第2節(jié)

基因工程的基本操作程序第2課時能闡述基因表達載體的構(gòu)建過程。01能闡述將目的基因?qū)胧荏w細胞的方式及原理。02能闡明目的基因的檢測與鑒定所涉及的技術(shù)原理03

獲取了足夠量的Bt基因后，下一步就是要讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時，使Bt基因能夠表達和發(fā)揮作用這就是需要構(gòu)建基因表達載體。這也是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的核心工作那么基因表達載體是由哪些部分組成的呢？第二步：基因表達載體的構(gòu)建不能。游離的DNA進入受體細胞，一般會直接被分解，即使可以轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂而進行復(fù)制，導(dǎo)致子代細胞中不再含有目的基因。獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因?qū)朊藁毎?？思考：各個元件有什么作用？

因此，獲取Bt基因后，還需要借助載體將其導(dǎo)入棉花細胞，才能使棉花植株獲得抗蟲特性。（核心工作）三、基因表達載體的構(gòu)建1.目的：①讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代;

2.組成：啟動子：基因的前端，RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位；驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。限制酶切割位點，插入目的基因終止子：基因的尾端，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用——基因工程的核心基因表達載體=啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有復(fù)制原點）思考1：目的基因該插入什么位置？目的基因插入位點不是隨意的：基因表達載體需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。啟動子和終止子之間的部位思考2：啟動子有哪些類型？①組成型啟動子：每種組織器官中均發(fā)揮作用。②組織特異型啟動子：特定組織器官中才能發(fā)揮作用。③誘導(dǎo)型啟動子：特定條件下刺激才能發(fā)揮作用。誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)物作用激活或抑制目的基因表達誘導(dǎo)型啟動子：

載體

≠

基因表達載體二者都有：標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。基因表達載體：在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子。思考3：“載體”＝“基因表達載體”？原因：①生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；②通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；③目的基因?qū)胧荏w生物中需要有篩選標(biāo)記；④為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)無件，如增強子等；⑤有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因或做成目的基因與標(biāo)記基因的融合基因，如綠色熒光蛋白基因。思考4:“啟動子”＝“起始密碼子”？

“終止子”＝“終止密碼子”？啟動子（DNA分子中）≠起始密碼子（mRNA分子中）

終止子（DNA分子中）≠終止密碼子（mRNA分子中）終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子3.基因表達載體的構(gòu)建過程：載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種思考：該過程需要用到基因工程哪些工具酶？重組DNA分子目的基因思考:使用同一種DNA限制酶進行切割，會得到幾種重組DNA？有何缺點？怎么改進？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1雙酶切：選擇2種不同的限制酶同時對目的基因和質(zhì)粒切割，得到兩種不同的末端，可減少自身環(huán)化及反向連接等問題出現(xiàn)。思考：如何防止自身環(huán)化和反向連接的問題？雙酶切-G-CTTAA-A-TCTAG雙酶切：切出的黏性末端不能再堿基互補配對將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法我國科學(xué)家獨創(chuàng)將目的基因?qū)胧荏w細胞（常用）基因槍法（單子葉植物常用）第三步：②在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去

，將DNA溶液滴在

，使目的基因通過

進入

。①用微量注射器將

溶液

直接注入

中；花粉管通道法導(dǎo)入外源DNA適用生物：開花植物（1）花粉管通道法（我國獨創(chuàng)）1.目的基因?qū)胫参锛毎康幕駾NA子房柱頭花柱切面花粉管通道胚囊實例：我國“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”優(yōu)缺點：簡便經(jīng)濟（優(yōu)點）要求花朵較大（缺點）四、將目的基因?qū)胧荏w細胞

農(nóng)桿菌是生活在土壤中的微生物，自然條件下可侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞、并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：指目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②原理：農(nóng)桿菌能在自然條件下侵染

植物和

植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有

，當(dāng)它侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的

轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的

上。雙子葉裸子Ti質(zhì)粒T-DNA染色體DNA可轉(zhuǎn)移的DNA目的基因Ti質(zhì)粒表達載體農(nóng)桿菌植物細胞植物細胞染色體DNA新性狀植株構(gòu)建轉(zhuǎn)入導(dǎo)入插入表達③過程：目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA中重組DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌侵入植物將目的基因帶入植物細胞含外源目的基因的重組DNA整合到植物細胞的基因組中目的基因遺傳特性穩(wěn)定維持和表達1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關(guān)系？T-DNA不是目的基因，但它將來會被整合到宿主細胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進入宿主細胞并整合到宿主細胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進入植物的一個體細胞中，但基因工程最終要的是一個轉(zhuǎn)基因植株，如何實現(xiàn)這一目標(biāo)？

得到含有目的基因的植物細胞后進行植物組織培養(yǎng)討

論：該過程經(jīng)過____次拼接、____次導(dǎo)入①第一次拼接：_____________________________________②第二次拼接：

_____________________________________③第一次導(dǎo)入：_____________________________________④第二次導(dǎo)入：_____________________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌將插入目的基因的T-DNA拼接到受體

細胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌將含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細胞（非人工操作）拓展—拼接&導(dǎo)入2.將目的基因?qū)雱游锛毎?）常用方法：（2）受體細胞:顯微注射法受精卵①體積大，易操作。②易表現(xiàn)出全能性。（3)過程：構(gòu)建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物問題:為什么常選用受精卵作為受體細胞呢？（1）常用方法：Ca2+處理原核細胞（常選擇大腸桿菌）（2）受體細胞：Ca2+感受態(tài)細胞吸收3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎麅?yōu)點：繁殖周期短

體積小易于培養(yǎng)操作多為單細胞

遺傳物質(zhì)相對較少使用Ca2+處理：增加細胞壁的通透性，可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（感受態(tài)細胞）。Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子【注意】原核生物作為受體細胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。（因為沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體對蛋白質(zhì)進一步加工。）小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法

受體細胞

轉(zhuǎn)化過程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA中→表達目的基因表達載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細胞→重組的基因表達載體導(dǎo)入細胞中農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2＋處理法體細胞或受精卵受精卵原核細胞

將基因表達載體導(dǎo)入受體細胞后，如何判斷導(dǎo)入是否成功？即使導(dǎo)入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達？思

考：檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性。類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的鑒定DNA水平：受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因RNA水平：目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR或DNA分子雜交技術(shù)蛋白質(zhì)水平：目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等PCR或分子雜交技術(shù)等五、目的基因的檢測與鑒定1.檢測目的：2.檢測內(nèi)容及方法2.檢測內(nèi)容及方法:（1）分子水平的檢測檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因①檢測目的基因是否導(dǎo)入——方法1：通過PCR等技術(shù)檢測提取棉花細胞DNA用與Bt基因相關(guān)的引物進行PCR擴增對擴增產(chǎn)物進行檢測DNA半保留復(fù)制基本思路：制作基因探針，并用PCR擴增；提取受體細胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養(yǎng)液；高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。探針與受體中的DNA分子雜交出現(xiàn)雜交帶：不出現(xiàn)雜交帶：已插入未插入提取棉花細胞DNA用與Bt基因相關(guān)的引物進行PCR擴增對擴增產(chǎn)物進行檢測——方法2：DNA分子交雜技術(shù)變性提取目的基因的DNA片段用放射性同位素標(biāo)記，作為基因探針；使探針與轉(zhuǎn)基因生物基因組雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則導(dǎo)入成功。原理：堿基互補配對原則①檢測目的基因是否導(dǎo)入檢測Bt基因是否翻譯出mRNA提取棉花細胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA對擴增產(chǎn)物進行檢測用與Bt基因相關(guān)的引物進行PCR擴增②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄——方法1；通過PCR等技術(shù)檢測（1）分子水平的檢測如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄——方法2：分子雜交技術(shù)制作基因探針；探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明轉(zhuǎn)錄出了mRNA。變性探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交分子（可檢測）原理：堿基互補配對原則③檢測目的基因是否翻譯——通過抗原-抗體雜交檢測

從轉(zhuǎn)基因生物提取出來的蛋白質(zhì)和相應(yīng)的抗體進行雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，說明目的基因已經(jīng)翻譯。蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白抗原抗體雜交脫分化從棉花中提取蛋白質(zhì)用相應(yīng)抗體進行抗原-抗體雜交檢測2.個體水平