基因工程考點(diǎn)三年考情分析2025考向預(yù)測(cè)

基因工程2024山東T13,2024廣東T21,2024全國(guó)甲T38,2024全國(guó)新課標(biāo)T35,2024山東T25,2024河北T22,2024湖南21，2024江西12，

2023全國(guó)新課標(biāo)T6,2023山東T25,2023全國(guó)甲T38,2023全國(guó)乙T38,2023江蘇T22,2023廣東T20,2022山東T25,2022廣東T22,2022全國(guó)乙T38,2022全國(guó)乙T38,1.考點(diǎn)預(yù)測(cè)：命題點(diǎn)是對(duì)遺傳學(xué)、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程等知識(shí)點(diǎn)的綜合考查。主要包括PCR技術(shù)、基因編輯技術(shù)、目的基因檢測(cè)等。2.考法預(yù)測(cè)：題目情境的呈現(xiàn)形式多樣，基本以復(fù)雜情境為主，體現(xiàn)了課程理念，聯(lián)系生產(chǎn)、生活實(shí)踐，注重考查解決實(shí)際問(wèn)題的能力，考查的多是各大工程的基本原理、基本方法步驟、基本技能及應(yīng)用，體現(xiàn)了對(duì)知識(shí)綜合運(yùn)用、融會(huì)貫通的要求?；蚬こ潭嘁宰钚禄蚬こ萄芯砍晒麨檩d體，考查基因工程的工具與操作程序。大多以基因編輯為主線，通過(guò)模式圖的形式呈現(xiàn)，部分輔以電泳圖進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。在高考命題中，主要考查在特定情境下，通過(guò)設(shè)計(jì)合適的引物、利用特定限制酶剪切，進(jìn)行基因編輯或基因拼接，達(dá)到改變特定基因、實(shí)現(xiàn)基因重組、獲得融合蛋白等目的，操作過(guò)程復(fù)雜，所涉及的內(nèi)容為當(dāng)前最前沿的技術(shù)成果等。蛋白質(zhì)工程2024天津T5，2022重慶T3，生物技術(shù)安全性2024浙江T1，2023浙江T2，2022北京T21，

考情透視

目標(biāo)導(dǎo)航高頻易錯(cuò)查落實(shí)

1.(選擇性必修3P77)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供

、

、

和耐高溫的

。2.(選擇性必修3P77)真核細(xì)胞和細(xì)菌的

都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段______________

，引物的作用是________________

。DNA模板2種引物4種脫氧核苷酸DNA聚合酶DNA聚合酶能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸3.(選擇性必修3P80)基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的：使目的基因__________

，同時(shí)，使目的基因能夠___________。4.(選擇性必修3P81)轉(zhuǎn)化：________________________________________

。在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代表達(dá)和發(fā)揮作用目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程5.(選擇性必修3P82)目的基因的檢測(cè)與鑒定：首先是分子水平的檢測(cè)，包括通過(guò)

等技術(shù)檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測(cè)Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；從轉(zhuǎn)基因棉花中提取

，用相應(yīng)的____進(jìn)行

，檢測(cè)Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲(chóng)蛋白等。其次，還需要進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。例如，通過(guò)_______________________來(lái)確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲(chóng)特性以及抗性的程度。PCR蛋白質(zhì)抗體抗原—抗體雜交采摘抗蟲(chóng)棉的葉片飼喂棉鈴蟲(chóng)基因工程蛋白質(zhì)工程結(jié)果改造蛋白質(zhì)制造新蛋白質(zhì)操作對(duì)象：基因均可連接工具特點(diǎn)：專一性T4DNA連接酶限制酶結(jié)果DNA連接酶運(yùn)載體E.coliDNA連接酶平末端黏性末端質(zhì)粒分子水平檢測(cè)：PCR技術(shù)、抗原-抗體雜交技術(shù)目的基因的檢測(cè)與鑒定DNA復(fù)制目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建常用方法：PCR擴(kuò)增核心步驟操作程序?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞植物：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法動(dòng)物：顯微注射法微生物：感受態(tài)細(xì)胞處理法個(gè)體水平檢測(cè)：接種實(shí)驗(yàn)鈣離子處理抗原抗體特異性結(jié)合建網(wǎng)絡(luò)疏主干核心點(diǎn)1——PCR技術(shù)與應(yīng)用【真題引領(lǐng)】1.(2020·北京，12)為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹(shù)中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹(shù)基因組中(如圖)。為檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是（

）

A.①＋③

B.①＋②

C.③＋②

D.③＋④B強(qiáng)化練P263變式：(1)(2020·山東，25節(jié)選)通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是_____________________________________________________。引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)一、PCR技術(shù)“引物”歸類分析講義P123(2)(經(jīng)典高考題節(jié)選)設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間發(fā)生_____________，而造成引物自連。同理也要避免引物之間的互補(bǔ)。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同且____________的引物需要設(shè)定更高的復(fù)性溫度。堿基互補(bǔ)配對(duì)G、C含量高(3)科學(xué)設(shè)計(jì)引物是PCR能否成功的關(guān)鍵，若引物的堿基過(guò)多或引物的G、C含量過(guò)高，會(huì)造成PCR的效率偏低，收獲的目的基因較少，原因是_______________________________________________________________。若對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)或多個(gè)條帶，從引物角度分析，原因可能是_____________________________。引物與模板鏈結(jié)合過(guò)于緊密，變性時(shí)引物不易與模板鏈脫離(影響變性)引物過(guò)短導(dǎo)致引物的特異性下降核心提煉1.引物與復(fù)性溫度(1)復(fù)性溫度：復(fù)性溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)；復(fù)性溫度低，擴(kuò)增效率高。(2)引物：①引物長(zhǎng)度越長(zhǎng)，越容易形成氫鍵，為避免出現(xiàn)錯(cuò)配，需要適當(dāng)提高復(fù)性溫度；②引物GC含量越高，容易出現(xiàn)非特異性結(jié)合，需要適當(dāng)提高復(fù)性溫度?！菊骖}引領(lǐng)】2.（1）(2022·山東，25節(jié)選)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過(guò)影響這一過(guò)程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或PΔ的功能。①為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是_________________________________________________________，為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。②PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖分析，出現(xiàn)該問(wèn)題的原因是能板鏈3′端的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸5′端_____________________________________________________________________________。修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來(lái)解決該問(wèn)題，具體修改方案是__________________________________________。P基因編碼鏈的第一個(gè)堿基與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取在引物中的EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加1個(gè)堿基講義P124(2)引物用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，X為某限制酶識(shí)別序列。擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的D核心提煉2.引物的設(shè)計(jì)為了使經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的基因能與載體正常結(jié)合，需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識(shí)別序列。其目的是

。保證目的基因定向插入載體并避免目的基因自身環(huán)化引物長(zhǎng)度適宜，引物GC含量適宜，引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列、引物5'端修飾，3’端不可以修飾等【真題引領(lǐng)】3.（2023山東.25）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。（1）與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是____________。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有________________________________________（答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可）。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物________________。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的_____________（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。（3）重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了______________，條帶2所檢出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。

J-V5融合蛋白不是RNA聚合酶標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)、限制酶切割位點(diǎn)等F2和R1或F1與R2

a鏈PCR技術(shù)不僅可以精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)入目的基因，還可以通過(guò)引物的巧妙設(shè)計(jì)鑒定目的基因的連接方式。核心提煉3.引物的選擇講義P124(2024·長(zhǎng)沙高三模擬)PCR引物的3′端有結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基，5′端無(wú)嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（

）A.圖中兩條子鏈合成一定都是從5′端向3′端延伸B.圖示表示復(fù)性階段，該過(guò)程的溫度與引物的長(zhǎng)短有關(guān)C.用圖示引物擴(kuò)增5次后，可以產(chǎn)生22個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物D.PCR每次循環(huán)都消耗引物和原料，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要及時(shí)補(bǔ)充D強(qiáng)化練P2635’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’思考：PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過(guò)幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？小結(jié)：引物的數(shù)量計(jì)算5.引物的數(shù)量計(jì)算(1)如圖：一個(gè)DNA分子n次擴(kuò)增，則：①子代DNA分子中等長(zhǎng)鏈的DNA分子數(shù)為_(kāi)_______個(gè)；②子代DNA分子中不等長(zhǎng)鏈的DNA分子數(shù)為_(kāi)____個(gè)；③子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為_(kāi)____個(gè)；④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子數(shù)為_(kāi)_______個(gè)；⑤復(fù)制過(guò)程中共需引物________個(gè)；⑥第n次復(fù)制需要引物______個(gè)。2n－2n2n22n－12n＋1－22n(2)已知引物1及引物2之間的序列為目的序列，若引物與DNA的結(jié)合位點(diǎn)如圖所示，在第_____輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條單鏈等長(zhǎng)的目的片段。2二、常用PCR技術(shù)“及原理1.利用重疊延伸PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點(diǎn)突變例1.如圖為利用重疊延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定點(diǎn)突變(A/T堿基對(duì)變?yōu)镚/C)的過(guò)程。該過(guò)程需設(shè)計(jì)四種引物，其中引物A、D與蛋白a基因的兩端完全配對(duì)，引物B、C雖與蛋白a基因中部配對(duì)，但在欲引入突變的位置替換為突變后的堿基。通過(guò)多次獨(dú)立的PCR達(dá)到目的。下列說(shuō)法不正確的是（

）A.PCR1所用引物應(yīng)為引物A和BB.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的產(chǎn)物為模板C.PCR3無(wú)需額外加入引物D.PCR4的作用是大量擴(kuò)增突變基因B講義P1252.利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)造融合基因例2.融合PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段連接起來(lái)的方法，其過(guò)程如圖1所示。圖2是中間載體1和中間載體2(利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建成)構(gòu)建成葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體示意圖(限制酶酶切位點(diǎn)標(biāo)注于載體外側(cè))，葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體通過(guò)與葉綠體基因的同源重組，將目的基因整合于葉綠體DNA上的特定位點(diǎn)上。請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：(1)圖1第一階段中PCR至少進(jìn)行______次循環(huán)，才能獲得雙鏈等長(zhǎng)的DNA，第二階段中引物2與引物3部分堿基的____________關(guān)系使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來(lái)。2互補(bǔ)配對(duì)(2)若通過(guò)融合PCR技術(shù)將啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、目的基因、終止子拼接起來(lái)，需要設(shè)計(jì)_____種引物，其中能夠起著“搭橋”作用的引物有____種。86講義P1263.利用反向PCR技術(shù)擴(kuò)增未知基因序列例3.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)。請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題：(1)如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的引物必須是________(從表格引物①②③④中選擇，填編號(hào))。②④講義P126例4.(不定項(xiàng))(2024·長(zhǎng)沙高三模擬)熒光定量PCR是一種定量計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量的方法。在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光探針，熒光探針可以摻入新合成的DNA鏈中，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中的熒光強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算初始模板量。如圖為某熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。下列說(shuō)法正確的是A.一定范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增出的DNA量呈正相關(guān)B.每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光探針的量相同C.樣品甲的初始模板量大于樣品乙D.熒光強(qiáng)度不再變化時(shí)PCR反應(yīng)停止ABC4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR強(qiáng)化練P2655.“雙脫氧法”基因測(cè)序例5.(不定項(xiàng))(2024·湖南，15)最早的雙脫氧測(cè)序法是在PCR反應(yīng)體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子鏈延伸時(shí)，雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，以加入ddATP的體系為例：若配對(duì)的為ddATP，延伸終止；若配對(duì)的為脫氧腺苷三磷酸(dATP)，繼續(xù)延伸；PCR產(chǎn)物變性后電泳檢測(cè)。通過(guò)該方法測(cè)序某疾病患者及對(duì)照個(gè)體的一段序列，結(jié)果如圖所示。下列敘述正確的是A.上述PCR反應(yīng)體系中只加入一種引物B.電泳時(shí)產(chǎn)物的片段越小，遷移速率越慢C.5′-CTACCCGTGAT-3′為對(duì)照個(gè)體的

一段序列D.患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)镚AC(1)雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每當(dāng)DNA鏈加入分子ddNTP時(shí)，延伸便終止。(2)每一次DNA測(cè)序是由4個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)組成的，4個(gè)PCR反應(yīng)體系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4個(gè)反應(yīng)體系分別加入不同的含有標(biāo)記的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反應(yīng)后，在反應(yīng)體系中就形成了大量起始點(diǎn)相同、終止點(diǎn)不同的DNA片段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出來(lái)，得到放射性同位素自顯影條帶，依據(jù)電泳條帶讀取DNA雙鏈的堿基序列。“雙脫氧法”基因測(cè)序原理解讀5.(2024·湖南，21節(jié)選)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價(jià)值，科研人員對(duì)其進(jìn)行了多種育種技術(shù)研究。研究人員從野生百合中獲得一個(gè)抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因L，該基因及其上游的啟動(dòng)子pL和下游的終止子結(jié)構(gòu)如圖a。圖b是一種Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中基因gus編碼GUS酶，GUS酶活性可反映啟動(dòng)子活性。(1)研究病原微生物對(duì)L的啟動(dòng)子pL活性的影響。從圖a所示結(jié)構(gòu)中獲取pL，首先選用_________________酶切，將其與相同限制酶酶切的Ti質(zhì)粒連接，再導(dǎo)入煙草。隨機(jī)選取3組轉(zhuǎn)基因成功的煙草(P1、P2和P3)進(jìn)行病原微生物脅迫，結(jié)果如圖c。由此可知：三種病原微生物都能誘導(dǎo)pL的活性增強(qiáng)，其中_________的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。HindⅢ、BamHⅠ交鏈格孢(2)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)栽培種百合B中也有L，但其上游的啟動(dòng)子與野生百合不同，且抗病性弱。若要提高該百合中L的表達(dá)量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，簡(jiǎn)要寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)思路：_____________________________________________________________________。PCR擴(kuò)增基因L及其PL；插入TI質(zhì)粒；利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入百合B體細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株；篩選L表達(dá)量提高的轉(zhuǎn)基因百合；用病原微生物侵染轉(zhuǎn)基因百合，檢測(cè)百合抗病能力。核心提煉：限制酶的選擇原則1、根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類：不破壞目的基因原則，

同種限制酶、同尾酶不同限制酶，2、根據(jù)載體的特點(diǎn)確定限制酶的種類：所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端②保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則變式.(2022·福建，13節(jié)選)載體和CD14片段的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切抗性基因序列如圖所示。用XhoⅠ和SalⅠ分別酶切CD14和圖中載體連接，CD14接入載體時(shí)會(huì)形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA?？蛇M(jìn)一步用這兩種限制酶對(duì)CD14的連接方向進(jìn)行鑒定，理由是_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。

正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點(diǎn)(限制酶的識(shí)別序列)；而反向連接的重組DNA會(huì)形成新的序列，沒(méi)有這兩種酶的酶切位點(diǎn)(沒(méi)有限制酶的識(shí)別序列)4.(2024·新課標(biāo)，35節(jié)選)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細(xì)菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如圖所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列問(wèn)題：(1)限制酶切割的化學(xué)鍵是____________。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時(shí)，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，原因是__________________________________________________________________________。磷酸二酯鍵不破壞N基因，使M1與M2之間有啟動(dòng)子、N基因、終止子，能保證N基因正常表達(dá)(2)CRISPR/Cas9