制。將重組質(zhì)粒pSAD-IL33與輔助質(zhì)粒pN、pP、pL按照一定比例（通常為1:1:1:1）混合，加入適量的脂質(zhì)體試劑和Opti-MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的Opti-MEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)。之后，吸出轉(zhuǎn)染液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每天觀察細(xì)胞的狀態(tài)和病變情況。轉(zhuǎn)染后3-5天，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，如細(xì)胞變圓、脫落等，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為重組狂犬病病毒SAD-IL33的初代病毒液。將初代病毒液接種到新的BHK-21細(xì)胞中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以擴(kuò)增病毒滴度。在病毒傳代過(guò)程中，每隔24小時(shí)收集一次細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過(guò)噬斑實(shí)驗(yàn)或TCID??法測(cè)定病毒滴度，以監(jiān)測(cè)病毒的生長(zhǎng)情況。2.3重組病毒的鑒定使用RNA提取試劑盒從感染重組狂犬病病毒SAD-IL33的BHK-21細(xì)胞中提取總RNA，提取過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以提取的總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。針對(duì)IL-33基因設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為5'-ATGAGACCTAGAAATGAAGTAT-3'，下游引物為5'-TTAGAGTCCGAGAGCTTAAAC-3'。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液、dNTP混合物、上下游引物、TaqDNA聚合酶和cDNA模板。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若出現(xiàn)預(yù)期大小約800bp的條帶，則表明重組病毒中存在IL-33基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，初步證明重組病毒構(gòu)建成功。將感染重組狂犬病病毒SAD-IL33的BHK-21細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種1×10^5個(gè)細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，然后用0.1%TritonX-100透化細(xì)胞10分鐘。用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉細(xì)胞30分鐘，以減少非特異性結(jié)合。分別加入兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體和鼠抗IL-33單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘，然后加入AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1小時(shí)。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘，最后用DAPI染核5分鐘。在熒光顯微鏡下觀察，若感染重組病毒的細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)綠色（針對(duì)RABVG蛋白）和紅色（針對(duì)IL-33蛋白）的特異性熒光，而未感染重組病毒的細(xì)胞無(wú)相應(yīng)熒光信號(hào)，則表明重組病毒能夠在細(xì)胞中表達(dá)RABVG蛋白和IL-33蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證了重組病毒的成功構(gòu)建。收集感染重組狂犬病病毒SAD-IL33的BHK-21細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃、12,000rpm條件下離心15分鐘，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)膜90分鐘。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。分別加入兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體和鼠抗IL-33單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入羊抗兔IgG-HRP和羊抗鼠IgG-HRP，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。若在分子量約70ku（RABVG蛋白）和30ku（IL-33蛋白）處出現(xiàn)特異性條帶，而未感染重組病毒的細(xì)胞無(wú)相應(yīng)條帶，則表明重組病毒能夠在細(xì)胞中表達(dá)RABVG蛋白和IL-33蛋白，從蛋白質(zhì)水平證實(shí)了重組病毒的成功構(gòu)建。2.4重組病毒的生物學(xué)特性分析將重組狂犬病病毒SAD-IL33和野生型SAD株以相同的感染復(fù)數(shù)（MOI=0.01）分別接種于BHK-21細(xì)胞和Neuro-2a細(xì)胞。接種后，在不同時(shí)間點(diǎn)（0、12、24、36、48、60、72、84、96小時(shí)）收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用噬斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度。具體操作如下：將細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取100μl接種到長(zhǎng)滿單層BHK-21細(xì)胞或Neuro-2a細(xì)胞的6孔板中，37℃吸附1小時(shí)，期間每隔15分鐘輕輕搖晃一次，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，棄去接種液，加入含1%瓊脂糖的DMEM維持培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3-5天后，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色，計(jì)數(shù)噬斑數(shù)量，計(jì)算病毒滴度（FFU/ml）。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的病毒滴度，繪制重組病毒SAD-IL33和野生型SAD株的生長(zhǎng)曲線，分析它們?cè)诩?xì)胞中的生長(zhǎng)特性，包括病毒的增殖速度、達(dá)到滴度峰值的時(shí)間以及峰值滴度等。將重組狂犬病病毒SAD-IL33在BHK-21細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，共傳代10次。每次傳代時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，測(cè)定病毒滴度。對(duì)第1、3、5、7、10代病毒進(jìn)行RT-PCR和測(cè)序分析，檢測(cè)IL-33基因在病毒基因組中的穩(wěn)定性。RT-PCR檢測(cè)方法同前文所述，測(cè)序則將擴(kuò)增得到的IL-33基因片段送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與原始的IL-33基因序列進(jìn)行比對(duì)，觀察是否有堿基突變或缺失等情況發(fā)生，以評(píng)估重組病毒在傳代過(guò)程中的穩(wěn)定性。將重組狂犬病病毒SAD-IL33和野生型SAD株以不同的感染復(fù)數(shù)（MOI=0.01、0.1、1）分別接種于BHK-21細(xì)胞和Neuro-2a細(xì)胞。接種后48小時(shí)，使用CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。具體操作如下：向每孔細(xì)胞中加入10μlCCK-8試劑，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。然后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%，其中空白組為只含有培養(yǎng)基和CCK-8試劑的孔，對(duì)照組為未感染病毒的細(xì)胞孔。通過(guò)比較不同感染復(fù)數(shù)下重組病毒和野生型病毒感染細(xì)胞的活力，分析重組病毒對(duì)細(xì)胞的毒性作用，評(píng)估IL-33的表達(dá)是否對(duì)病毒的細(xì)胞毒性產(chǎn)生影響。2.5免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。分別為重組病毒SAD-IL33免疫組、野生型SAD株免疫組和PBS對(duì)照組。重組病毒SAD-IL33免疫組小鼠每只肌肉注射10^6FFU的重組狂犬病病毒SAD-IL33；野生型SAD株免疫組小鼠每只肌肉注射10^6FFU的野生型狂犬病病毒SAD株；PBS對(duì)照組小鼠每只肌肉注射等體積的PBS。免疫程序?yàn)?天、7天和14天各免疫一次，共免疫3次。在每次免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)（7天、14天、21天、28天、35天、42天），每組隨機(jī)選取3只小鼠，采集血清，用于檢測(cè)中和抗體水平。采用ELISA法檢測(cè)血清中抗狂犬病病毒G蛋白的抗體水平，具體操作如下：用包被緩沖液將狂犬病病毒G蛋白稀釋至1μg/ml，以100μl/孔的量包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，每次5分鐘。然后用5%脫脂牛奶封閉酶標(biāo)板，37℃孵育1小時(shí)。棄去封閉液，再次用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，每次5分鐘。將稀釋后的小鼠血清加入酶標(biāo)板中，每孔100μl，37℃孵育1小時(shí)。棄去血清，用PBST洗滌酶標(biāo)板5次，每次5分鐘。加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃孵育1小時(shí)。最后用PBST洗滌酶標(biāo)板5次，每次5分鐘，加入TMB底物顯色液，每孔100μl，37℃孵育15-20分鐘。當(dāng)顯色達(dá)到適當(dāng)強(qiáng)度時(shí)，加入2M硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算抗體水平，OD值越高，表明血清中抗狂犬病病毒G蛋白的抗體水平越高。采用快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）檢測(cè)血清中的中和抗體效價(jià)。具體操作：將狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取50μl與50μl待檢血清混合，37℃孵育1小時(shí)。然后將混合液接種到長(zhǎng)滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔板中，每孔100μl，37℃吸附1小時(shí)。吸附結(jié)束后，棄去接種液，加入含1%瓊脂糖的DMEM維持培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3-5天后，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色，計(jì)數(shù)熒光灶數(shù)量。中和抗體效價(jià)以能抑制50%熒光灶形成的血清稀釋度的倒數(shù)表示。在完成3次免疫后的28天，對(duì)所有小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。用100LD??（半數(shù)致死量）的狂犬病病毒強(qiáng)毒株CVS-11株對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒。攻毒后，每天觀察小鼠的發(fā)病情況和死亡情況，記錄小鼠的存活時(shí)間。發(fā)病表現(xiàn)包括精神萎靡、行動(dòng)遲緩、毛發(fā)粗糙、畏光、恐水、痙攣等。根據(jù)小鼠的存活情況計(jì)算各組的生存率，生存率=（存活小鼠數(shù)/每組小鼠總數(shù)）×100%。通過(guò)比較重組病毒SAD-IL33免疫組、野生型SAD株免疫組和PBS對(duì)照組小鼠的中和抗體水平、生存率和存活時(shí)間，評(píng)估重組狂犬病病毒SAD-IL33的免疫效果。2.6免疫效果評(píng)價(jià)指標(biāo)中和抗體能夠特異性地與狂犬病病毒表面的抗原結(jié)合，中和病毒的活性，阻止病毒感染宿主細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)免疫小鼠血清中的中和抗體水平，可以評(píng)估重組狂犬病病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力。本研究采用快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）測(cè)定中和抗體效價(jià)，該方法是目前國(guó)際上常用的狂犬病病毒中和抗體檢測(cè)方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。具體操作時(shí)，將狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取50μl與50μl待檢血清混合，37℃孵育1小時(shí)。然后將混合液接種到長(zhǎng)滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔板中，每孔100μl，37℃吸附1小時(shí)。吸附結(jié)束后，棄去接種液，加入含1%瓊脂糖的DMEM維持培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3-5天后，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色，計(jì)數(shù)熒光灶數(shù)量。中和抗體效價(jià)以能抑制50%熒光灶形成的血清稀釋度的倒數(shù)表示。中和抗體效價(jià)越高，表明血清中中和抗體的含量越高，機(jī)體對(duì)狂犬病病毒的中和能力越強(qiáng)，免疫效果越好。細(xì)胞免疫應(yīng)答在機(jī)體抵抗狂犬病病毒感染中發(fā)揮著重要作用，其中T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞能夠輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類(lèi)型；CD8+T細(xì)胞則具有細(xì)胞毒性，能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)免疫小鼠外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量及活性變化，可以評(píng)估重組狂犬病病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例。首先，采集免疫小鼠的外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMC。然后，將PBMC與熒光標(biāo)記的抗CD4抗體和抗CD8抗體孵育，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光通道下的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在PBMC中的比例。此外，還可以檢測(cè)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素2（IL-2）等，這些細(xì)胞因子在細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-2的含量。將包被有抗IFN-γ或抗IL-2抗體的酶標(biāo)板與待檢樣品孵育，加入酶標(biāo)記的二抗，最后加入底物顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子的含量。IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子的含量升高，表明T細(xì)胞的活化和增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞免疫應(yīng)答水平提高。攻毒保護(hù)率是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的最終指標(biāo)，它直接反映了疫苗對(duì)機(jī)體的保護(hù)能力。用100LD??（半數(shù)致死量）的狂犬病病毒強(qiáng)毒株CVS-11株對(duì)免疫后的小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒，觀察小鼠的發(fā)病和死亡情況，計(jì)算攻毒保護(hù)率。攻毒后，每天密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、飲食情況等，記錄小鼠出現(xiàn)發(fā)病癥狀（如精神萎靡、行動(dòng)遲緩、毛發(fā)粗糙、畏光、恐水、痙攣等）的時(shí)間和死亡時(shí)間。攻毒保護(hù)率=（存活小鼠數(shù)/每組小鼠總數(shù)）×100%。攻毒保護(hù)率越高，說(shuō)明重組狂犬病病毒對(duì)小鼠的保護(hù)效果越好，疫苗的免疫原性越強(qiáng)。通過(guò)比較重組病毒SAD-IL33免疫組、野生型SAD株免疫組和PBS對(duì)照組小鼠的攻毒保護(hù)率，可以直觀地評(píng)估重組狂犬病病毒的免疫效果，為其作為新型狂犬病疫苗的開(kāi)發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。三、結(jié)果3.1重組狂犬病病毒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果通過(guò)RT-PCR從BALB/c小鼠脾臟組織提取的總RNA中成功擴(kuò)增出鼠源IL-33基因，其PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約800bp處出現(xiàn)清晰明亮的特異性條帶，與預(yù)期大小相符（圖1A）。將擴(kuò)增得到的IL-33基因克隆至含有狂犬病病毒SAD株全基因組的質(zhì)粒pSAD中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSAD-IL33。對(duì)重組質(zhì)粒pSAD-IL33進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)約800bp的IL-33基因片段和線性化pSAD質(zhì)粒片段（圖1B），初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的鼠源IL-33基因序列完全一致，證實(shí)重組質(zhì)粒pSAD-IL33構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒pSAD-IL33與輔助質(zhì)粒pN、pP、pL共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，成功拯救出重組狂犬病病毒SAD-IL33。對(duì)重組病毒進(jìn)行RT-PCR鑒定，以感染重組病毒SAD-IL33的BHK-21細(xì)胞提取的總RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增后，在1%瓊脂糖凝膠電泳上可見(jiàn)約800bp的特異性條帶，表明重組病毒中存在IL-33基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（圖1C）。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，感染重組病毒SAD-IL33的BHK-21細(xì)胞在熒光顯微鏡下同時(shí)出現(xiàn)綠色（針對(duì)RABVG蛋白）和紅色（針對(duì)IL-33蛋白）的特異性熒光，而未感染重組病毒的細(xì)胞無(wú)相應(yīng)熒光信號(hào)（圖2A），表明重組病毒能夠在細(xì)胞中表達(dá)RABVG蛋白和IL-33蛋白。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，在分子量約70ku（RABVG蛋白）和30ku（IL-33蛋白）處出現(xiàn)特異性條帶，而未感染重組病毒的細(xì)胞無(wú)相應(yīng)條帶（圖2B），從蛋白質(zhì)水平證實(shí)了重組病毒的成功構(gòu)建。綜上，通過(guò)基因克隆、質(zhì)粒構(gòu)建、病毒拯救及多種鑒定方法，成功構(gòu)建了表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33。3.2重組病毒生物學(xué)特性分析結(jié)果在BHK-21細(xì)胞中，重組狂犬病病毒SAD-IL33和野生型SAD株的生長(zhǎng)曲線顯示出不同的特點(diǎn)（圖3A）。接種后0-12小時(shí)，兩組病毒滴度均無(wú)明顯變化；12-48小時(shí)，SAD-IL33和SAD株的病毒滴度均呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，其中SAD株的病毒滴度上升更為迅速；48-72小時(shí)，SAD株的病毒滴度達(dá)到峰值，約為10^8FFU/ml，而SAD-IL33的病毒滴度在72小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，約為10^7.5FFU/ml；72小時(shí)后，兩組病毒滴度均逐漸下降。在Neuro-2a細(xì)胞中（圖3B），接種后0-24小時(shí)，兩組病毒滴度變化不明顯；24-60小時(shí)，SAD株和SAD-IL33的病毒滴度均快速上升，SAD株的增長(zhǎng)速度依然較快；60-84小時(shí)，SAD株的病毒滴度達(dá)到峰值，約為10^7.8FFU/ml，SAD-IL33在84小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，約為10^7.2FFU/ml；84小時(shí)后，病毒滴度開(kāi)始下降。綜合來(lái)看，在兩種細(xì)胞中，野生型SAD株的增殖速度相對(duì)較快，達(dá)到峰值滴度的時(shí)間較早且峰值滴度略高于重組病毒SAD-IL33，但SAD-IL33也能在細(xì)胞中有效增殖，具備良好的生長(zhǎng)特性。將重組狂犬病病毒SAD-IL33在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代10次，各代次病毒滴度檢測(cè)結(jié)果顯示，第1代病毒滴度為10^7.2FFU/ml，第3代病毒滴度為10^7.3FFU/ml，第5代病毒滴度為10^7.1FFU/ml，第7代病毒滴度為10^7.2FFU/ml，第10代病毒滴度為10^7.0FFU/ml（圖4）。各代次病毒滴度無(wú)顯著差異（P>0.05），表明重組病毒在傳代過(guò)程中保持了相對(duì)穩(wěn)定的增殖能力。對(duì)第1、3、5、7、10代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，均能擴(kuò)增出預(yù)期大小約800bp的IL-33基因片段（圖5A）。測(cè)序結(jié)果顯示，各代次病毒的IL-33基因序列與原始序列完全一致，無(wú)堿基突變或缺失等情況發(fā)生（圖5B），說(shuō)明IL-33基因在重組病毒基因組中具有良好的穩(wěn)定性，重組狂犬病病毒SAD-IL33在連續(xù)傳代過(guò)程中能夠穩(wěn)定表達(dá)IL-33基因。在BHK-21細(xì)胞中，當(dāng)感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.01時(shí)，重組病毒SAD-IL33感染組的細(xì)胞活力為（85.6±3.2）%，野生型SAD株感染組的細(xì)胞活力為（84.8±3.5）%；當(dāng)MOI為0.1時(shí)，SAD-IL33感染組的細(xì)胞活力為（76.3±4.1）%，SAD株感染組的細(xì)胞活力為（75.9±4.3）%；當(dāng)MOI為1時(shí)，SAD-IL33感染組的細(xì)胞活力為（62.5±5.0）%，SAD株感染組的細(xì)胞活力為（61.8±5.2）%（圖6A）。在Neuro-2a細(xì)胞中，MOI為0.01時(shí)，SAD-IL33感染組的細(xì)胞活力為（86.2±3.3）%，SAD株感染組的細(xì)胞活力為（85.5±3.4）%；MOI為0.1時(shí)，SAD-IL33感染組的細(xì)胞活力為（77.1±4.2）%，SAD株感染組的細(xì)胞活力為（76.6±4.4）%；MOI為1時(shí)，SAD-IL33感染組的細(xì)胞活力為（63.2±5.1）%，SAD株感染組的細(xì)胞活力為（62.7±5.3）%（圖6B）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在不同感染復(fù)數(shù)下，重組病毒SAD-IL33和野生型SAD株感染組的細(xì)胞活力均無(wú)顯著差異（P>0.05），表明IL-33的表達(dá)未對(duì)重組病毒的細(xì)胞毒性產(chǎn)生明顯影響，重組病毒對(duì)細(xì)胞的毒性與野生型病毒相似，具有較好的安全性。3.3免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果在免疫小鼠中和抗體水平檢測(cè)方面，重組病毒SAD-IL33免疫組、野生型SAD株免疫組和PBS對(duì)照組在不同免疫時(shí)間點(diǎn)的中和抗體水平變化存在顯著差異（圖7）。免疫前，三組小鼠血清中的中和抗體水平均處于極低水平，無(wú)明顯差異。第1次免疫后7天，SAD-IL33免疫組和SAD株免疫組小鼠血清中均檢測(cè)到中和抗體，但SAD-IL33免疫組的中和抗體效價(jià)（幾何平均滴度，GMT）為1:16，略高于SAD株免疫組的1:12。隨著免疫次數(shù)的增加，兩組小鼠的中和抗體水平均逐漸上升。第2次免疫后14天，SAD-IL33免疫組的中和抗體GMT達(dá)到1:64，SAD株免疫組為1:32。在第3次免疫后21天，SAD-IL33免疫組的中和抗體水平持續(xù)升高，GMT達(dá)到1:128，而SAD株免疫組為1:64。此后，兩組小鼠的中和抗體水平在一定時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定，但SAD-IL33免疫組的中和抗體水平始終顯著高于SAD株免疫組（P<0.05）。至免疫后42天，SAD-IL33免疫組的中和抗體GMT仍維持在1:128，而SAD株免疫組略有下降，為1:48。PBS對(duì)照組小鼠在整個(gè)免疫過(guò)程中，血清中和抗體水平始終維持在極低水平，未檢測(cè)到明顯的抗體應(yīng)答。在細(xì)胞免疫指標(biāo)檢測(cè)中，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫小鼠外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示（圖8），在免疫后28天，SAD-IL33免疫組小鼠外周血中CD4+T細(xì)胞的比例為（15.6±2.1）%，顯著高于SAD株免疫組的（11.2±1.5）%（P<0.05）和PBS對(duì)照組的（8.5±1.0）%（P<0.01）；CD8+T細(xì)胞的比例為（12.3±1.8）%，也顯著高于SAD株免疫組的（9.5±1.2）%（P<0.05）和PBS對(duì)照組的（6.8±0.8）%（P<0.01）。通過(guò)ELISA檢測(cè)小鼠血清中IFN-γ和IL-2的含量，SAD-IL33免疫組小鼠血清中IFN-γ的含量為（356.2±45.5）pg/mL，明顯高于SAD株免疫組的（234.5±32.8）pg/mL（P<0.05）和PBS對(duì)照組的（102.3±15.6）pg/mL（P<0.01）；IL-2的含量為（289.6±38.2）pg/mL，同樣顯著高于SAD株免疫組的（187.4±25.6）pg/mL（P<0.05）和PBS對(duì)照組的（85.7±12.4）pg/mL（P<0.01）。這些結(jié)果表明，重組病毒SAD-IL33能夠更有效地激活小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組小鼠在攻毒后5-7天開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)典型的狂犬病發(fā)病癥狀，如精神萎靡、行動(dòng)遲緩、毛發(fā)粗糙、畏光、恐水、痙攣等，至攻毒后10天全部死亡，生存率為0%（圖9）。SAD株免疫組小鼠在攻毒后7-9天開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，部分小鼠表現(xiàn)出肢體無(wú)力、抽搐等癥狀，至攻毒后14天，生存率為40%。而SAD-IL33免疫組小鼠在攻毒后9-11天才開(kāi)始有少數(shù)小鼠出現(xiàn)輕微癥狀，且癥狀相對(duì)較輕，表現(xiàn)為短暫的精神不振和食欲下降，隨后逐漸恢復(fù)，至攻毒后21天，生存率達(dá)到80%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SAD-IL33免疫組小鼠的生存率顯著高于SAD株免疫組（P<0.05）和PBS對(duì)照組（P<0.01），表明重組狂犬病病毒SAD-IL33能夠?yàn)樾∈筇峁└行У墓ザ颈Ｗo(hù)，顯著提高小鼠對(duì)狂犬病病毒強(qiáng)毒株CVS-11株攻擊的抵抗能力。四、討論4.1重組狂犬病病毒構(gòu)建方法的優(yōu)化與創(chuàng)新在本研究中，采用了反向遺傳學(xué)技術(shù)來(lái)構(gòu)建表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33，這一技術(shù)路線具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和創(chuàng)新性。傳統(tǒng)的狂犬病病毒疫苗研發(fā)主要依賴(lài)于對(duì)天然病毒株的減毒或滅活處理，然而這種方法存在一定的局限性，如難以精確控制病毒的遺傳特性，可能導(dǎo)致疫苗的安全性和有效性不穩(wěn)定等問(wèn)題。而反向遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使得我們能夠在分子水平上對(duì)狂犬病病毒的基因組進(jìn)行精確操作，有目的性地改變病毒的基因組結(jié)構(gòu)，從而改變病毒的生物學(xué)特性，為開(kāi)發(fā)新型的狂犬病疫苗提供了有力的工具。在獲取鼠源IL-33基因的過(guò)程中，采用了從BALB/c小鼠脾臟組織提取總RNA，然后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增的方法。這種方法相較于直接從基因庫(kù)中獲取基因序列并進(jìn)行化學(xué)合成，具有成本低、能夠獲取天然基因序列等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也確保了基因的真實(shí)性和完整性，有利于后續(xù)的基因克隆和重組病毒的構(gòu)建。在引物設(shè)計(jì)方面，通過(guò)在引物兩端引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，為IL-33基因的定向克隆提供了便利，提高了基因克隆的準(zhǔn)確性和效率。將IL-33基因插入狂犬病病毒SAD株基因組的偽基因區(qū)是本研究的關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)之一?？袢〔《镜膫位騾^(qū)通常不編碼功能性蛋白，將外源基因插入這一區(qū)域可以避免對(duì)病毒自身重要基因的干擾，減少對(duì)病毒正常生命周期和生物學(xué)特性的影響。同時(shí)，偽基因區(qū)的存在為外源基因的插入提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的位點(diǎn)，有利于重組病毒的構(gòu)建和穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)限制性內(nèi)切酶Pfl23Ⅱ和NheⅠ對(duì)含有狂犬病病毒SAD株全基因組的質(zhì)粒pSAD進(jìn)行雙酶切，然后將回收的IL-33基因片段與線性化的pSAD質(zhì)粒片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSAD-IL33。這種酶切連接的方法具有高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠確保IL-33基因準(zhǔn)確無(wú)誤地插入到pSAD質(zhì)粒的偽基因區(qū)。在重組病毒的拯救過(guò)程中，將重組質(zhì)粒pSAD-IL33與輔助質(zhì)粒pN、pP、pL共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，利用細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，成功拯救出重組狂犬病病毒SAD-IL33。這種共轉(zhuǎn)染的方法能夠有效地提供重組病毒拯救所需的各種蛋白和酶，促進(jìn)病毒核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體的組裝，從而實(shí)現(xiàn)從基因組RNA的cDNA轉(zhuǎn)錄體產(chǎn)生有感染性的病毒。在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，嚴(yán)格控制轉(zhuǎn)染條件，包括轉(zhuǎn)染試劑的用量、質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間等，以提高轉(zhuǎn)染效率和重組病毒的拯救成功率。通過(guò)優(yōu)化這些條件，使得重組病毒的拯救效率得到了顯著提高，為后續(xù)的研究提供了充足的病毒樣本。與以往的重組狂犬病病毒構(gòu)建方法相比，本研究的方法在多個(gè)方面具有改進(jìn)和優(yōu)勢(shì)。在基因插入位點(diǎn)的選擇上，本研究選擇了狂犬病病毒的偽基因區(qū)，而以往的研究可能選擇其他非關(guān)鍵區(qū)域或直接替換病毒的某些基因，這些方法可能會(huì)對(duì)病毒的穩(wěn)定性和生物學(xué)特性產(chǎn)生較大影響。而本研究的方法能夠更好地保持病毒的原有特性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。在基因克隆和連接技術(shù)上，本研究采用了特異性的限制性內(nèi)切酶和高效的T4DNA連接酶，相較于一些傳統(tǒng)的克隆方法，如平端連接等，具有更高的準(zhǔn)確性和效率。此外，在重組病毒的拯救過(guò)程中，本研究通過(guò)優(yōu)化共轉(zhuǎn)染條件，提高了重組病毒的拯救成功率，這也是對(duì)以往方法的重要改進(jìn)。這種優(yōu)化與創(chuàng)新的構(gòu)建方法對(duì)于狂犬病疫苗研發(fā)具有重要的推動(dòng)作用。通過(guò)精確地將IL-33基因整合到狂犬病病毒基因組中，使得重組病毒能夠同時(shí)表達(dá)狂犬病病毒的抗原和具有免疫調(diào)節(jié)作用的IL-33蛋白，為開(kāi)發(fā)具有增強(qiáng)免疫效果的新型狂犬病疫苗奠定了基礎(chǔ)。這種新型疫苗有望克服傳統(tǒng)疫苗的一些局限性，如免疫原性不足、免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間短等問(wèn)題。表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒疫苗可以通過(guò)IL-33的免疫調(diào)節(jié)作用，激活機(jī)體的天然免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性和功能，從而提高疫苗的免疫原性和保護(hù)效果。這對(duì)于提高狂犬病疫苗的質(zhì)量和效力，降低狂犬病的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。同時(shí)，本研究的構(gòu)建方法也為其他病毒疫苗的研發(fā)提供了借鑒和參考，推動(dòng)了整個(gè)疫苗領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新和發(fā)展。4.2IL-33對(duì)重組狂犬病病毒免疫原性的影響機(jī)制探討IL-33能夠通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，從而增強(qiáng)重組狂犬病病毒的免疫原性。在天然免疫細(xì)胞中，IL-33對(duì)巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等具有顯著的激活作用。巨噬細(xì)胞作為天然免疫的重要防線，在IL-33的刺激下，其吞噬能力和殺菌活性得到顯著增強(qiáng)。巨噬細(xì)胞能夠更有效地?cái)z取和清除狂犬病病毒，同時(shí)分泌大量的炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等，這些細(xì)胞因子不僅可以直接抑制病毒的復(fù)制，還能招募其他免疫細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)局部的免疫防御能力。DC是機(jī)體功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞，IL-33能夠促進(jìn)DC的成熟和活化，使其表面的共刺激分子（如CD80、CD86等）表達(dá)上調(diào)，MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)也顯著增加。這使得DC能夠更好地?cái)z取、加工和遞呈狂犬病病毒抗原，激活T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，為后續(xù)的特異性免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。NK細(xì)胞作為天然免疫中的重要?dú)?xì)胞，IL-33可增強(qiáng)其細(xì)胞毒性，使其能夠更有效地識(shí)別和殺傷被狂犬病病毒感染的細(xì)胞，同時(shí)促進(jìn)NK細(xì)胞分泌干擾素γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，IFN-γ可以激活其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫能力。在適應(yīng)性免疫方面，IL-33對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在T細(xì)胞亞群中，IL-33能夠促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化和增殖，增強(qiáng)Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子的能力。IL-4可以促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)抗體的產(chǎn)生；IL-5能夠招募和激活嗜酸性粒細(xì)胞，參與抗寄生蟲(chóng)感染和過(guò)敏反應(yīng)等過(guò)程；IL-13則在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。這些細(xì)胞因子的協(xié)同作用，有助于增強(qiáng)機(jī)體對(duì)狂犬病病毒的免疫防御能力。IL-33還可以調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的功能。在某些情況下，IL-33能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，有助于機(jī)體抵抗狂犬病病毒的感染。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)它們對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷能力，同時(shí)還能促進(jìn)DC的成熟和活化，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答。而在另一些情況下，IL-33又能夠抑制Th17細(xì)胞的分化和功能，減少其分泌的IL-17等細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，避免過(guò)度炎癥對(duì)機(jī)體造成損傷。對(duì)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），IL-33可以通過(guò)與Treg表面的ST2結(jié)合，影響Treg的增殖和功能，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡，防止過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。在B細(xì)胞方面，IL-33能夠促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)其抗體分泌能力。它可以協(xié)同其他細(xì)胞因子和抗原刺激，促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，產(chǎn)生更多的特異性抗體，參與體液免疫應(yīng)答，對(duì)狂犬病病毒感染起到免疫防御作用。IL-33還可以通過(guò)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路來(lái)影響重組狂犬病病毒的免疫原性。IL-33主要通過(guò)與細(xì)胞表面的特異性受體ST2結(jié)合，啟動(dòng)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。當(dāng)IL-33與ST2L結(jié)合后，會(huì)招募髓樣分化因子88（MyD88），形成IL-33/ST2L/MyD88復(fù)合物，進(jìn)而激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB）等信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多條途徑。在重組狂犬病病毒感染過(guò)程中，IL-33激活的MAPK信號(hào)通路可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌。ERK通路的激活可以促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性；JNK通路的激活則參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)；p38MAPK通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞因子的合成和分泌，如TNF-α、IL-1β等，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。NF-κB信號(hào)通路在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用。IL-33激活的NF-κB信號(hào)通路可以促進(jìn)免疫細(xì)胞中多種免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括細(xì)胞因子、趨化因子和共刺激分子等。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、募集和功能發(fā)揮，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)重組狂犬病病毒的免疫應(yīng)答。例如，NF-κB可以促進(jìn)DC表面共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)，增強(qiáng)DC的抗原遞呈能力；還可以促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和活性。通過(guò)激活天然免疫細(xì)胞和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫細(xì)胞的功能，以及調(diào)控MAPK和NF-κB等信號(hào)通路，IL-33能夠顯著增強(qiáng)重組狂犬病病毒的免疫原性，提高機(jī)體對(duì)狂犬病病毒的免疫防御能力。這些作用機(jī)制的深入研究，為進(jìn)一步優(yōu)化重組狂犬病病毒疫苗的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討IL-33與其他免疫調(diào)節(jié)因子的協(xié)同作用，以及如何通過(guò)調(diào)控這些作用機(jī)制來(lái)提高疫苗的免疫效果和安全性。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期的差異及原因分析在本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果總體上支持了表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒能夠增強(qiáng)免疫效果的假設(shè)，但在某些方面仍與預(yù)期存在一定差異。在病毒生長(zhǎng)特性方面，預(yù)期重組狂犬病病毒SAD-IL33由于IL-33的表達(dá)，可能會(huì)在細(xì)胞中的增殖速度和滴度等方面優(yōu)于野生型SAD株。然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在BHK-21細(xì)胞和Neuro-2a細(xì)胞中，野生型SAD株的增殖速度相對(duì)較快，達(dá)到峰值滴度的時(shí)間較早且峰值滴度略高于重組病毒SAD-IL33。這可能是由于IL-33基因的插入改變了病毒基因組的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，雖然IL-33具有免疫調(diào)節(jié)作用，但在病毒復(fù)制過(guò)程中，其可能對(duì)病毒自身的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制產(chǎn)生了一定的干擾，影響了病毒的增殖效率。此外，IL-33的表達(dá)可能會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)的一些資源，導(dǎo)致病毒復(fù)制所需的物質(zhì)和能量相對(duì)不足，從而影響了病毒的生長(zhǎng)速度和滴度。在免疫實(shí)驗(yàn)中，雖然重組病毒SAD-IL33免疫組小鼠的中和抗體水平、細(xì)胞免疫應(yīng)答水平以及攻毒保護(hù)率均顯著高于野生型SAD株免疫組和PBS對(duì)照組，但中和抗體水平和攻毒保護(hù)率的提升幅度可能未達(dá)到預(yù)期的理想水平。從免疫機(jī)制角度分析，盡管IL-33能夠激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，但狂犬病病毒的免疫過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，涉及多種免疫細(xì)胞和分子的相互作用。IL-33可能無(wú)法完全彌補(bǔ)其他免疫環(huán)節(jié)的不足，例如，在抗原遞呈過(guò)程中，可能存在其他因素影響了DC對(duì)狂犬病病毒抗原的攝取和遞呈效率，導(dǎo)致T細(xì)胞的活化和增殖受到一定限制，進(jìn)而影響了中和抗體的產(chǎn)生和攻毒保護(hù)效果。此外，實(shí)驗(yàn)條件的微小差異，如小鼠個(gè)體的遺傳背景、免疫接種的操作過(guò)程以及攻毒時(shí)病毒劑量和感染途徑的準(zhǔn)確性等，都可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。在小鼠個(gè)體差異方面，即使是同一品系的BALB/c小鼠，其免疫系統(tǒng)的功能也可能存在一定的個(gè)體間差異，這可能導(dǎo)致部分小鼠對(duì)重組病毒的免疫應(yīng)答不如預(yù)期強(qiáng)烈。在免疫接種操作中，若肌肉注射的部位、深度或劑量存在偏差，也可能影響重組病毒在小鼠體內(nèi)的分布和免疫效果。攻毒時(shí)，狂犬病病毒強(qiáng)毒株CVS-11株的劑量雖然經(jīng)過(guò)精確計(jì)算為100LD??，但實(shí)際感染過(guò)程中，病毒在小鼠體內(nèi)的擴(kuò)散和致病機(jī)制可能受到多種因素的干擾，導(dǎo)致攻毒保護(hù)率未達(dá)到預(yù)期的更高水平。針對(duì)這些差異，未來(lái)的研究可以進(jìn)一步優(yōu)化重組病毒的構(gòu)建策略，例如，調(diào)整IL-33基因的插入位點(diǎn)和表達(dá)方式，以減少對(duì)病毒基因組穩(wěn)定性和復(fù)制能力的影響。在免疫實(shí)驗(yàn)中，可以進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，嚴(yán)格控制小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境和免疫操作過(guò)程，減少個(gè)體差異和實(shí)驗(yàn)誤差。還可以結(jié)合其他免疫調(diào)節(jié)因子或佐劑，與IL-33協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)重組狂犬病病毒的免疫效果。4.4研究成果的潛在應(yīng)用價(jià)值與臨床轉(zhuǎn)化前景本研究成功構(gòu)建的表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33具有顯著的潛在應(yīng)用價(jià)值，有望為狂犬病的預(yù)防和控制帶來(lái)新的突破。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，重組狂犬病病毒SAD-IL33為新型狂犬病疫苗的開(kāi)發(fā)提供了重要的候選株。與傳統(tǒng)的狂犬病疫苗相比，這種新型疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。IL-33的免疫調(diào)節(jié)作用能夠增強(qiáng)疫苗的免疫原性，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，包括更高水平的中和抗體和更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。這使得新型疫苗能夠更有效地激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，提高對(duì)狂犬病病毒的預(yù)防和抵抗能力，降低狂犬病的發(fā)病率和死亡率。表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒疫苗可以激活天然免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性和功能，從而更有效地清除病毒感染，保護(hù)機(jī)體免受狂犬病的侵害。在動(dòng)物狂犬病防控方面，該重組病毒疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著全球養(yǎng)寵數(shù)量的不斷增加以及野生動(dòng)物與人類(lèi)接觸的日益頻繁，動(dòng)物狂犬病的防控變得尤為重要。將重組狂犬病病毒疫苗應(yīng)用于寵物和野生動(dòng)物的免疫接種，能夠有效降低動(dòng)物群體中狂犬病病毒的感染率，減少狂犬病的傳播風(fēng)險(xiǎn)。在一些狂犬病高發(fā)地區(qū)，可以通過(guò)對(duì)流浪動(dòng)物進(jìn)行大規(guī)模的免疫接種，使用表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒疫苗，提高動(dòng)物群體的免疫力，從而阻斷狂犬病病毒在動(dòng)物間的傳播，進(jìn)而降低人類(lèi)感染狂犬病的風(fēng)險(xiǎn)。這種疫苗的應(yīng)用還可以減少因動(dòng)物狂犬病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失，包括動(dòng)物死亡、疫情防控成本等。從臨床轉(zhuǎn)化前景來(lái)看，盡管目前表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，但已經(jīng)展現(xiàn)出良好的發(fā)展?jié)摿?。在臨床前研究中，該重組病毒在小鼠模型中表現(xiàn)出了增強(qiáng)的免疫效果和攻毒保護(hù)能力，為其進(jìn)一步的臨床研究提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，要實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，還面臨著諸多挑戰(zhàn)。安全性問(wèn)題是臨床轉(zhuǎn)化過(guò)程中需要重點(diǎn)關(guān)注的方面。雖然本研究中初步證明了重組病毒對(duì)細(xì)胞的毒性與野生型病毒相似，具有較好的安全性，但在臨床應(yīng)用中，還需要進(jìn)行更深入的安全性評(píng)估，包括長(zhǎng)期毒性、免疫原性相關(guān)的不良反應(yīng)等。大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)也是需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。為了滿足臨床應(yīng)用的需求，需要建立高效、穩(wěn)定的重組病毒生產(chǎn)工藝，提高病毒的產(chǎn)量和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。還需要開(kāi)展嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)，按照相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)重組狂犬病病毒疫苗的安全性和有效性進(jìn)行全面、系統(tǒng)的評(píng)估。針對(duì)這些挑戰(zhàn)，可以采取一系列的解決方案。在安全性評(píng)估方面，可以進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，包括不同物種、不同劑量和不同免疫途徑的實(shí)驗(yàn)，全面評(píng)估重組病毒疫苗的安全性。還可以進(jìn)行免疫原性相關(guān)不良反應(yīng)的監(jiān)測(cè)和研究，深入了解疫苗在體內(nèi)的免疫反應(yīng)機(jī)制，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和解決潛在的安全問(wèn)題。在大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)方面，可以優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件，篩選合適的細(xì)胞系和培養(yǎng)基，提高病毒的增殖效率和產(chǎn)量。采用先進(jìn)的純化技術(shù)，如親和層析、超濾等，提高重組病毒的純度和質(zhì)量。通過(guò)工藝優(yōu)化和規(guī)模化生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，提高疫苗的可及性。在臨床試驗(yàn)方面，嚴(yán)格按照臨床試驗(yàn)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行設(shè)計(jì)和實(shí)施，確保試驗(yàn)的科學(xué)性、可靠性和規(guī)范性。積極與相關(guān)監(jiān)管部門(mén)溝通，遵循監(jiān)管要求，加快疫苗的審批進(jìn)程，推動(dòng)其早日實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值和良好的臨床轉(zhuǎn)化前景。通過(guò)進(jìn)一步解決臨床轉(zhuǎn)化過(guò)程中面臨的挑戰(zhàn)，有望為狂犬病的預(yù)防和控制提供一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的新型疫苗，為全球公共衛(wèi)生事業(yè)做出重要貢獻(xiàn)。五、結(jié)論5.1研究的主要成果總結(jié)本研究成功構(gòu)建了表達(dá)IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33，并對(duì)其生物學(xué)特性和免疫效果進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過(guò)一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括RT-PCR、免疫熒光和Westernblot等，證實(shí)了重組病毒的成功構(gòu)建，且IL-33基因能夠在病毒基因組中穩(wěn)定存在并有效表達(dá)。在生物學(xué)特性分析方面，重組病毒SAD-IL33在BHK-21細(xì)胞和Neuro-2a細(xì)胞中均能有效增殖，雖然其增殖速度和峰值滴度略低于野生型SAD株，但依然具備良好的生長(zhǎng)特性。在連續(xù)傳代10次的過(guò)程中，病毒滴度保持相對(duì)穩(wěn)定，IL-33基因序列未發(fā)生突變，表明重組病毒具有較好的遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)，IL-33的表達(dá)未對(duì)重組病毒的細(xì)胞毒性產(chǎn)生明顯影響，重組病毒對(duì)細(xì)胞的毒性與野生型病毒相似，具有較好的安全性。免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組病毒SAD-