ICS07.100DB22C04吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2566—2016b型流感嗜血桿菌核酸檢測(cè)多重PCR法MultiplexpolymerasechainreactionmethodforthedetectionofHaemophilus吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2566—2016前言本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林省疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張煒煜、楊修軍、王慧、劉桂華、趙薇、黃鑫、李可維。IDB22/T2566—2016b型流感嗜血桿菌核酸檢測(cè)多重PCR法警示——使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了b型流感嗜血桿菌核酸檢測(cè)多重PCR法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于b型流感嗜血桿菌核酸的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法WS/T230-2002臨床診斷中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用縮略語4.1.310×PCR緩沖液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化鉀，20mmol/L氯化鎂。4.1.44dNTP（10mmol/L）：dATP、dCTP、dGTP、dTTP1DB22/T2566—20164.1.5TaqDNA聚合酶4.1.6分子量標(biāo)記：100bp～2000bpDNA條帶（DNALadder）4.1.710×TAE電泳緩沖液（儲(chǔ)備液）：稱取484gTris，量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，定容至2L。分裝后高壓滅菌備用。使用前稀釋成1×TAE電泳緩沖液（工作液）。4.1.8瓊脂糖：電泳純4.1.9溴化乙錠4.2質(zhì)控菌株流感嗜血桿菌ATCC9795(b型)、流感嗜血桿菌ATCC49247（N型）、流感嗜血桿菌ATCC10211(丟失莢膜的b型)。流感嗜血桿菌ATCC9795(b型)菌體DNA作為陽性對(duì)照。4.3引物及探針4.3.1流感嗜血桿菌種屬特異性引物：Hi-F：5’-ACTTTTGGCGGTTACTCTGT-3’Hi-R：5’-TGTGCCTAATTTACCAGCAT-34.3.2流感嗜血桿菌莢膜特異性引物：Hi-af-F：5’-CGTTTGTATGATGTTGATCCAGAC-3’Hi-af-R：5’-TGTCCATGTCTTCAAAATGATG-3’4.3.3b型流感嗜血桿菌特異性引物：Hib-F：5’-GCGAAAGTGAACTCTTATCTCTC-3’Hib-R：5’-GCTTACGCTTCTATCTCGGTGAA-3’5.6微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL5.7靜脈采血管6試驗(yàn)步驟6.1樣品2DB22/T2566—2016用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上疑似菌落，置于200μL無菌雙蒸水中，振蕩混勻形成懸浮菌液。6.1.2血液在兒童中，10%～20%低菌量菌血癥患者是由流感嗜血桿菌引起的。采集靜脈血（3mL～5mL）置于含有抗凝劑的采血管中，并標(biāo)記。6.1.3腦脊液應(yīng)由經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員在無菌條件下操作。采集的腦脊液（要求1mL）置于無菌、螺帽管中，并標(biāo)記。6.1.4咽拭子將咽拭子繞過懸雍垂擦拭后壁，并置于底部滴加3～5滴無菌生理鹽水的試管中，待檢。6.2細(xì)菌DNA的提取對(duì)于上述標(biāo)本，各取0.1mL加到一個(gè)0.2mL無菌雙蒸水中，振蕩混勻，100℃煮沸10min，13000rpm/min離心10min，吸取上清液即為DNA模版；使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒并按其說明提取制備模板DNA。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照，試劑對(duì)照。如不能及時(shí)檢測(cè)，提取的DNA可置于-20℃保存。6.3PCR擴(kuò)增6.3.1引物：Hi-F：5’-ACTTTTGGCGGTTACTCTGT-3’Hi-R：5’-TGTGCCTAATTTACCAGCAT-3’Hi-af-F：5’-CGTTTGTATGATGTTGATCCAGAC-3’Hi-af-R:5’-TGTCCATGTCTTCAAAATGATG-3’Hib-F:5’-GCGAAAGTGAACTCTTATCTCTC-3’Hib-R:5’-GCTTACGCTTCTATCTCGGTGAA-3’25μL反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液2.5μL，dNTP2μL，1UTaq酶，10pmol/L引物上下游各1μL，模板DNA1μL，雙蒸水補(bǔ)足25μL。94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，室溫放置30min。秤取2.0g瓊脂糖加入100mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化后加入適量的溴化乙錠（0.5μg/mL）,然后制成凝膠板。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取5μL～10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分3DB22/T2566—2016別和適量加樣緩沖液混合后，分別加樣到凝膠孔。9V/cm恒壓下電泳30min～35min。將電泳好的凝膠放到凝膠成像儀或紫外透射臺(tái)上觀察結(jié)果，進(jìn)行判斷并做好試驗(yàn)記錄。7結(jié)果判讀7.1結(jié)果判定若樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳出現(xiàn)273bp（Hi基因片段）、343bp（Hi-af基因片段）和480bp（Hib基因片段）的任意一條擴(kuò)增條帶或三者均出現(xiàn)，同時(shí)陽性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)目的條帶（273bp、343bp和480bp），陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后沒有出現(xiàn)目的條帶，判定結(jié)果為可疑陽性。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳無目的擴(kuò)增條帶，且陽性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后沒有出現(xiàn)目的條帶，判定結(jié)果為陰性。7.2結(jié)果表述如判定結(jié)果為陽性，則結(jié)果表述為“b型流感嗜血桿菌核酸檢測(cè)陽性”；如判定結(jié)果為陰性，則結(jié)果表述為“未檢出b型流感嗜血桿菌核酸”。8廢棄物處理和