蛋白印跡技術(shù)（westernblot）蛋白印跡技術(shù)又稱免疫印跡技術(shù)或western印跡技術(shù)，是鑒別蛋白質(zhì)的分子雜交技術(shù)原理：

1.將經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上。2.以固相載體上蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的未標(biāo)記的一抗起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的二抗反應(yīng)。3.經(jīng)過底物顯色、化學(xué)發(fā)光或放射自顯影，檢測特異基因表達的蛋白成分的存在和含量。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。【基本原理】【W(wǎng)esternBlot流程】蛋白樣品的制備SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色目的：為避免作為檢測試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理。封閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位，也不與抗體和或檢測試劑有交叉反應(yīng)。常用的封閉試劑有1-3%的BSA或者5%的脫脂奶粉，緩沖液一般選擇PBST或者TBST。其中的Tween有助于去除非特異性的結(jié)合，減少背景。封閉液：5%的脫脂牛奶，TBST配制（室溫搖床孵育1小時）TBST含有0.1%Tween20，不影響抗體與抗原的結(jié)合，有助于去除非特異性的結(jié)合，減少背景的干擾。注意：1.膜正面朝上2.進行下一步之前請用1xTBST溶液清洗3次，每次10min【W(wǎng)esternBlot流程】蛋白樣品的制備SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色目標(biāo)蛋白注射入第一動物模型動物產(chǎn)生抗目標(biāo)蛋白的抗體，純化（一抗）將第一動物模型產(chǎn)生的抗體注射入第二動物模型使其產(chǎn)生的抗體，經(jīng)純化(二抗),再用酶或同位素標(biāo)記。PVDF膜用TBST溶液清洗完后，放入含1：10000稀釋的一抗溶液中（用TBST溶液稀釋），室溫至少1h或4oC過夜。回收一抗放置4oC保存，用1xTBST溶液清洗PVDF膜3次，每次10min【W(wǎng)esternBlot流程】蛋白樣品的制備SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色PVDF膜放入1：3000倍稀釋的HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的二抗溶液中（用TBST稀釋），置室溫搖床1h。1xTBST清洗PVDF膜3次，每次10min1xTBST清洗PVDF膜3次，每次10min【W(wǎng)esternBlot流程】蛋白樣品的制備SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色1.放射自顯影2.底物化學(xué)發(fā)光ECL3.底物熒光ECF4.底物DAB呈色現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色Westernblotting蛋白顯影方法在Ecl底物中，含有魯米諾（溶液A）和H2O2（溶液B），在HRP（辣根過氧化物酶）催化劑的作用下，

luminol和H2O2反應(yīng)生成一種過氧化物，過氧化物不穩(wěn)定隨即分解，并發(fā)出熒光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。注意：熒光在一段時間后會越來越弱。HRP只是起催化作用，并不消耗，所以是可以重復(fù)加ECL反應(yīng)液進行

觀察。增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)

顯色原理：氨基苯二酰肼類：主要是魯米諾（luminol）及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學(xué)發(fā)光劑。顯色原理取化學(xué)發(fā)光液A、B各0.5ml等量混合，直接加在PVDF膜上，反應(yīng)2-5min。在化學(xué)發(fā)光檢測儀上觀察并記錄實驗結(jié)果。Westernblotting示意圖1.剪膜，檢測蛋白為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），大小約為36kDa，因此根據(jù)預(yù)染蛋白marker提示剪取36kDa上下共約3條預(yù)染蛋白大小寬度。甲醇激活，TBST漂洗。2.封閉（封閉液：5%脫脂牛奶，TBST），室溫，1小時。TBST淋洗。3.一抗反應(yīng)，室溫孵育，1小時4.洗滌：TBST，3次，每次10min5.二抗反應(yīng)，室溫孵育，1小時6.洗滌：TBST，3次，每次10min7.ECL顯色：A，B化學(xué)發(fā)光液各0.5ml