基于數(shù)字PCR的核酸檢測(cè)定量參考品制備與應(yīng)用引言數(shù)字PCR（DigitalPCR,dPCR）作為一種新興的核酸定量技術(shù)，通過(guò)將反應(yīng)體系分割成大量微小的反應(yīng)單元，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子的絕對(duì)定量，具有更高的靈敏度、準(zhǔn)確性和精密度，在臨床診斷、病原體檢測(cè)、基因表達(dá)分析、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等眾多領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在數(shù)字PCR檢測(cè)過(guò)程中，核酸檢測(cè)定量參考品起著至關(guān)重要的作用，它不僅是評(píng)估數(shù)字PCR系統(tǒng)性能的重要工具，也是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和可比性的關(guān)鍵因素。本文將詳細(xì)介紹基于數(shù)字PCR的核酸檢測(cè)定量參考品的制備方法及其在實(shí)際應(yīng)用中的要點(diǎn)。核酸檢測(cè)定量參考品制備靶核酸的選擇與獲取目標(biāo)確定：根據(jù)應(yīng)用目的明確靶核酸，如臨床診斷中針對(duì)特定致病基因，病原體檢測(cè)針對(duì)病毒或細(xì)菌的特征核酸序列。例如，在新冠病毒檢測(cè)中，選擇新冠病毒的N基因或ORF1ab基因等作為靶核酸。獲取途徑：人工合成：對(duì)于已知序列的短片段核酸，可通過(guò)化學(xué)合成方法獲得，如合成寡核苷酸片段。其優(yōu)勢(shì)在于序列精確可控，能準(zhǔn)確引入特定突變或修飾，但合成長(zhǎng)度有限，成本相對(duì)較高?；蚩寺。簩泻怂嵝蛄锌寺≈梁线m的載體（如質(zhì)粒），通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)增。這種方法可獲得較長(zhǎng)且穩(wěn)定的核酸片段，成本較低，但操作過(guò)程較為復(fù)雜，需要一定的分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)，且存在載體相關(guān)雜質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)。從生物樣本中提?。褐苯訌暮心繕?biāo)核酸的生物樣本（如細(xì)胞、組織、血液等）中提取核酸。適用于研究天然狀態(tài)下的核酸，但提取過(guò)程易受樣本來(lái)源、質(zhì)量及提取方法等因素影響，導(dǎo)致核酸純度和完整性參差不齊。參考品的構(gòu)建構(gòu)建形式：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：將靶核酸片段克隆到質(zhì)粒載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒。質(zhì)粒具有穩(wěn)定的雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌中可大量復(fù)制，便于制備高濃度、均一性好的參考品。通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保插入片段的準(zhǔn)確性。體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品：對(duì)于RNA檢測(cè)的數(shù)字PCR參考品，可利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)制備。以含有目標(biāo)RNA序列的質(zhì)粒為模板，在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄生成RNA。體外轉(zhuǎn)錄的RNA可模擬天然RNA的結(jié)構(gòu)和功能，用于評(píng)估RNA檢測(cè)方法的性能，但RNA穩(wěn)定性較差，易被RNA酶降解，需要在制備和保存過(guò)程中特別注意?；蚪MDNA標(biāo)準(zhǔn)品：從含有目標(biāo)基因的細(xì)胞系或組織中提取基因組DNA，經(jīng)過(guò)純化和定量后作為參考品?；蚪MDNA參考品能反映核酸在天然基因組背景下的狀態(tài)，適用于涉及基因組結(jié)構(gòu)和拷貝數(shù)變異分析的數(shù)字PCR檢測(cè)，但由于基因組DNA結(jié)構(gòu)復(fù)雜，制備過(guò)程中的均一性和穩(wěn)定性控制難度較大。濃度梯度設(shè)置：為滿(mǎn)足不同檢測(cè)靈敏度和定量范圍的需求，需制備一系列不同濃度梯度的參考品。濃度梯度的設(shè)置應(yīng)根據(jù)數(shù)字PCR儀器的線(xiàn)性范圍和實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景進(jìn)行合理規(guī)劃。一般采用倍比稀釋法，如10倍梯度稀釋?zhuān)苽涑鲋辽?-6個(gè)不同濃度水平的參考品，涵蓋從低濃度（接近檢測(cè)限）到高濃度的范圍，以確保在整個(gè)檢測(cè)范圍內(nèi)都能準(zhǔn)確評(píng)估數(shù)字PCR系統(tǒng)的性能。參考品的質(zhì)量控制核酸濃度測(cè)定：分光光度法：利用核酸在260nm處有最大吸收峰的特性，通過(guò)測(cè)定260nm和280nm波長(zhǎng)處的吸光度（A260和A280）來(lái)計(jì)算核酸濃度，并根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸純度。一般純凈的DNAA260/A280比值約為1.8，RNA約為2.0。但分光光度法易受核酸樣品中雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、酚類(lèi)等）的干擾，導(dǎo)致濃度測(cè)定不準(zhǔn)確。熒光定量法：使用特異性結(jié)合核酸的熒光染料（如PicoGreen用于雙鏈DNA定量，RiboGreen用于RNA定量），在熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀上測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算核酸濃度。熒光定量法靈敏度高，對(duì)雜質(zhì)的耐受性較好，適用于低濃度核酸樣品的定量。核酸完整性檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳：將核酸樣品在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，通過(guò)觀(guān)察核酸條帶的位置和完整性來(lái)判斷核酸的質(zhì)量。對(duì)于DNA，完整的基因組DNA應(yīng)呈現(xiàn)一條清晰的高分子量條帶，若出現(xiàn)降解則表現(xiàn)為條帶彌散或出現(xiàn)多條低分子量條帶；對(duì)于RNA，在變性瓊脂糖凝膠電泳中，真核生物的總RNA應(yīng)呈現(xiàn)28S和18SrRNA兩條清晰的條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，若RNA發(fā)生降解，條帶會(huì)變模糊或出現(xiàn)多條低分子量條帶。毛細(xì)管電泳：采用毛細(xì)管電泳儀對(duì)核酸進(jìn)行分析，可更精確地檢測(cè)核酸的片段大小和完整性。與瓊脂糖凝膠電泳相比，毛細(xì)管電泳具有更高的分辨率和自動(dòng)化程度，能提供更準(zhǔn)確的核酸完整性信息。序列驗(yàn)證：通過(guò)測(cè)序技術(shù)對(duì)參考品的核酸序列進(jìn)行驗(yàn)證，確保靶核酸序列的準(zhǔn)確性和一致性。對(duì)于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)序可確認(rèn)插入片段或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列與設(shè)計(jì)序列完全一致；對(duì)于基因組DNA參考品，可通過(guò)PCR擴(kuò)增靶區(qū)域后進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證目標(biāo)基因的序列是否正確。常用的測(cè)序方法包括Sanger測(cè)序和二代測(cè)序技術(shù)，Sanger測(cè)序適用于較短片段的精確測(cè)序，二代測(cè)序技術(shù)則可實(shí)現(xiàn)高通量、大規(guī)模的序列測(cè)定。核酸檢測(cè)定量參考品在數(shù)字PCR中的應(yīng)用數(shù)字PCR系統(tǒng)性能評(píng)估準(zhǔn)確性評(píng)估：使用已知濃度的核酸檢測(cè)定量參考品進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與參考品的標(biāo)稱(chēng)濃度進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)偏差。相對(duì)偏差越小，說(shuō)明數(shù)字PCR系統(tǒng)的準(zhǔn)確性越高。例如，若參考品標(biāo)稱(chēng)濃度為1000copies/μL，多次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的平均值為980copies/μL，則相對(duì)偏差為[(980-1000)/1000]×100%=-2%。精密度評(píng)估：對(duì)同一濃度的參考品進(jìn)行多次重復(fù)數(shù)字PCR檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)（CoefficientofVariation,CV）。CV值越小，表明數(shù)字PCR系統(tǒng)的精密度越好，即重復(fù)性和再現(xiàn)性越高。一般要求數(shù)字PCR系統(tǒng)在不同實(shí)驗(yàn)人員、不同儀器及不同時(shí)間等條件下的精密度CV值應(yīng)小于15%。例如，對(duì)某一濃度參考品進(jìn)行10次重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果的平均值為500copies/μL，標(biāo)準(zhǔn)差為50copies/μL，則CV=(50/500)×100%=10%。靈敏度評(píng)估：通過(guò)檢測(cè)一系列低濃度的核酸檢測(cè)定量參考品，確定數(shù)字PCR系統(tǒng)能夠可靠檢測(cè)到的最低核酸濃度，即檢測(cè)限（LimitofDetection,LOD）。一般以95%置信度下能檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)的最低濃度作為L(zhǎng)OD。例如，當(dāng)檢測(cè)濃度為10copies/μL的參考品時(shí)，在20次重復(fù)檢測(cè)中有19次檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，則該數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)該靶核酸的LOD可近似認(rèn)為是10copies/μL。線(xiàn)性范圍評(píng)估：使用不同濃度梯度的核酸檢測(cè)定量參考品進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)，以參考品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以檢測(cè)得到的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。通過(guò)線(xiàn)性回歸分析計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)（R2），R2越接近1，說(shuō)明數(shù)字PCR系統(tǒng)在該濃度范圍內(nèi)的線(xiàn)性關(guān)系越好，線(xiàn)性范圍越寬。一般理想的數(shù)字PCR系統(tǒng)線(xiàn)性范圍應(yīng)跨越3-5個(gè)數(shù)量級(jí)，如101-10?copies/μL。臨床診斷與疾病監(jiān)測(cè)病原體核酸定量檢測(cè)：在傳染病診斷中，數(shù)字PCR可利用核酸檢測(cè)定量參考品對(duì)病原體核酸進(jìn)行準(zhǔn)確的絕對(duì)定量，為疾病的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和療效評(píng)估提供重要依據(jù)。例如，在乙肝病毒感染的診斷中，通過(guò)數(shù)字PCR檢測(cè)患者血清中乙肝病毒DNA的拷貝數(shù)，可精確判斷病毒載量，指導(dǎo)臨床治療方案的選擇和調(diào)整。與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR不受擴(kuò)增效率差異的影響，能更準(zhǔn)確地定量低水平的病毒核酸，有助于發(fā)現(xiàn)隱匿性感染和評(píng)估抗病毒治療的效果。腫瘤基因檢測(cè)：在腫瘤診斷和個(gè)性化治療中，數(shù)字PCR可用于檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的突變頻率和拷貝數(shù)變異。利用核酸檢測(cè)定量參考品對(duì)數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)和質(zhì)量控制，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。例如，在非小細(xì)胞肺癌患者中，通過(guò)數(shù)字PCR檢測(cè)EGFR基因突變的頻率，可指導(dǎo)靶向藥物的選擇；檢測(cè)乳腺癌患者HER2基因的拷貝數(shù)，有助于判斷患者的預(yù)后和制定治療方案。數(shù)字PCR能夠檢測(cè)到低豐度的腫瘤基因突變，為腫瘤的早期診斷和微小殘留病灶的監(jiān)測(cè)提供了有力的技術(shù)支持。科研領(lǐng)域應(yīng)用基因表達(dá)分析：在基因表達(dá)研究中，數(shù)字PCR可利用核酸檢測(cè)定量參考品對(duì)目標(biāo)基因的mRNA進(jìn)行絕對(duì)定量，準(zhǔn)確評(píng)估基因的表達(dá)水平。與傳統(tǒng)的相對(duì)定量方法（如實(shí)時(shí)熒光定量PCR的2^-ΔΔCT法）相比，數(shù)字PCR無(wú)需內(nèi)參基因，能直接給出目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，避免了內(nèi)參基因選擇不當(dāng)和擴(kuò)增效率差異對(duì)結(jié)果的影響，可更精確地分析基因在不同組織、細(xì)胞或生理病理狀態(tài)下的表達(dá)變化。例如，在研究藥物對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的影響時(shí)，通過(guò)數(shù)字PCR定量檢測(cè)藥物處理前后相關(guān)基因的mRNA拷貝數(shù)，可準(zhǔn)確評(píng)估藥物的作用機(jī)制和效果。轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)：在轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)中，數(shù)字PCR利用核酸檢測(cè)定量參考品對(duì)轉(zhuǎn)基因生物中的外源基因進(jìn)行準(zhǔn)確的拷貝數(shù)測(cè)定。通過(guò)構(gòu)建含有已知拷貝數(shù)外源基因的參考品，對(duì)數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)和驗(yàn)證，能夠準(zhǔn)確判斷轉(zhuǎn)基因生物中外源基因的整合情況和拷貝數(shù)變異，為轉(zhuǎn)基因生物的安全性評(píng)價(jià)和監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。例如，在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物檢測(cè)中，數(shù)字PCR可準(zhǔn)確檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)，區(qū)分不同轉(zhuǎn)基因事件，保障農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全。結(jié)論基于數(shù)字PCR的核酸檢測(cè)定量參考品的制備是一項(xiàng)復(fù)雜而關(guān)鍵的工作，涉及靶核酸的選擇與獲取、參考品的構(gòu)建及