ICS65.202.30備案號：30920-2011DB51/T1317—2011蜜蜂白堊病診斷規(guī)程I 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14診斷人員 25發(fā)病規(guī)律 26現(xiàn)場檢測 27實驗室檢測 28結(jié)果判定 3DB51/T1317—2011本標(biāo)準(zhǔn)由四川省畜牧食品局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省蜂業(yè)管理站、四川省蜂產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王順海、鄒志堅、趙平、李念周、羅勤、唐友海。1DB51/T1317—2011蜜蜂白堊病診斷規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蜜蜂白堊病的發(fā)病規(guī)律、現(xiàn)場檢測、實驗室檢測等方面的內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蜜蜂白堊病的診斷、檢疫。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法DB51/T657-2007蜜蜂檢疫技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。由受精卵發(fā)育而成的生殖器官發(fā)育不完全的雌性蜂，具有二倍染色體，是蜂群的主體，擔(dān)負(fù)著蜂群內(nèi)外的主要工作。由未受精卵發(fā)育而成，具單倍染色體，頭近圓形，身體粗壯。主要是尋求與處女王交配，只有在蜂群需要時才出現(xiàn)。由12日-18日齡的工蜂分泌蠟鱗筑造成蜂巢排列而成，是蜜蜂繁衍生息、儲藏食糧的場所。每片培育蜜蜂卵、幼蟲、蛹的巢脾稱為子脾；儲存蜂蜜、花粉的巢脾稱為蜜脾、粉脾。封了蓋的巢脾。封蓋子一般位于巢脾的中下部，呈黃褐色，形狀規(guī)則，輪廓清晰；封蓋蜜一般位于巢脾的上部，色淺，輪廓不清晰，具波浪紋。2DB51/T1317—20113.5蜜蜂白堊病beechalkbrooddisease又名“石灰質(zhì)病”,是蜜蜂球囊菌寄生而引起的蜜蜂幼蟲死亡的傳染性真菌病。一般4日齡的蜜蜂幼蟲，特別是雄蜂幼蟲易感染。4診斷人員4.1診斷人員符合DB51/T657-2007蜜蜂檢疫技術(shù)規(guī)范中對檢疫人員的要求。5.1發(fā)病條件多流行于初夏、秋季節(jié)，特別是陰雨潮濕，溫度變化頻繁的氣候條件下易產(chǎn)生。5.2病原來源被病原污染的飼料、患病的幼蟲尸體或被病原污染的巢脾是病害傳播的主要來源。5.3典型癥狀漸變成灰色至黑色。蟲尸干枯后，變成一塊似白堊狀的質(zhì)地較為堅硬的塊狀物，表面覆蓋白色的菌絲與深墨綠近黑色孢囊。6現(xiàn)場檢測6.1箱外檢查蜂箱外巢門近旁有被工蜂拖出的幼蟲干尸，質(zhì)硬，有的干尸呈蒼白色，表面有一層絨毛膜，劈開幼蟲干尸可見內(nèi)心為淺棕色；有的干尸為部分或全部黑色，表面有一層黑色顆粒狀物質(zhì)。6.2開箱檢查在已封蓋的子脾上有呈星點式分布的被工蜂咬開的巢房，巢房內(nèi)有向一側(cè)帖壁的幼蟲干尸，形態(tài)完整，質(zhì)地柔軟，無光澤，無臭味，干尸有的為白色，有的為部分或全部黑色。7.1設(shè)備、材料和試劑低倍光學(xué)顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺。7.1.2材料3DB51/T1317—2011無菌培養(yǎng)皿、載玻片、試管(10ml)、無菌鑷子、接種針。7.1.3試劑實驗室用水(符合GB/T6682-2008中三級水的規(guī)格要求)、馬鈴薯酵母膏瓊脂培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、75%酒精。7.2抽樣7.2.1抽樣比例當(dāng)蜂群數(shù)量小于或等于10群時，均采樣；在10群～100群時，以10群采樣量為基礎(chǔ)，每增加10群，采樣量增加1群；在101群～200群時，按總?cè)簲?shù)的15%采樣；在201群以上時，按總?cè)簲?shù)的10%采樣。采樣時，每群蜂取10只~20只幼蟲送實驗室檢查。若現(xiàn)場診斷有疑似感染蜜蜂球囊菌時，可以根據(jù)實際情況，增加采樣的比例。7.2.2抽樣方法從每個蜂群中隨機(jī)抽取子脾一張，按照5點式采樣方法，分別從巢脾四角與中央各開啟相鄰的封蓋幼蟲房5個，觀察是否有患病幼蟲存在。采樣時，若發(fā)現(xiàn)明顯變色或死亡的幼蟲則不受所圈定的部位限制，應(yīng)盡量采集送實驗室檢查。7.3實驗室檢測7.3.1鏡檢法取幼蟲尸體樣品于無菌培養(yǎng)皿中，刮取樣品表層物于干凈的載玻片上，加一滴無菌蒸餾水，制成水浸片，等5分鐘后在低倍光學(xué)顯微鏡下觀察。放大倍數(shù)為400或600。有呈白色似棉花狀的菌絲和橢圓形內(nèi)含有孢子的孢囊，可初診為白堊病。7.3.2分離培養(yǎng)將馬鈴薯酵母膏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化冷卻至47℃時加入青霉素、鏈霉素各50萬單位抑制雜菌生長，然后用接種針取病死幼蟲體表物接種到培養(yǎng)基上，一般接種3個點~4個點，置27℃~29℃培養(yǎng)，72小時后進(jìn)行觀察，當(dāng)真菌在培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢囊后，用接種針取少許孢囊置載玻片上，做水浸片，在低倍光學(xué)顯微鏡下觀察，可看到菌絲內(nèi)有許多細(xì)胞核，圓形孢子囊內(nèi)含有孢子球，球內(nèi)含有孢子，孢子表面平滑。8結(jié)果判定在現(xiàn)場檢查時，若見到巢門前、箱底或巢脾上長有白色菌絲或黑白兩色的幼蟲尸體等臨床癥狀時，可做出初步判斷。在分離