Q/LB.□XXXXX-XXXXDB43/TXXXX—XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14原理 15試劑和材料 26儀器和設(shè)備 27分析步驟 28結(jié)果計(jì)算及表示 39精密度 410其他 4附錄A 5前言本本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由湖南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局提出。本文件由湖南省食品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：湖南英氏營(yíng)養(yǎng)食品有限公司、中南林業(yè)科技大學(xué)。本文件主要起草人:本文件為首次發(fā)布。粉狀食品中總肽含量的測(cè)定范圍本文件規(guī)定了粉狀食品中總肽含量測(cè)定的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算和表示、精密度、檢出限和定量限等內(nèi)容。本文件適用于粉狀食品中總肽含量的測(cè)定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。粉狀食品powderedfoods粉狀食品是指含有天然肽的粉末狀食品，以及利用動(dòng)（植）物蛋白質(zhì)為原料，通過酶解或者微生物發(fā)酵法加工后得到分子量小于6,000道爾頓降解肽的粉末狀食品。總肽含量totalcontentofpeptide粉狀食品中肽類物質(zhì)的總量，以占試樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來表示。原理利用中性磷酸鹽緩沖液超聲輔助法提取樣品中的可溶性蛋白質(zhì)和多肽，酸沉法去除提取液中的蛋白質(zhì)，通過雙縮脲試劑與酰胺鍵的顯色反應(yīng)，采用紫外-可見光吸收光譜儀和標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣品中總肽的含量。酸沉酸沉是利用調(diào)整溶液的pH值使蛋白質(zhì)的溶解度降低，從而促使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來的過程。雙縮脲比色法在強(qiáng)堿性條件下，酰胺鍵與硫酸銅生成紫紅色絡(luò)合物，其吸光度與酰胺鍵的數(shù)量成正比，通過紫外-可見光吸收光譜分析法測(cè)定540nm波長(zhǎng)下的吸光度值，計(jì)算總肽的含量。試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。試劑三氯乙酸（CCl3COOH）。氫氧化鈉（NaOH）。硫酸銅（CuSO4·5H2O）。酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）。磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）。磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）：純度≥99%。注：BSA濃度為1.0mg/ml時(shí)在280nm波長(zhǎng)下的吸光度值為0.66來校正其純度。溶液配制10%氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取50.00g氫氧化鈉(5.1.2)，置入500mL容量瓶中，加煮沸后冷卻至室溫的水溶解，后定容至刻度。雙縮脲試劑：稱取1.5g硫酸銅(5.1.3)、6.0g酒石酸鉀鈉(5.1.4)，置入1,000mL燒杯中，加入500mL水溶解，在玻璃棒攪拌下緩慢加入300mL10%氫氧化鈉溶液（5.2.1），轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，加水定容至刻度，貯存于聚乙烯瓶中。三氯乙酸溶液（150g/L）：稱取150g三氯乙酸(5.1.1)，置入1,000mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。磷酸鹽緩沖液（20mmol/L，pH=7.0）：準(zhǔn)確稱取3.12g的磷酸二氫鈉（5.1.5）和7.16g的磷酸氫二鈉（5.1.6），分別置入1,000mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得到0.2mol/L的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉母液。分別量取39mL的磷酸二氫鈉和61mL的磷酸氫二鈉母液置入1,000mL容量瓶中，混勻，加水定容至刻度，即得到20mmol/L的磷酸緩沖液（pH=7.0））。牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10mg/mL）：準(zhǔn)確稱取1.0g牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（5.1.7）（精確至0.0001g），置入100mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（5.2.4）溶解并定容至刻度，4℃保存，有效期1個(gè)月。儀器和設(shè)備紫外-可見光吸收光譜儀（波長(zhǎng)范圍190～900nm，配備1cm比色皿）。高速冷凍離心機(jī)（≥10,000r/min）。分析天平（感量0.0001g）。超聲波清洗器。渦旋振蕩器。分析步驟試樣溶液的制備提取準(zhǔn)確稱取1.0g樣品（精確至0.0001g），置入25mL塑料離心管中，加入10mL磷酸鹽緩沖液（5.2.4），放入超聲波清洗器超聲提取15min，靜置10min，后10,000r/min離心10min，取上清液，即為可溶性蛋白質(zhì)和多肽提取液。酸沉吸取5mL可溶性蛋白質(zhì)和多肽提取液（7.1.1），置入15mL塑料離心管中，加入2.5mL三氯乙酸溶液（5.2.3），渦旋振蕩5min，靜置10min，后10,000r/min離心10min，取上清液，即為試樣溶液，備用?？傠暮繙y(cè)定牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別吸取2.0、4.0、6.0、8.0、和10mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.2.5），置入10mL容量瓶中，再用磷酸鹽緩沖液（5.2.4）稀釋至刻度，即得濃度為2.0～10.0mg/mL系列牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（每個(gè)濃度配制3份標(biāo)準(zhǔn)溶液）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取2.0mL系列蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（7.2.1），置入15mL塑料離心管中，加入8.0mL雙縮脲試劑（5.2.2），混勻后室溫靜置20min進(jìn)行顯色反應(yīng)，吸取3.0mL反應(yīng)后溶液移入1cm比色皿中，測(cè)定540nm波長(zhǎng)處吸光度，用磷酸鹽緩沖液（5.2.4）代替蛋白質(zhì)溶液作為空白對(duì)照液。每份標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定2次求平均值，以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)（示例見附錄A）。樣品測(cè)定吸取2.0mL試樣溶液（7.1.2），置入15mL塑料離心管中，加入8.0mL雙縮脲試劑（5.2.2），混勻后室溫靜置20min進(jìn)行顯色反應(yīng)，吸取3.0mL反應(yīng)后溶液移入1cm比色皿中，測(cè)定540nm波長(zhǎng)處吸光度，根據(jù)線性方程計(jì)算總肽含量結(jié)果計(jì)算和表示結(jié)果計(jì)算試樣中總肽含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)X計(jì)，數(shù)值以克每百克（g/100g）表示，結(jié)果按式（1）計(jì)算（1）式中：X———總肽含量（g/100g）；C———標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的肽濃度（mg/mL）；V———試樣最終定容體積（mL）；M———試樣質(zhì)量（g）。結(jié)果表示。測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示,當(dāng)總肽含量大于或等于1.0g/100g時(shí),結(jié)果保留兩位小數(shù)，當(dāng)總肽含量小于1.0g/100g時(shí),結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。精密度精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。其他當(dāng)試樣稱重量為