第1節(jié)重組DNA技術的基本工具第三章基因工程學習目標核心素養(yǎng)1.概述基因工程是在遺傳學、微生物學、生物化學和分子生物學等學科基礎上發(fā)展而來的。2．闡明DNA重組技術的實現(xiàn)需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。1.科學思維：模擬重組DNA分子的操作過程，說出合成新DNA分子的基本原理。2．社會責任：關注基因工程的社會議題，參與討論基礎理論和技術發(fā)展如何催生基因工程。DNA的粗提取與鑒定探究和實踐探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定一、提取生物大分子的基本思路：

選用一定的物理或化學方法，分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。

實驗設計思路：DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W方法去除其他成分，對DNA進行提取。探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定1.提取原理（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度二、提取生物大分子的提取原理與鑒定原理2.鑒定原理

在一定溫度下（沸水?。珼NA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。

DNA+二苯胺沸水浴藍色探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定三、實驗材料的選取：

不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。你認為如下提供的材料中哪些不適合提取DNA？為什么？

供選材料：新鮮洋蔥（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、、獼猴桃（58）；豬肝（38）、魚卵、雞血（78）、哺乳動物的成熟紅細胞；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌（1）（括號內為染色體條數(shù)）原則上，凡是含有DNA的生物材料都可以考慮;選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。(1)研磨液:含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl(2)體積分數(shù)為95%的酒精:析出DNA(3)2mol/L的NaCl溶液:溶解DNA(4)二苯胺試劑:鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用(5)蒸餾水

探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定試劑探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定四、方法步驟：1.取材、研磨:稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨。(1)研磨的目的

破碎細胞，使核物質容易溶解在研磨液中(2)研磨時間不宜太長

防止研磨時產生的熱量影響DNA的提取量(3)有條件的可以在材料處理的過程中加入纖維素酶、果膠酶

研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定2.過濾或離心取上清液：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。①上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質？

可能含有核蛋白、多糖等雜質②低溫放置幾分鐘的作用

可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少其斷裂；四、方法步驟：探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定3.預冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNA

在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數(shù)為95%)，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。(1)攪拌時應輕緩、并沿一個方向減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子(2)酒精預冷的作用:同“低溫放置的作用”四、方法步驟：探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定4.NaCl溶液溶解DNA并鑒定

取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。溶液藍色的深淺與溶液中DNA的含量的多少有關加入2mol/L氯化鈉溶液不加入絲狀物加入4ml二苯胺試劑加入2mol/L氯化鈉溶液加入絲狀物加入4ml二苯胺試劑實驗組對照組水浴加熱四、方法步驟：1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結果如何？結果分析與評價

觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍色說明實驗基本成功；如果不呈現(xiàn)藍色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現(xiàn)了失誤等。

本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。

本實驗可以采取分組的方式進行?？梢赃x取不同的實驗材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實驗結果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實驗材料、哪種提取方法的效果更好。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質嗎？3.與其他同學提取的DNA進行比較，看看實驗結果有何不同，分析產生差異的原因。思考：如果選用雞血細胞進行實驗，如何快速破碎細胞？將雞血細胞置于蒸餾水中，待細胞漲破后，收集濾液。利用蛋白酶分解雜質蛋白，不分解DNA，有利于DNA與蛋白質分開。

進一步純化DNA——用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽溶液中不能溶解的雜質；用低鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。有時會在DNA濾液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），這樣有什么好處？有時還會反復利用不同濃度的NaCl溶液來溶解、析出DNA，試猜想該操作的目的？進一步探究

實驗室提取純度較高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加質量分數(shù)為25%的SDS溶液，使蛋白質變性后與DNA分開；隨后，加入氯仿—異丙醇混合液(體積比為24：1)，通過離心將蛋白質及其他雜質除去，取上清液；可重復上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外由于苯酚可以迅速使蛋白質變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時DNA溶于上層水相，蛋白質變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實驗用具就可以將兩者分開。刑偵破案拓展：DNA提取的應用基因組測序插入人胰島