臨床生物化學檢驗的方法與試劑盒評價李博臨床生化檢驗教研室2017.3.13

臨床生物化學檢驗方法的性能評價臨床生物化學檢驗方法分級與標準品

臨床生物化學檢驗試劑盒目錄

第一節(jié)臨床生物化學檢驗方法與標準品一、檢驗方法分級

IFCC根據方法的準確性與精密度的不同決定性方法參考方法常規(guī)方法

IFCC：(/)

（International

Federation

of

Clinical

Chemistryandlaboratorymedicine）二、參考物質和校準品國際標準化委員會（ISO.)參考物質（RM）定義：一種材料或物質，其一種或幾種特征值足夠均勻并被良好確定，用于校準檢測系統(tǒng)、評價測量程序或為材料賦值的一種材料或物質。參考物質分級：原級標準物質次級標準物質常規(guī)校準物質標準物質與方法的關系決定性方法參考方法常規(guī)方法各級參考物質和校準品的關系及其量值傳遞過程原級標準物質校準品次級標準物質由國際或國家計量機構及經認證的參考實驗室完成1.決定性方法（definitivemethod）

準確度最高、系統(tǒng)誤差最小沒有發(fā)現產生誤差的原因用于發(fā)展及評價參考方法和一級標準品極個別生化檢驗項目有決定性方法：ID-MS、中子活化法、庫倫法、重量法、滴定法等2.參考方法（referencemethod）

準確度與精密度得到充分證實干擾因素少，系統(tǒng)誤差與隨機誤差相比可忽略不計有適當的靈敏度、特異性、較寬的分析范圍主要用于鑒定二級標準品評價常規(guī)方法性能、試劑盒質量大多數生化項目有參考方法3.常規(guī)方法（routinemethod）

性能指標符合臨床或其它目的需要有足夠的精密度、準確度、特異性有適當的分析范圍經濟實用供臨床常規(guī)檢驗使用可成為推薦方法（recommendedmethod）1.原級標準物質(primaryreferencematerial)IUPAC規(guī)定用高純化學物質（純度＞99.98%）直接通過稱重配制的溶液，其濃度已完全確定。具有防潮和高溫（104-110℃）穩(wěn)定的特性與決定性方法平行驗證決定性方法，評價及校正參考方法以及為“次級標準品”定值一級標準品都有證書，屬于有證參考物質（CRM）2.次級參考物質（secondaryreferencematerial）用公認參考方法定值，該方法經原級標準物質校準用于評價常規(guī)方法、為質控物定值美國國家標準及技術研究院（NIST）有48種標準參考物質，屬于有證參考物質，雖純度不及原級參考物質，但與臨床樣品基質相似，與天然的生化物質有相同的理化性質。體液成分測定時最高級別的參考物質。3.常規(guī)校準品（Calibrator）校準：對由儀器、方法和試劑所組成的檢測系統(tǒng)的校準過程用次級標準物質和常規(guī)方法定值的物質用于常規(guī)方法測定校準臨床實驗室常規(guī)使用試劑盒制造商提供的校準品：Roche公司的CFAS（Calibratorforautomationsystem）BECKMAN公司的multiCalibrator校準品（Calibrator）：用于對常規(guī)測定項目進行校準的物質質控品（controlmaterial）：其成份與檢測樣本的基質相同或相似，其瓶間變異必須小于監(jiān)測系統(tǒng)預期的變異，用于在測定過程進行質量控制的物質為了保證質控方法對系統(tǒng)性能提供獨立的評價，必須將質控品與校準品區(qū)分開來校準品與質控品的區(qū)別有證參考物質有證參考物質（CertifiedReferenceMaterial,CRM），其特性值由建立了溯源性的程序確定，且每個特征值都附有給定置信水平的不確定度歐盟執(zhí)委會聯(lián)合研究中心標準與測量研究院（IRMM）、歐盟標準物質局（BCR）、國際臨床化學聯(lián)合會（IFCC）聯(lián)合陸續(xù)發(fā)布25個CRM檢驗結果互認的前提是檢驗時空的一致性，故應明確常規(guī)方法校準品定值的來源。溯源性（Traceability）：通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測量結果或測量結果的值能夠與規(guī)定的參考標準聯(lián)系起來的特性（通常是與國家測量標準或國際測量標準）量值溯源：是使各測量方法的測定值追溯到一公認的標準乃至國際單位，從而建立或驗證其準確性的過程。量值傳遞是量值溯源的逆過程。三、量值溯源溯源鏈自上而下各環(huán)節(jié)的溯源性逐漸降低，而不確定度則逐漸增加實施者是校準品制造商及參考實驗室，溯源證書包括定值和不確定度核心是校準品值的溯源重視檢測系統(tǒng)的比對基本單位決定性方法常規(guī)方法參考方法一級標準品二級標準品發(fā)展參考方法為二級標準品定值發(fā)展常規(guī)方法為校準品定值四、檢測系統(tǒng)的比對1.概念完成一個項目檢驗所涉及的儀器、試劑、校準品、質控品、操作系統(tǒng)、質量控制、保養(yǎng)計劃等的組合

a.配套檢測系統(tǒng)同一廠商，配套使用，結果具有溯源性

b.自建檢測系統(tǒng)臨床上多見，不同檢測系統(tǒng)間缺乏可比性檢測系統(tǒng)比對的實施步驟——以血糖檢測為例某醫(yī)院內血糖的檢測系統(tǒng)包括：1.常規(guī)同的GOD-POD開放試劑自建檢測系統(tǒng)2.HK的配套檢測系統(tǒng)3.急診檢驗用的干化學分析儀配套系統(tǒng)4.臨床科室的POCT檢測系統(tǒng)。如何在院內實現時空的一致性？如何實現實驗室間的一致性？制定分析質量目標對儀器性能進行評價確定對比檢測系統(tǒng)評價檢測系統(tǒng)的分析性能比對可接受性判斷參照CLIA’88包括允許不精密度、允許偏倚和允許總誤差具備可接受的精密度和準確度以具有溯源文件的HK法測定血糖的配套系統(tǒng)為對比，先核實其性能至少包括精密度、準確度、可報告范圍、分析靈敏度、特異性和參考區(qū)間等同時測定40-100例臨床樣本及質控品，平行測定兩次，被測物濃度覆蓋可報告范圍的上限和下限CLSI建議的EP5-A和EP9-A2方案，對兩個系統(tǒng)進行精密度、方法比對及偏倚評估第二節(jié)方法學性能評價準確度：一次測定結果與被測真值的接近程度，取決于特異性正確度：一系列測定結果得到的均值與真值的接近程度，通常以偏倚來表示正確度的高低精密度：在規(guī)定條件下多次測定結果之間的符合程度。不精密度通常用S和CV(%)來表示。一、方法學的性能指標方法正確度、精密度和準確度的關系誤差分類評價試驗評價指標理想結果系統(tǒng)誤差比例系統(tǒng)誤差回收試驗回收率95%~105%恒定系統(tǒng)誤差干擾試驗干擾值接近0恒定和比例系統(tǒng)誤差方法對比試驗a、b接近0、接近1.0隨機誤差重復性試驗CV<3%二、方法學性能評價的內容基本內容：通過實驗途徑，測定并評價方法的精密度與正確度（實際測定的是不精密度與偏倚，均是對誤差的測定）三、方法學評價試驗NCCLS制訂了一系列評價方案(evaluationprotocol,EP)精密度評價——EP5-A、EP5-A2線性范圍評價——EP6-A、EP6-A2干擾試驗——EP7-A、EP7-A2方法對比評價——EP9-A、EP9-A2定量方法的初步評價——EP10-A、EP10-A2定性方法的評價-——EP12-A、EP12-A2基質效應評價——EP14-A、EP14-A2

精密度的評價采用重復性試驗

重復性試驗的目的是測定候選方法的隨機誤差計算出批內、批間、日間和總不精密度指標是CV和SCV越小，精密度越好，反之則差，故稱其為不精密度精密度評價

準確度的評價采用方法比較試驗

方法比較試驗的目的是測定候選方法的恒定和比例系統(tǒng)誤差。

用兩種方法測定多個臨床不同濃度和病理情況的樣品，測定結果進行回歸分析。比較方法應選擇參考方法，其不準確度已經得到證實，不精密度很小，所以測定偏差主要來源于評價方法。準確度評價分析方法正確測定加入常規(guī)分析樣品中的純分析物的能力。目的是測定比例系統(tǒng)誤差，以衡量候選方法的準確度?；厥赵囼灨蓴_試驗在測定某分析物時，受其他非分析物的影響而導致測定結果增高（正干擾）或降低（負干擾）測定方法的恒定系統(tǒng)誤差。原因：基質效應、非特異反應、外部干擾等線性評價

用一系列濃度的分析物做劑量-反應曲線（dose-responsecurve）。若分析物是標準品，稱為標準曲線或工作曲線。用來評價劑量和反應之間的線性關系線性范圍（linearrange）指檢測信號與被測物濃度呈線性時的被測物濃度范圍。測量范圍（measuringrange，分析范圍）指在允許誤差極限內所能檢測的被測物濃度范圍。

理想的常規(guī)檢驗方法，線性范圍應能覆蓋95%以上的臨床樣本方法學性能標準(performancestandards，PS)1.允許分析誤差：依據Westgard制定的95％標本的允許誤差限度，或者95％的病人標本其誤差應小于這個限度，用EＡ表示。EＡ是大量研究,運用統(tǒng)計學方法制定出的。2.醫(yī)學決定水平：臨床判斷結果具有意義的分析物濃度，用Xc表示。性能指標:EＡ和Xc組成某方法的性能指標。即某方法在一定XC下的EＡ值。方法學性能判斷方法的評價方法性能判斷常規(guī)檢驗某一確定的允許誤差方法性能標準(PS):運用統(tǒng)計方法制定出一系列醫(yī)學決定水平上的95％標本允許誤差限度方法的選擇

某一確定的允許誤差實驗誤差CLIA’88第三節(jié)

臨床生物化學檢驗的試劑盒試劑盒的分類和特點（reagentkit）用化學和生物化學反應的原理、用于完成一個特定體外診斷檢驗，而包裝在一起的一組組分。臨床生化診斷試劑種類繁多：按方法分類按劑型分類按組成分類化學法液體型單試劑酶法固體型雙試劑免疫法多試劑

試劑盒的分類1.液體型試劑

優(yōu)點：試劑組分高度均一，瓶間差異小，測定重復性好，使用方便無需加入任何輔助試劑及蒸餾水，避免了外源性水質對試劑的影響，性能較穩(wěn)定，測定結果較為準確缺點：保存時間較短（尤其是酶試劑）不便于運輸1.1液體單試劑及其缺點將某種生化檢驗項目所用到的試劑科學地混合在一起，組成為單一液體試劑。可直接應用缺點：抗干擾能力較差，給測定結果帶來分析誤差。例如：內源性甘油對甘油三酯測定的干擾內外源性NH4+對酶法測定尿素的干擾內源性丙酮酸對ALT、AST測定的干擾維生素C和膽紅素對Trinder反應的干擾1.2液體雙試劑及其應用將某些生化檢測項目所用到的試劑，按用途科學地分成兩類，分別配成兩種試劑第一試劑(R1)加入后可起到全部或部分消除某些內源性干擾的作用（或預反應）第二試劑(R2)為啟動被檢測物質反應的試劑兩種試劑混合后才共同完成被檢項目的生化反應最后用適當的方法檢測反應結果例1：AST液體雙試劑組成例2：Urea液體雙試劑組成液體雙試劑盒的特點抗干擾反應能力強性能穩(wěn)定試劑組分高度均一1提高抗干擾反應的能力血標本成分復雜，除了含有待測物質外，還含有各種蛋白質、酶、有機物、無機鹽等物質，這些都會干擾或參與測試反應，引起非特異性反應雙試劑型試劑盒設計的一個主要目的就是為了克服干擾反應在測定過程中，首先讓試劑1與標本中的干擾物質反應，反應一定時間后，再用試劑2啟動真正的測試反應，從而使測定結果更加準確例1：雙試劑測定尿素抗干擾反應第一步特異性高，脲酶只對樣品中的尿素起催化作用第二步反應存在一些干擾：樣品中的內源性NH4+，污染的NH4+或內源性丙酮酸會消耗NADH，使測定結果偏高：用雙試劑，其中R1先消除上述第2步反應的干擾，再加R2啟動第1步特異反應，再偶聯(lián)第2步反應例2：液體雙試劑消除干擾排除膽紅素的干擾：加入鐵氰化鉀、調整顯色劑pH、改變測定波長來排除膽紅素的干擾加膽紅素氧化酶，使黃疸血清氧化無色，而后再加反應試劑完成測定克服標本中維生素C的干擾：R1中加入維生素C氧化酶，讓標本和試劑1先反應，消除標本中維生素C的干擾再加入R2啟動反應，提高反應的特異性和準確度例3：液體雙試劑測定甘油三酯（1）先與R1進行反應（R1中包括GK、GPO、HPO和抗壞血酸氧化酶），徹底消耗標本中游離甘油，排除抗壞血酸的干擾（2）再用含有Lipase和發(fā)色團的試劑2啟動第a步反應，然后進行第b、c、d步反應，使測定的結果真正反映標本中甘油三酯的含量2性能更穩(wěn)定臨床化學酶法測定的優(yōu)越性：特異性高試劑單一，操作步驟簡單，可自動化反應條件溫和無污染全液體酶法雙試劑的優(yōu)點在使用過程無需任何輔助試劑及蒸餾水，避免了外源水質不純而導致對試劑的影響，保證了試劑在有效期內的穩(wěn)定性可根據標本量臨用時按一定比例配制適量工作液，當天配制當天用完，減少試劑浪費利用自動生化分析儀的雙試劑加樣功能，分別加雙試劑的1、2試劑，延長試劑的有效期3試劑組分高度均一試劑中組分均一性是影響試劑測定重復性的重要因素液體試劑保證了各種組分的均勻性，能提高試劑測定的重復性在干粉、片劑與凍干試劑生產、使用過程必須解決：1）原料干粉生產過程中各種組分的均勻性2）在分裝過程中的加樣誤差引起的均勻性問題3）在使用過程中的復溶，溶劑的加樣誤差也會造成瓶間組分濃度的差異2.固體試劑（粉、片劑型）試劑及其缺點將試劑的各組分用球磨技術粉碎成粉劑或混合后壓成片劑，使用前再加入指定的溶液復溶成液體試劑（已基本退出市場）加工和應用過程存在的問題：要使試劑組分混合得非常均勻，技術難度大分裝過程中的稱量誤差及復溶時加水量的準確性影響試劑的瓶間差水質優(yōu)劣對試劑的穩(wěn)定性和測定的可靠性有相當大的影響3.其它類型試劑快速反應試劑盒卡式試劑盒多項同測組合試劑盒濃縮試劑盒一步法試劑盒3.1快速反應試劑盒用途：適應生化分析的技術進步，縮短反應時間，提高工作效率實例：快速血液葡萄糖測定試劑盒：增加了葡萄糖氧化酶及過氧化物酶用量，更主要是增加了變旋酶，可使反應加快，3～4分鐘后即生成最終顏色快速膽固醇試劑盒：加大膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的用量，使反應加速。樣品與試劑比例是1:100。37℃反應2分鐘即可完成反應3.2卡式試劑盒卡式試劑瓶上條碼有利于快捷準確地將試劑數據輸入儀器可防止試劑蒸發(fā)及降解，能確保試劑裝載后的穩(wěn)定性更長3.3多項組合同測試劑盒三點雙項同測終點法試劑盒三點雙項同測連續(xù)監(jiān)測法試劑盒三點雙項同測終點速率法試劑盒應用：在同一比色杯中，先后加入兩種試劑與樣品中的兩種被檢物發(fā)生反應，在各反應達到平衡時分別測定吸光度，整個測定過程進行三次比色，測定兩個項目，稱為三點雙項同測終點法3.4濃縮試劑盒采用濃縮試劑，使用時自動完成稀釋優(yōu)點：濃縮試劑便于工作、儲存、運輸、裝載濃縮試劑便于減少校正次數、提高工作質量應用擴展：在濃縮試劑基礎上又組成雙試劑及多項同測組合試劑，發(fā)揮各自所具有的特點及優(yōu)越性濃縮CO2試劑應用實例3.5一步法試劑盒屬于方法學改進的新型試劑一步法測定（標本不需要預處理），如高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定：傳統(tǒng)采用超速離心法和沉淀法使HDL從其它脂蛋白中分離后再測定HDL中膽固醇，操作繁瑣，不適合自動分析二、試劑盒的質量標準2006年制訂《臨床化學體外診斷試劑（盒）通用技術要求》規(guī)定通用技術要求：術語和定義、分類和命名、要求、試驗方法、標簽和使用說明、包裝、運輸、儲存。三、試劑盒的性能指標與評價試劑空白吸光度試劑空白吸光度變化速率分析靈敏度線性范圍重復性準確度穩(wěn)定性時間反應曲線臨床試驗空白的定義ReagentBlank：

R1+R2+WaterSelf-Blank：

R1+SampleSampleBlank：

R1(H2O)+R2(H2O)+Sample1試劑空白吸光度用蒸餾水調整分光光度計的零點后，測定待測試劑在測定波長、37℃條件下穩(wěn)定30秒后的吸光度，連續(xù)測定三次，取其平均值作為試劑空白吸光度。2試劑空白吸光度自變化用蒸餾水調整分光光度計的零點后，測定待測試劑在測定波長、37℃條件下穩(wěn)定30秒后，每30秒測定一次吸光度，連續(xù)測定5min,計算出5min內的吸光度變化（ΔA/5min）。3分析靈敏度用ΔA或ΔA/min來表示單位濃度的被測物反應所引起的信號改變分析靈敏度以適合待測物檢測范圍為原則分析靈敏度一般用于批間比較，較能反映制造商的配方、原料的一致性4線性范圍（Linearity）

取高濃度樣品和低濃度樣品按不同比例混合成5個濃度做線性試驗。計算直線方程y=a+bx相關系數當測定結果符合下列指標時，表明在此濃度范圍內溶液與吸光度變化呈良好線性關系：r≥0.9905準確度（accuracy）回收試驗：回收率越接近100%，準確率越高，一般以100%±5%為合格。定值血清測定：對于某些無法準確加入標準物的試劑盒，可用低、中、高濃度的定值血清進行測定，測得值符合定值血清的靶值范圍（±2S）為合格干擾試驗：對維生素C、黃疸、溶血、乳糜等因素的耐受程度，干擾值越小越好比對試驗：被檢試劑盒與參考試劑盒同時測定若干樣本，計算兩組結果的r和回歸方程:y=a+bx

相關系數r越接近1.0、斜率b越接近1.0，截距a越接近0，則準確度越高。r在0.9～1.0之間，r值符合要求不等于準確度都符合要求。b表示比例偏差。(1-b)×100%表示比例偏差的大小a表示恒定偏差。(a值/樣品含量)×100%表示恒定偏差的大小用相對偏差（Bias%）表示測定結果的不準確度。T：樣品靶值：樣品測定結果均值6精密度（Precision）考察試劑的瓶間差異、批內精密度和批間精密度瓶間差異：同一試劑盒，取10瓶試劑復溶，測定同一樣品的含量，求平均值、標準差、變異系數批內精密度：同一樣品用同一瓶試劑測定10次，求平均值、標準差、變異系數批間精密度：同一樣品，用不同批號的10瓶試劑測定，求平均值、標準差、變異系數7穩(wěn)定性評價穩(wěn)定性：指試劑在不同狀態(tài)和不同條件貯存后保持其測定準確性的能力。