胰蛋白酶活性檢測試劑盒實驗解決方案原理胰蛋白酶選擇性水解變性蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，是一種重要的消化酶。此外，胰蛋白酶還廣泛應(yīng)用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等的輔助治療。CheKine?胰蛋白酶活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動植物組織生物樣本。在該試劑盒中，胰蛋白酶催化水解TAME的酯鍵，釋放出的游離羧基與反應(yīng)體系中的氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng)，導(dǎo)致溶液的pH值降低，以苯酚紅為指示劑，測定溶液在555nm處吸收值的變化，可以快速測得胰蛋白酶活性數(shù)據(jù)。胰蛋白酶在一定范圍內(nèi)與555nm處吸收值的降低呈良好的線性關(guān)系。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見光分光光度計（能測555nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。WorkingReagent：臨用前配制；根據(jù)用量按照ReagentⅠ（V）：ReagentII（V）：去離子水（V）：ReagentIII（V）=1mL：1mL：5.4mL：0.4mL的比例充分混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。用多少配多少，在空瓶中配制，48T中帶有2個空瓶，96T中帶有4個空瓶。注意：ReagentII有一定的刺激性，建議在使用過程中做好個人防護。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應(yīng)控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，即粗酶液，置冰上待測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟酶標(biāo)儀或可見光分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到555nm，可見光分光光度計用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：試劑測定孔（μL）樣本5WorkingReagent195混勻后立即測定，記錄555nm下1min時的吸光值A(chǔ)1和2min時的吸光值A(chǔ)2。計算△A=A1-A2。注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果ΔA小于0.005，可將反應(yīng)時間延長到5min。如果ΔA大于0.5，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎剑ㄍ茖?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。胰蛋白酶活性的計算按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：室溫下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個酶活單位。胰蛋白酶(U/mgprot)=ΔA×V反總÷(Cpr×V1)÷0.5÷T=80×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計算：酶活單位定義：室溫下每克組織每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個酶活單位。胰蛋白酶(U/g鮮重)=ΔA×V反總÷(W×V1÷V2)÷0.5÷T=80×ΔA÷WCpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：組織質(zhì)量，g；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，5μL=0.005mL；V2：粗酶液總體積，1mL；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；T：反應(yīng)時間，1min。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.本試劑盒測定小鼠脾臟和玉米種子中胰蛋白酶的活性相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB2270CheKine?酸性蛋白酶（ACP）