第二節(jié)

動物細胞工程動物細胞工程常用的技術(shù)：動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合動物細胞核移植等——動物細胞工程的基礎第二章細胞工程第二節(jié)動物細胞工程2.2.1動物細胞培養(yǎng)從社會中來

在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產(chǎn)生免疫排斥反應。那么，怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個細胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚？通過細胞培養(yǎng)構(gòu)建的人造皮膚

可以從病人身上取少量正常、健康的皮膚在體外進行培養(yǎng)、擴增；目前，科學家還在研究對皮膚干細胞進行培養(yǎng)，以獲得適合臨床上使用的人造皮膚；一、動物細胞培養(yǎng)的概念和原理1.概念：2.原理：3.地位：動物細胞工程的基礎從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術(shù)。細胞增殖動物組織的選擇：

幼齡動物or老齡動物幼齡個體的細胞分化程度低、分裂能力強，易培養(yǎng)。

動物體內(nèi)的細胞之所以能夠維持正常的生命活動，是因為機體給

這些細胞提供了適宜的條件。充足的營養(yǎng)、穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境等二、動物細胞培養(yǎng)的條件1.營養(yǎng)條件:(1)合成培養(yǎng)基:將細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按_____________嚴格配制而成。(2)天然成分:_____等。(3)一般使用_____培養(yǎng)基,即培養(yǎng)液。種類和所需量血清液體營養(yǎng)物質(zhì)主要包括：糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等。為什么對動物細胞進行培養(yǎng)時通常要添加血清？血清中含有多種維持細胞代謝和生長的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、未知的促細胞生長因子等。（注意：這里的糖類不能是淀粉、蔗糖）2.無菌、無毒的環(huán)境:(1)培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具_____處理。(2)_____環(huán)境下操作。(3)培養(yǎng)液定期更換的原因:__________________________________________3.溫度、pH和滲透壓:(1)適宜的溫度:哺乳動物多以__________℃為宜。(2)適宜的pH:多數(shù)細胞生存的適宜pH為_________。(3)適宜的滲透壓。4.氣體環(huán)境:(1)O2作用:_________________。(2)CO2的主要作用:_______________。(3)置于95%空氣和5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中。36.5±0.57.2～7.4細胞代謝所必需的維持培養(yǎng)液的pH清除代謝物,防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害無菌滅菌CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶維持細胞正常的形態(tài)和功能思考:如何防止培養(yǎng)過程中的微生物污染？在細胞培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理原代培養(yǎng)加培養(yǎng)液制成細胞懸液再放入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(nèi)懸浮生長貼壁生長(大多數(shù)）原代培養(yǎng)：指動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)。細胞貼壁：某些細胞需要貼附于某些基質(zhì)表面

（如培養(yǎng)瓶瓶壁）才能增殖。接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸

時，細胞停止分裂增殖的現(xiàn)象。傳代培養(yǎng)：分瓶后的細胞培養(yǎng)。④接觸抑制細胞分裂受阻解決傳代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)取動物組織分散成單個細胞②制成細胞懸液，分瓶培養(yǎng)。①收集細胞懸浮培養(yǎng)的細胞:直接用離心法收集貼壁細胞:用胰蛋白酶處理分散成單個細胞，用離心法收集①營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、②代謝廢物積累、③細胞密度過大等三、動物細胞培養(yǎng)的過程接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到

時，細胞通常會

。貼壁表面相互接觸停止分裂增殖癌細胞由于無接觸抑制而能夠繼續(xù)移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，發(fā)生堆積。是否接觸抑制可作為區(qū)別正常細胞與癌細胞的標志之一。取動物組織用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理分散成單個細胞加培養(yǎng)液細胞懸液原代培養(yǎng)（10代以內(nèi)）在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)（10代以后）

懸浮培養(yǎng)的細胞直接用離心法收集；貼壁細胞需用胰蛋白酶處理分散成單個細胞后，在離心法收集三、動物細胞培養(yǎng)的過程隨著細胞傳代次數(shù)的增多，絕大部分細胞分裂停止，但極少數(shù)細胞會因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而變成不死性細胞,可以連續(xù)增殖。動物細胞培養(yǎng)實現(xiàn)細胞擴增，不能最終培養(yǎng)成動物體（1）選材：

；原因是：

。細胞分化程度低，分裂能力強，容易培養(yǎng)動物胚胎或幼齡動物的組織、器官（2）培養(yǎng)前為什么分散成單個細胞？①成塊組織中細胞與細胞靠在一起，彼此限制了生長與增殖；②利于與培養(yǎng)液充分接觸，保證

O2與營養(yǎng)供應和代謝物及時排出。（3）胰蛋白酶的作用：

。胃蛋白酶可以嗎？理由。

。將動物組織細胞間的蛋白質(zhì)成分酶解，使細胞分散開，獲得單個細胞胃蛋白酶不可以，pH不適宜(4)在用胰蛋白酶處理組織時應注意什么？

細胞膜含有蛋白質(zhì)，長時間處理會損傷細胞，要控制好時間。(5）需分瓶進行傳代培養(yǎng)的原因:導致細胞分裂受阻①營養(yǎng)物質(zhì)缺乏②有害代謝物積累③細胞密度過大④接觸抑制植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)前處理取材培養(yǎng)基的物理性質(zhì)培養(yǎng)基的成分特有成分植物細胞的全能性細胞增殖離體用機械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶將組織細胞分散開離體植物器官、組織、細胞動物胚胎或幼齡動物的組織、器官固體液體(又稱培養(yǎng)液)有機營養(yǎng)成分無機營養(yǎng)成分植物激素糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)及一些天然成分如血清植物激素血清四、植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)特殊環(huán)境條件結(jié)果是否體現(xiàn)細胞的全能性過程相同點再分化需光氣體環(huán)境一般獲得新的植株獲得大量細胞是否①培養(yǎng)過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數(shù)分裂；②均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件。2025/5/17外植體脫分化愈傷組織再分化根、芽幼苗完整植株移栽成活取動物組織制成細胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液進行原代培養(yǎng)分瓶進行傳代培養(yǎng)【基礎過關(guān)】(1)動物細胞培養(yǎng)體現(xiàn)了動物細胞的全能性()(2)培養(yǎng)保留接觸抑制的細胞在培養(yǎng)瓶壁上可形成多層細胞(

)(3)懸浮培養(yǎng)的細胞直接用離心法收集，貼壁細胞需要用胰蛋白酶等處理后再用離心法收集()(4)動物細胞培養(yǎng)時，O2是細胞代謝所必需的，CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH(

)××√√【典例1】如圖所示為動物細胞培養(yǎng)的基本過程，下列關(guān)于甲、乙、丙、丁四個操作過程的敘述，正確的是(

)CA.甲過程可選取動物個體的任何組織細胞B.乙過程可用纖維素酶和果膠酶處理細胞C.丙過程所用培養(yǎng)液中需添加動物血清D.丁過程中的細胞因接觸抑制而大量死亡【典例2】在進行動物細胞培養(yǎng)時，需要(

)A.用胃蛋白酶處理以獲得單細胞懸液

B.充入5%CO2以刺激細胞正常呼吸C.加入經(jīng)高壓蒸汽滅菌的血清以提供營養(yǎng)

D.定期更換培養(yǎng)液以清除代謝產(chǎn)物D【典例3】相對細菌和植物細胞而言，動物細胞離體培養(yǎng)更需關(guān)注培養(yǎng)基的滲透壓，這是因為動物細胞(

)A.沒有中央液泡，不能發(fā)生滲透作用B.滲透壓遠高于細菌或植物細胞的滲透壓C.沒有細胞壁，易吸水漲破D.生長緩慢，各生長階段對環(huán)境的滲透壓要求不同C【典例4】下列關(guān)于動物細胞培養(yǎng)的敘述不正確的是(

)A.動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的原理是細胞膜的流動性B.傳代培養(yǎng)時需要用胰蛋白酶處理貼壁生長的細胞C.癌細胞在培養(yǎng)瓶中不會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象D.動物細胞培養(yǎng)一般需要使用CO2培養(yǎng)箱A1.干細胞的概念：

動物和人體內(nèi)仍保留的少數(shù)具有分裂和分化能力的細胞。在一定條件下，干細胞可以分化成其他類型的細胞。2.干細胞的分布：

干細胞存在于_________、_____和_______等多種組織和器官中；早期胚胎骨髓臍帶血3.干細胞的分類：包括胚胎干細胞和成體干細胞等。（1）胚胎干細胞（簡稱ES細胞）①分布：存在于________中早期胚胎②特點：

具有分化為成年動物體內(nèi)的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能③應用實例：ES細胞在體外分化成心肌細胞、神經(jīng)元細胞和造血干細胞等五、干細胞培養(yǎng)及其應用

（2）成體干細胞①分布：存在于________________中成體組織或器官內(nèi)②舉例：③特點：

一般認為，成體干細胞具有組織特異性,只能分化成特定的細胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。A.造血干細胞：存在于成體的骨髓、外周血和臍帶血，可分化成

各種血細胞和免疫細胞。發(fā)現(xiàn)最早、研究最多、應用最多B.神經(jīng)干細胞：取自神經(jīng)系統(tǒng)，可分化成神經(jīng)細胞。C.精原干細胞：取自睪丸，可分化成無數(shù)的精子。（專能干細胞）（多能干細胞）

治療神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，

如帕金森病、阿爾茨海默病等疾病

治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病

有著自我更新能力及分化潛能的干細胞，與組織、器官的發(fā)育、再生和修復等密切相關(guān)。4.干細胞的應用（1）應用原理：（2）應用實例：造血干細胞：神經(jīng)干細胞：

干細胞將在再生醫(yī)學、藥物安全性與有效性檢測等領(lǐng)域發(fā)揮大作用。（3）面臨的問題：存在導致腫瘤發(fā)生的風險（4）應用展望：5.誘導多能干細胞（iPS細胞）（1）胚胎干細胞的局限性：

胚胎干細胞必須從_____中獲取，涉及________；因而限制了在醫(yī)學上的應用。胚胎倫理問題（2）誘導多能干細胞概念：

通過體外誘導小鼠成纖維細胞，獲得了類似胚胎干細胞的一種細胞，稱為誘導多能干細胞，簡稱iPS細胞。誘導方法：①將特定基因或特定蛋白導入細胞（成纖維細胞以及已分化的T細胞、B細胞均可）；②用小分子化合物誘導形成。（3）誘導多能干細胞優(yōu)點：①誘導過程無須破壞胚胎；②iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內(nèi)后，理論上可以避免免疫排斥反應?？茖W家普遍認為iPS細胞的應用前景優(yōu)于胚胎干細胞移植取成纖維細胞等iPS細胞轉(zhuǎn)入相關(guān)因子細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化分化胰島細胞神經(jīng)元血細胞腸上皮細胞心肌細胞肝細胞病人iPS細胞用于治療人類疾病示意圖（4）誘導多能干細胞的應用：5.誘導多能干細胞（iPS細胞）誘導多能干細胞（iPS細胞）多種體細胞定向誘導分化體外誘導成纖維細胞臨床治療疾病如：白血病、帕金森病、阿爾茨海默病等動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)的概念和原理干細胞培養(yǎng)及其應用營養(yǎng)條件；無菌、無毒的環(huán)境；溫度、pH和滲透壓；氣體環(huán)境原理：細胞的增殖在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術(shù)干細胞的分布干細胞的類型干細胞的應用胚胎干細胞（ES細胞）成體干細胞動物細胞培養(yǎng)的條件動物細胞培養(yǎng)的過程取動物組織單個細胞細胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中主要應用在醫(yī)學上【課堂小結(jié)】【基礎過關(guān)】(1)干細胞都是來源于早期胚胎。()(2)造血干細胞是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多、應用也最為成熟的一類成體干細胞，主要存在于成體的骨髓、外周血和臍帶血中。()(3)不同類型的干細胞，它們的分化潛能完全相同。(

)(4)iPS細胞是一種人工誘導產(chǎn)生的多能干細胞，在治療阿爾茨海默病、心血管疾病領(lǐng)域具有重要的研究價值。(

)(5)iPS細胞稱為誘導多能干細胞,與胚胎干細胞類似,也需從胚胎中獲取()×√×√×【典例1】動物和人體內(nèi)具有分裂和分化能力的細胞稱為干細胞。對右圖的相關(guān)敘述中，錯誤的是(

) A.a過程可表示干細胞的自我更新 B.b、c過程表示干細胞具有分化能力 C.a、b、c過程中細胞的遺傳信息表達情況不同 D.a、b、c過程中遺傳物質(zhì)發(fā)生了定向改變

D【典例2】干細胞是一類未參與分化或未完全分化的細胞，分裂能力強。按照其來源分為胚胎干細胞和成體干細胞(如造血干細胞、神經(jīng)干細胞)。下列關(guān)于干細胞的說法錯誤的是(

) A.胚胎干細胞不具有發(fā)育成完整個體的潛能 B.胚胎干細胞的分化程度小于造血干細胞 C.骨髓移植治療白血病就是利用了造血干細胞能分化成各種血細胞的能力 D.將帶有遺傳標記的胚胎干細胞植入早期胚胎，通過組織化學染色可追尋胚胎發(fā)育中細胞分化和器官形成的規(guī)律

A【典例3】下圖為科學家在實驗室中培養(yǎng)“人造牛肉”的簡要過程。

相關(guān)敘述正確的是(

)CA.用胃蛋白酶處理牛肌肉組織，獲得分裂能力強的肌肉干細胞B.生物反應器中應充以95%空氣加5%CO2的混合氣體，CO2的作用是

刺激細胞呼吸C.培養(yǎng)液中的支架提供了更多的細胞吸附面積，有利于細胞貼壁生長D.“人造牛肉”的培養(yǎng)有利于牛肉的工廠化生產(chǎn)，但環(huán)境污染嚴重

1.判斷下列有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的表述是否正確。（1）培養(yǎng)環(huán)境中需要O2，不需要CO2。（

）（2）細胞要經(jīng)過脫分化形成愈傷組織。（

）（3）培養(yǎng)液中通常含有糖類、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清（

）（4）培養(yǎng)瓶中的細胞需定期用胰蛋白酶處理,分瓶后才能繼續(xù)增殖（

）一.概念檢測×√××練習與應用（P47）

2.干細胞有著廣泛的應用前景。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A.干