ICS59.080DB21W59遼寧省地方標準DB21/T3084—2018羽絨制品中鵝絨的鑒別PCR法和實時熒光PCR法IdentificationofGooseDownFiberinFeatherandDownProducts-PCRmethodandreal-timefluorescencePCRmethod遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3084—2018前言本標準依據(jù)GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則編制。本標準附錄A、附錄B為資料性附錄。本標準由中華人民共和國大連海關(guān)提出并歸口。本標準起草單位：遼寧出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心。本標準主要起草人：任亮、顏懷玉、孔平、王貴濱、肇慧君。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責任。IDB21/T3084—2018羽絨制品中鵝絨的鑒別PCR法和實時熒光PCR法12范圍本標準規(guī)定了羽絨制品中鵝絨的PCR和實時熒光PCR鑒別方法。本標準適用于羽絨制品。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義3.1聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction一種模擬天然DNA復(fù)制的體外擴增法，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，以4種單核苷酸（dNTP）為底物，通過變性—退火—延伸的循環(huán)反應(yīng)，使極少量的DNA的特定片段，在短短幾小時內(nèi)擴增上百萬倍。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過曲線對未知模板進行定量或定性分析的方法。4縮略語Ct值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（cyclethreshold）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）DTT：二硫疏糖醇5用試劑盒法或其他等效DNA提取法提取樣品中的DNA。針對鵝的線粒體DNA序列設(shè)計引物和探針，通過單PCR、實時熒光PCR技術(shù)，對DNA中的鵝成分分別進行特異性擴增，根據(jù)實驗結(jié)果，判1DB21/T3084—20186試劑6.1實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。6.2組織和毛發(fā)提取試劑盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0(TaKaRaCode.9765)。參見附錄A中A.1。6.36.4PremixExTaq?(ProbeqPCR)(TaKaRaCode.RR390A)參見附錄A中A.2。100%乙醇。6.5溴化乙錠溶液。6.6DNALaddarMarker。7設(shè)備與器具7.1PCR儀7.2實時熒光定量PCR儀7.3電泳裝置7.4凝膠成像儀7.5冰箱：4℃~20℃7.6天平：精度為0.0001g7.77.87.9分析研磨機微孔干浴器或水浴鍋瞬時離心機7.12微量可調(diào)移液器：0.1μL~2.5μL，1μL~10μL，2μL~20μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μL。1.5mL離心管，2.0mL離心管PCR薄壁管89將樣品剪碎，經(jīng)分析研磨機打散混勻，再次盡量剪碎至2mm以下，再次用分析研磨機混勻。2DB21/T3084—2018稱取約5mg試樣，放入2mL離心管中，每個樣平行提取2管，加入180μL的緩沖液GL（BufferGL）、20μL的蛋白酶K（ProteinaseK）和10μL的核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL），于56℃水浴溫浴至組織完全裂解3小時。如殘存纖維狀組織無法完全裂解，裂解之后先12,000rpm離心2分鐘，去除雜質(zhì)之后再進行后續(xù)操作。向裂解液中加入200μL緩沖液GB（BufferGB）和200μL100%乙醇，充分吸打混勻。注：溫浴時可時常將樣品取出進行振蕩或吸打以加速裂解。10.2將核酸純化柱（SpinColumn）安置于收集管（CollectionTube）上，溶液移至核酸純化柱中，12,000rpm離心2分鐘，棄濾液。10.3將500μL的緩沖液WA（BufferWA）加入至核酸純化柱中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。10.4將700μL的緩沖液WB加入至核酸純化柱中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。10.5確認緩沖液WB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇。10.6沿核酸純化柱管壁四周加入緩沖液WB，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份。10.7重復(fù)操作步驟4。10.8將核酸純化柱安置于收集管上，12,000rpm離心2分鐘。10.9將核酸純化柱安置于新的1.5mL的離心管上，在核酸純化柱膜的中央處加入50μL~200μL的滅菌水或洗脫液（ElutionBuffer），室溫靜置5分鐘。10.10將滅菌蒸餾水或洗脫液加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。10.1112,000rpm離心2分鐘洗脫DNA。如需獲得更大收量，可將離下液重新加入到核酸純化柱膜的中央或再加入50L~200μL的滅菌水或洗脫液，室溫靜置5分鐘后，12,000rpm離心2分鐘洗脫DNA。11DNA的鑒別進行PCR、實時熒光PCR鑒別時設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。陽性對照：擴增鵝成分時表1PCR擴增所用引物3DB21/T3084—201811.2.4PCR產(chǎn)物的檢測將適量5×TBE稀釋成0.5×TBE溶液，配制2.0%瓊脂糖凝膠，取15μLPCR產(chǎn)物，點樣進行電泳，并加DNAmarker點樣以判斷PCR產(chǎn)物的片段大小。電壓大小根據(jù)電泳槽長度來確定，一般控制在3V/cm~5V/cm長度，電泳時間根據(jù)溴酚藍的移動位置來確定。電泳結(jié)束后，將凝膠置溴化乙錠溶液（10μg/μL）中浸泡30min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照、記錄與分析電泳結(jié)果。11.2.5PCR結(jié)果及判斷陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)條帶；待測樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，判斷結(jié)果為陰性。待測樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，判斷結(jié)果為可疑陽性，需進一步確證。11.2.6結(jié)果確證實驗可疑陽性結(jié)果的采用實時熒光PCR法進行確證。實時熒光PCR法11.311.3.1引物及探針所用的引物、探針見表2。表2實時熒光PCR所用引物、探針擴增成分引物名稱引物序列退火溫度/℃產(chǎn)物大小/bp375375375PremixExTaq(2×)12.5μL，PremixExTaq(2×)12.5μL，PrimerF(10μM)1μL，PrimerR(10μM)1μL，Probe(5μM)1μL，DNA×2μL，dH2O7.5μL，×Negativecontrol反應(yīng)時，加入RNasefreedH2O，×Positive反應(yīng)時，做2個平行樣。反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)設(shè)置無效基線范圍，基線范圍選擇在3~15個循環(huán)，如果有強陽性樣本，應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，且Ct值=40為準。設(shè)置閾值后，分析樣品的檢測結(jié)果。待測樣品鵝成分檢測Ct值大于或等于40，內(nèi)參照基因檢測Ct值在23~30之間者，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品未檢出鵝源性DNA成分。4DB21/T3084—2018待測樣品鵝成分檢測Ct值小于或等于36，內(nèi)參照基因檢測Ct值在20~30之間者，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品檢出鵝源性DNA成分。待測樣品鵝成分檢測Ct值在36~40之間，應(yīng)重做實時熒光PCR擴增。再次擴增后的結(jié)果Ct值仍小于40者，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判定該樣品檢出鵝源性DNA成分；再次擴增后結(jié)果Ct值大于40，且陰性對照/陽性對照和空白對照結(jié)果正常，可判定該樣品未檢出鵝源性DNA成分。11.4結(jié)果表述該樣品未檢出鵝源性DNA成分，該樣品檢出鵝源性DNA成分。12防止污染的措施檢測過程中防止交叉污染的措施參照GB/T19495.2。5DB21/T3084—2018AA附錄A（資料性附錄）試劑盒A.1試劑盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0(TaKaRaCode.9765)組成（50次）本試劑盒分試劑PartI與PartII兩部分。PartI-20℃保存蛋白酶K（proteinaseK，20mg/mL）核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL）PartII室溫（15-25℃）保存緩沖液GL（BufferGL）×1緩沖液GB（BufferGB）×1緩沖液WA（BufferWA）×1緩沖液WB（BufferWB）×2洗脫液（elutionbuffer）離心管（SpinColumns）1mL0.5mL12mL12mL28mL24mL14mL50支50支收集管（Collectiontubes）非商業(yè)性聲明：附錄A所列參考試劑盒僅為提供參考，并不涉及商業(yè)目的，鼓勵標準使用者嘗試使用不同廠家或型號的試劑盒及試劑。6DB21/T3084—2018BB附錄B（資料性附錄）擴增產(chǎn)物序列鵝擴增產(chǎn)物序列（375bp）Attcctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatcaatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctgaatcatccgctaccttcacgccaatggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacggatcatttctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagcaacagccttcataggctatgtcctc