第五章單倍體培養(yǎng)1.概念：花粉的二型性在花藥/花粉培養(yǎng)時(shí)，由于對(duì)培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，花粉在形態(tài)上形成兩種類型，一類是具胚性的，在煙草和大麥中，花粉小，染色淺；另一類為花粉大，染色深，朝成熟花粉方向發(fā)展2.單倍體在遺傳和育種中的應(yīng)用價(jià)值（一）、縮短育種周期（二）、提高目標(biāo)基因型的選擇效率如果某一性狀受一對(duì)基因控制AA×aa→F1→F2中純合AA個(gè)體只有1/4F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中AA個(gè)體占1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍如屬兩對(duì)基因控制AAbb×aaBB,F2中要選出AABB個(gè)體的機(jī)率只有1/16F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，AaBb只產(chǎn)生4種花粉：AB、Ab、aB、ab，加倍后AABB個(gè)體的頻率可達(dá)1/4比常規(guī)雜交育種效率提高4倍常規(guī)育種：單倍體育種=1/22n：1/2n。（三）、排除雜種優(yōu)勢對(duì)后代選擇的干擾對(duì)于雜交育種來講，由于低世代很多基因位點(diǎn)尚處于雜合狀態(tài)，會(huì)有不同程度的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)，對(duì)個(gè)體的選擇會(huì)造成一定誤差采用DH群體進(jìn)行選擇育種，由于各基因位點(diǎn)在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實(shí)變異（四）、遺傳研究的良好實(shí)驗(yàn)材料體系單倍體在作物的數(shù)量遺傳研究中可能有較大用途，如：基因相互作用的檢測、遺傳變異的估計(jì)、連鎖群的檢測、影響數(shù)量性狀的基因數(shù)目的估計(jì)及多基因的定位等DH系是分子標(biāo)記遺傳作圖的良好群體單倍體可用來創(chuàng)造非整倍體材料，用單倍體與二倍體雜交，可創(chuàng)造一系列的附加系，從而研究染色體的遺傳功能花藥和花粉培養(yǎng)體系還是發(fā)育遺傳研究的良好材料，可以用來研究細(xì)胞的分裂及分化，研究花粉發(fā)育途徑的轉(zhuǎn)變，以及與轉(zhuǎn)變有關(guān)的基因的表達(dá)與調(diào)控（五）、突變體的篩選單倍體的每個(gè)基因都是單拷貝的，各種隱性基因都可以表現(xiàn)出來，加倍后形成的雙單倍體各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來，大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率對(duì)花藥進(jìn)行離子照射，然后對(duì)花藥愈傷篩選，可以獲得理想的突變體（六）、消除致死基因單倍體帶有致死基因的個(gè)體即使加倍后形成雙單倍體也會(huì)由于基因的純合而被消除，而致死基因在自然群體里常常因?yàn)殡s合體的存在而不易被徹底消除。（七）、選育新型自交系對(duì)雙親或多親雜交的雜種一代進(jìn)行花藥或花粉培養(yǎng)，獲得的雙單倍體實(shí)際上是純合的自交系，在雜種優(yōu)勢利用育種中有很大用途（八）、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料在轉(zhuǎn)基因育種中，如果用體細(xì)胞為受體，經(jīng)常遇到轉(zhuǎn)基因后代材料分離問題，經(jīng)多代選擇才能穩(wěn)定下來如用單倍體細(xì)胞作受體，獲得的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)加倍后，從理論上講會(huì)很快達(dá)到純合狀態(tài)受體材料可以是花粉、單倍體原生質(zhì)體、單倍體胚或單倍體植株作外植體培養(yǎng)條件下小孢子的發(fā)育途徑花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的優(yōu)勢體現(xiàn)在哪些方面3.玉米種群中存在高產(chǎn)不抗?。ˋAbb）、低產(chǎn)抗病(aaBB)兩種類型，以此為材料，采用何種技術(shù)路線培育高產(chǎn)抗病新品種，繪出技術(shù)路線圖。第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)1.原生質(zhì)體的概念：指采用機(jī)械或酶解法去掉細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞2.原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用：（1）種質(zhì)資源保存；（2）原生質(zhì)體融合，克服生殖障礙；（3）篩選突變體；（4）遺傳轉(zhuǎn)化a.同一組織可產(chǎn)生大量遺傳上基本一致的原生質(zhì)體,b.如具有再生能力，易獲得轉(zhuǎn)化植株,c.易攝取外源遺傳物質(zhì),d.轉(zhuǎn)化后固體包埋培養(yǎng)，可避免嵌合體的發(fā)生基礎(chǔ)研究；（5）細(xì)胞壁的發(fā)生過程、膜的結(jié)構(gòu)等的研究3.原生質(zhì)體分離方法：（1）機(jī)械分離法：機(jī)械法分離質(zhì)壁分離細(xì)胞缺點(diǎn)：產(chǎn)量極低；應(yīng)用的材料受限制；操作極費(fèi)力（2）酶法分離：A優(yōu)點(diǎn).a可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量原生質(zhì)體，b.分為直接法和順序法兩種；B缺點(diǎn).不純的酶制劑所含雜質(zhì)對(duì)原生質(zhì)體可能有不同程度的毒害作用影響原生質(zhì)體分離的因素（酶法）(1)從理論上講，只要用適當(dāng)?shù)拿柑幚恚湍軓娜魏位罱M織中分離得到原生質(zhì)體(2)但對(duì)于原生質(zhì)體培養(yǎng)來說，要得到活性高、能進(jìn)行分裂、形成愈傷組織、最后再生完整植株的原生質(zhì)體則受許多因素的影響(3)原生質(zhì)體分離時(shí)主要應(yīng)考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時(shí)間、溫度等。4.常用于原生質(zhì)體分離的材料（原料）：葉片：易獲得而且能充分供應(yīng)。取材時(shí)，一般用剛展開的幼嫩葉片愈傷組織及懸浮系：避免植株生長環(huán)境的不良影響，可以常年供應(yīng)，易于控制新生細(xì)胞的年齡，處理時(shí)操作方便，無需消毒注意：選用懸浮細(xì)胞作材料時(shí)，需每隔3-5天繼代一次，培養(yǎng)一段時(shí)間使細(xì)胞處于旺盛生長狀態(tài)。一般在繼代后的第三天游離原生質(zhì)體用來分離植物原生質(zhì)體的酶制劑：纖維素酶、半纖維素酶：降解構(gòu)成細(xì)胞壁的纖維素果膠酶：降解連結(jié)細(xì)胞的中膠層，使細(xì)胞從組織中分開，以及細(xì)胞與細(xì)胞分開酶解花粉母細(xì)胞和四分體小孢子時(shí)還要加入蝸牛酶離析酶（果膠酶）纖維素酶濃度在1%-3%，果膠酶在0.1%-1%，但也有例外5.原生質(zhì)體的純化方法：離心沉淀法：原理：應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。步驟：第一步原生質(zhì)體溶液用400目網(wǎng)篩過濾。第二步離心（500-1000r/min，離心5-6min）。第三步吸取上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀，如此2-3次。第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1次，收集原生質(zhì)體。漂浮法：原理：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮在液體的表面。步驟：第一步：400目網(wǎng)篩過濾。第二步：離心。第三步：取上清液，洗滌液重懸，離心。2-3次。第四步：收集溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗1次。界面法：原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。6.原生質(zhì)體活力的測定：形態(tài)識(shí)別：形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。染色識(shí)別：（1）0.1%酚番紅或Evans藍(lán)染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。（2）雙醋酸鹽熒光素(FDA)染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。FAD:熒光素雙醋酸酯（Fluoresceindiacetate），常用丙酮配置成2mg/ml溶液，在冰箱（4C）中保存FDA本身沒有極性，無熒光，可以穿過細(xì)胞膜自由出入細(xì)胞，在細(xì)胞中不能積累在活細(xì)胞中，F(xiàn)DA經(jīng)酯酶分解為熒光素，為具有熒光的極性物質(zhì)，不能自由出入細(xì)胞膜，而在細(xì)胞中積累。在紫外光照射下，發(fā)出綠色熒光相反如果是死細(xì)胞，則不會(huì)發(fā)出綠色熒光7.原生質(zhì)體培養(yǎng)方法各方法的特點(diǎn)：(1)液體淺層培養(yǎng):特點(diǎn)：通氣好，原生質(zhì)體代謝物易擴(kuò)散，防止有害物質(zhì)積累過多造成毒害，轉(zhuǎn)移添加新鮮培養(yǎng)基方便，便于觀察和照相。操作簡單，可微量培養(yǎng)。但原生質(zhì)體沉淀，分布不均，細(xì)胞團(tuán)聚集多，難成單細(xì)胞株系。(2)平板法培養(yǎng):原生質(zhì)體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖（37C左右）等體積混合成0.7%，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿（2-3mm）中。特點(diǎn)：原生質(zhì)體分布均勻，利于分裂，容易獲得單胞株系，可定位跟蹤觀察。但是原生質(zhì)體釋放的有毒物質(zhì)不易擴(kuò)散。（3）雙層培養(yǎng)法：培養(yǎng)皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基，在其上進(jìn)行原生質(zhì)體淺層培養(yǎng)。特點(diǎn)：原生質(zhì)體分布均勻，有利于分裂，易獲單細(xì)胞株系，能除去抑制分裂的有害物質(zhì)，細(xì)胞植板率高。（4）飼喂層培養(yǎng)：方法一：X-射線殺死原生質(zhì)體，與生活力正常的原生質(zhì)體混合，加入0.7%瓊脂，制成混合液，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。特點(diǎn)：以一種植物細(xì)胞制成的平板，支持另一種植物原生質(zhì)體的生長。飼喂層沒有種的特異性。方法二：X-射線殺死原生質(zhì)體，與0.7%瓊脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)層，再將生活力正常的原生質(zhì)體與0.7%瓊脂混合，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。特點(diǎn)：用材少，培養(yǎng)液消耗少，利于通風(fēng)與觀察，可做原生質(zhì)體不同密度的培養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)，進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。第七章植物原生質(zhì)體融合1.原生質(zhì)體融合的方法及特點(diǎn)：無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合；聚乙二醇、高pH高鈣誘導(dǎo)融合；電融合技術(shù)。（1）無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合NaNO3作用：中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導(dǎo)頻率不高，約1%。1972年：Carlson誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體細(xì)胞雜種。（2）聚乙二醇：PEG橋梁,使原生質(zhì)體凝聚——PEG被洗脫——導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排，電荷的重排導(dǎo)致一個(gè)原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合——膜接觸——融合優(yōu)點(diǎn)：融合頻率高；可重復(fù)性強(qiáng)；毒性較低；誘發(fā)融合無特異性（植物+植物，植物+動(dòng)物，動(dòng)物+酵母）不足：PEG處理后線粒體變形；融合產(chǎn)物粘在融合器皿上；培養(yǎng)時(shí)融合體分裂頻率不高（3）高pH高鈣誘導(dǎo)融合：高鈣促進(jìn)原生質(zhì)體結(jié)合，高PH可以改變質(zhì)膜表面的電荷性質(zhì)，有利于融合。優(yōu)點(diǎn)：雜種產(chǎn)量高，達(dá)到20-50%。不足：高pH值對(duì)細(xì)胞有毒害作用。1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃時(shí)，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。（4）電融合技術(shù)：原理：交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化；原生質(zhì)體沿著電極排列，形成串珠；施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，最后形成融合的原生質(zhì)體。Senda1979年首先用此方法實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體融合電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：一是交變電場部分；一是高頻直流電擊部分融合過程：原生質(zhì)體接觸質(zhì)膜融合——圓球化——核融合優(yōu)點(diǎn)：無化學(xué)毒性，對(duì)細(xì)胞傷害??；融合效率高；重復(fù)性強(qiáng)；融合技術(shù)操作簡便；電參數(shù)容易精確調(diào)節(jié)2.原生質(zhì)體融合的方式，供體的處理，受體的處理。（1）對(duì)稱融合：是親本原生質(zhì)體在融合前未進(jìn)行任何處理（如輻射、碘乙酰胺等）的一種融合方式。優(yōu)缺點(diǎn)但由于它綜合雙親的全部性狀，在導(dǎo)入有利性狀的同時(shí)，也不可避免地帶入了一些不利性狀（2）非對(duì)稱融合：在融合前，對(duì)一方原生質(zhì)體進(jìn)行射線照射處理，以鈍化其細(xì)胞核（供體，Donor），另一方原生質(zhì)體（受體，Recipient）不處理或經(jīng)化學(xué)試劑（如碘乙酰胺、碘乙酸、羅丹明6-G等）處理，所以也稱供-受體融合A、供體處理：造成染色體的斷裂和片段化，從而使供體染色體進(jìn)入到受體后部分或全部丟失，達(dá)到轉(zhuǎn)移部分遺傳物質(zhì)或只轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)的目的，處理方法：射線（X、γ和UV）輻射原生質(zhì)體；限制性內(nèi)切酶處理原生質(zhì)體；紡錘體毒素、染色體濃縮劑處理原生質(zhì)體B、受體處理：為了減少融合再生后代的篩選工作，利用一些代謝抑制劑（Metabolisminhibitor）處理受體原生質(zhì)體以抑制其分裂常用的抑制劑：碘乙酸（Iodoaceticacid，IA）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IOA）和羅丹明6-G（Rhodamin6-G，R-6-G）【受IA、R-6-G和IOA處理的細(xì)胞和未受代謝抑制劑處理的細(xì)胞發(fā)生融合后，代謝上就會(huì)得到互補(bǔ)，從而能夠正常地生長】非對(duì)稱融合方式：“供體-受體”系統(tǒng)；“胞質(zhì)體-原生質(zhì)體”融合；“小原生質(zhì)體-原生質(zhì)體”融合3.雜種細(xì)胞的篩選與鑒定：互補(bǔ)選擇；機(jī)械分離雜種細(xì)胞法；雙熒光標(biāo)記選擇法（1）互補(bǔ)選擇法：原理，利用2個(gè)親本對(duì)培養(yǎng)基、抗代謝物、或溫度等的敏感性存在著天然的互補(bǔ)性進(jìn)行選擇叫互補(bǔ)法選擇。也可以利用隱性基因的互補(bǔ)性進(jìn)行選擇。分類：A、激素自養(yǎng)型篩選；粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的野生型葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體是激素異養(yǎng)型細(xì)胞，原生質(zhì)體不分裂；雜種細(xì)胞是激素自養(yǎng)型細(xì)胞，且在沒有激素的培養(yǎng)基上可以旺盛分裂；使融合產(chǎn)物在不含激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能夠產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)的就是融合的原生質(zhì)體B、營養(yǎng)缺陷型突變互補(bǔ)；硝酸還原酶的蛋白突變體和輔因子突變體，突變體不能利用硝態(tài)氮，只能利用銨態(tài)氮。兩者的突變位點(diǎn)不同，原生質(zhì)體融合后，硝酸還原酶恢復(fù)，可以利用硝態(tài)氮C、利用對(duì)抗代謝物質(zhì)的敏感性互補(bǔ)進(jìn)行篩選(2)機(jī)械分離雜種細(xì)胞法:原理，利用葉肉細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞原生質(zhì)體的天然色澤標(biāo)記進(jìn)行選擇。方法：混合物培養(yǎng)3-5天后，在顯微鏡下用微吸管將融合產(chǎn)物（4-8個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)）轉(zhuǎn)移，進(jìn)行微室培養(yǎng)。（3）雙熒光標(biāo)記選擇法：異硫氰酸熒光素（FITC）：綠色/異硫氰酸羅丹明（RITC）：紅色4.雜種植株的鑒定：（1）形態(tài)學(xué)鑒定；（2）細(xì)胞學(xué)鑒定；（3）分子標(biāo)記鑒定；（4）熒光原位雜交技術(shù)；（5）蛋白質(zhì)分析（1）形態(tài)學(xué)鑒定：雜種在形態(tài)上往往介于雙親之間，包括株型、葉形、花器官等（2）細(xì)胞學(xué)鑒定；染色體觀察：染色體數(shù)目是雙親之和，或少1至幾條染色體；細(xì)胞融合可以創(chuàng)造非整倍體、代換系、染色體片段置換系等材料流式細(xì)胞儀倍性分析：利用細(xì)胞倍性檢測儀可以粗略地分析雜種細(xì)胞的倍性，一般與雙親對(duì)照分析，測出的雜種的DNA含量基本是雙親之和。（3）分子標(biāo)記鑒定：最有效的檢測手段，能檢測出遺傳物質(zhì)的細(xì)小重組（4）熒光原位雜交技術(shù)：鑒定異源染色體的重組情況，將重組片段定位在染色體上。（5）蛋白質(zhì)分析：蛋白質(zhì)電泳分析：從基因表達(dá)產(chǎn)物判斷真假雜種，一般應(yīng)有雙親作對(duì)照，可以對(duì)多種蛋白作分析第八章植物基因克隆的原理與技術(shù)1.概念：（1）同尾酶（2）同裂（工）酶（1）同尾酶：來源不同的限制酶，識(shí)別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生出相同的粘性末端但兩種同尾酶切割形成的DNA片段經(jīng)連接后所形成的重組序列，不能被原來的限制酶所識(shí)別和切割（2）同裂（工）酶：指來源不同，但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同2.了解各種載體的結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)與容量，掌握載體的選擇載體特點(diǎn)：能自主復(fù)制；易于分離和純化；含有可供選擇的遺傳標(biāo)記；含有一個(gè)或多個(gè)多克隆位點(diǎn)（multipleclonesites,MCS）；不含與復(fù)制無關(guān)的區(qū)域；不影響宿主的生長和繁殖常用的載體：質(zhì)粒，λ噬菌體，粘粒，BAC（細(xì)菌人工染色體），YAC（酵母人工染色體）載體名稱受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片段容量舉例質(zhì)粒E.coli環(huán)狀〈8kbpUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBACE.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列YAC酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kb（1）質(zhì)粒載體的一般生物學(xué)特性:①質(zhì)粒DNA的構(gòu)型：SC型共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA）OC型開環(huán)DNA（ocDNA）L型性DNA（cDNA）②不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著：106～108D③質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型：a.低拷貝的質(zhì)粒（1～3）：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒b.高拷貝的質(zhì)粒（10~60）：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒④質(zhì)粒DNA的接合性：接合是細(xì)菌通過性菌毛相互牽引，然后遺傳物質(zhì)（主要是質(zhì)粒DNA）通過胞質(zhì)通道從供體菌轉(zhuǎn)移給受體菌，使受體菌獲得的新的穩(wěn)定遺傳性狀的現(xiàn)象。接合性質(zhì)粒：能通過接合方式轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒稱為接合性質(zhì)粒，F(xiàn)質(zhì)粒、R質(zhì)粒、Col質(zhì)粒和毒力質(zhì)粒。與兩類基因有關(guān)：tra基因、mob基因和bom位點(diǎn).⑤質(zhì)粒的不親合性：在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時(shí)含有兩種不同的質(zhì)粒。質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)：主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾。經(jīng)典質(zhì)粒載體：pBR322和pUC系列（pUC8/9）結(jié)構(gòu)：pBR322①復(fù)制起點(diǎn)ori②Ampr基因③Tetr基因pUC系列（pUC8/9）①復(fù)制起點(diǎn)②Ampr基因③lacZ的啟動(dòng)子④lacZ’基因pUC特點(diǎn)①更小的分子量②選擇方便③克隆便利（2）λ噬菌體載體：一種可在體外包裝的細(xì)菌病毒，可高效感染大腸桿菌?；蚪MDNA呈線性，其兩端的5’末端帶有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈（粘性末端，cos位點(diǎn)）①噬菌體頭部合成基因,編碼A-F,W7種不同的蛋白質(zhì)(左側(cè))。②噬菌體的尾部合成基因,編碼10種不同的蛋白質(zhì)基因(包括J)。③與λ噬菌體的整合、重組等有關(guān)的基因(中部)。④與λ噬菌體的表達(dá)調(diào)控有關(guān)的基因右半部分(包括N)。⑤其它與λ噬菌體的DNA合成有關(guān)的基因分類：插入型載體，有一位點(diǎn)供外源DNA插入,如凱倫(Charon-40)粒,切點(diǎn)位于－半乳糖苷酶基因內(nèi),長35kb,可容9.4~24.2kb,可供克隆小片段DNA和構(gòu)建基因文庫取代型載體，中央部分有一個(gè)可被外源DNA取代的DNA片段，如GEM11/12,可容24kb,可供構(gòu)建基因文庫（3）粘粒：是將質(zhì)粒和λ噬菌體改建的一種載體，它含COS序列，插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和cos末端。全長8kb?？砂b30-45kb長的DNA片段，多用于基因文庫構(gòu)建。優(yōu)點(diǎn)：.具有噬菌體的特性（cos位點(diǎn)）：被包裝后能高效轉(zhuǎn)化E.coli.具有質(zhì)粒載體的特性：自主復(fù)制，帶有抗性標(biāo)記，易于選擇陽性克隆.高容量的克隆能力：可載高達(dá)45kb外源DNA.因不含的基因，故不會(huì)裂解.便于定向克?。?）YAC酵母人工染色體：含有酵母染色體端粒、著絲點(diǎn)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，YAC是迄今容量最大的克隆載體，插入片段平均長度在200－1000Kb，最大可達(dá)2Mb主要缺點(diǎn)．存在高比例的嵌合體，即一個(gè)YAC克隆含有兩個(gè)本來不相連的獨(dú)立片段．部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會(huì)發(fā)生缺失或重排．難與酵母染色體區(qū)分開，因?yàn)閅AC與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu)．操作時(shí)容易發(fā)生染色體機(jī)械切割.轉(zhuǎn)化效率低BAC細(xì)菌人工染色體：四個(gè)功能區(qū)：①與BAC復(fù)制和分裂有關(guān)的基因，parA，parB是分裂所必需的基因，parB與質(zhì)粒的不相容性有關(guān)②復(fù)制起點(diǎn)及相關(guān)的元件，oriS是單向復(fù)制子；repE基因編碼oriS復(fù)制所必需的蛋白質(zhì)Ｅ③抗生素標(biāo)記基因，載體上攜帶的抗生素標(biāo)記基因?yàn)槁让顾乜剐曰?，是載體的篩選標(biāo)記用途：能攜帶約300kb的DNA片段；用于基因組文庫的構(gòu)建；物理圖譜構(gòu)建；基因的圖位克隆BAC的優(yōu)點(diǎn)：1．易于用電擊法轉(zhuǎn)化E.coli（轉(zhuǎn)化效率比轉(zhuǎn)化酵母高10-100倍）2．超螺旋環(huán)狀載體，易于操作3．F'質(zhì)粒本身所帶的基因控制了質(zhì)粒的復(fù)制4．很少發(fā)生體內(nèi)重排3.掌握基因分離的方法（1）以已知序列為基礎(chǔ)的基因克隆方法：以氨基酸序列為基礎(chǔ)，根據(jù)編碼不同氨基酸的密碼子設(shè)計(jì)出一條簡并引物，以RT-PCR產(chǎn)物為探針或者進(jìn)行RACE-PCR擴(kuò)增的方法克隆基因的全長以核苷酸序列為探針：快速擴(kuò)增cDNA末端——5’端RACE、3’端RACE——mRNA反轉(zhuǎn)錄為一鏈的cDNA——利用5’cDNA的帽子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出的引物分別與基因的特殊引物進(jìn)行PCR嵌套擴(kuò)增獲得一條或者幾條特異的PCR帶型——分別將這些帶型克隆到質(zhì)粒載體上進(jìn)行PCR測序，通過分析和比較以后就可以獲得待克隆基因的5’端的片段（2）以分子標(biāo)記連鎖圖譜為基礎(chǔ)的基因克隆方法：圖位克隆a.先將目的基因定位到染色體上，并在目的基因的兩側(cè)確定一對(duì)緊密連接的分子標(biāo)記（RFLP）b.利用最緊密連鎖的一對(duì)兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)分子標(biāo)記之間的含目的基因組片段克隆并分離出來C.根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補(bǔ)的能力從此克隆重鑒定出目的基因(3)以人工突變體為基礎(chǔ)的基因克隆方法T-DNA插入突變體分離克隆基因的步驟T-DNAvectors——轉(zhuǎn)化植物（hemizygousforT-DNAT1)收獲T2種子——篩選T2，獲突變子，應(yīng)為3：1分離——確定