第二章飼料氨基酸的分析

JohannesFontaine*

德國哈瑙應用技術(shù)德固薩有限公司飼料添加劑分公司

一、介紹

飼料加工者的獲利對飼料中最佳且精確的氨基酸組成的依賴從沒有像現(xiàn)在這樣明顯。

氨基酸對動物的生長和飼料轉(zhuǎn)化的影響如此顯著，以至現(xiàn)在全世界每年向飼料中添加的合成

蛋氨酸和賴氨酸都超過了400,000公噸。這使得我們更加需要對飼料原材料中的氨基酸進

行分析，從而為飼料線性規(guī)劃改善氨基酸模型，而且使其成為一種配合飼料和預混料的質(zhì)量

保證工具。

在本書第一版中A.P.Williams綜述了到1992年為止，有關(guān)氨基酸分析方面的文獻。在

第二版中，我們將重點介紹最近十年里的發(fā)展?，F(xiàn)在有許多有關(guān)氨基酸分析的出版物，但僅

有一小部分與動物營養(yǎng)（如飼料原料、食品、植物、青貯料、植物和動物源副產(chǎn)品、動物血

漿、腸道和瘤胃內(nèi)容物等）相關(guān)檢驗模型有關(guān)。在這里我們將對這些主題進行討論。

近些年的一個重要發(fā)展無疑是早已成熟的分析飼料原料中氨基酸的國際標準。在二十

世紀八十年代歐洲監(jiān)督機構(gòu)的分析專家堅持歐盟的不同國家采用各自不同的氨基酸檢測分

析方法，但最終也在國際間協(xié)作的氛圍下，建立起了歐盟一種統(tǒng)一的分析方法。最近，在廣

泛的研究背景之下，歐洲已經(jīng)通過了對動物飼料原材料中總氨基酸和游離氨基酸的官方測定

方法和對色氨酸的測定方法（CommissionDirectives98/64/EC和2000/45/EC）。國際間協(xié)作

同時也是國際AOAC分析測定除色氨酸外全部氨基酸方法（AOAC,1994）建立的基礎(chǔ)。

AOAC的官方分析方法作為包括北美自由貿(mào)易區(qū)（NAFTA）在內(nèi)的全球各種分析方法的總

結(jié)，而被全球所承認。飼料分析推薦采用的方法是用荀三酮衍生陽離子交換樹脂進行的色譜

法分離氨基酸。不同方法的樣本制備本質(zhì)上都相同。歐盟對飼料中色氨酸的標準測定步驟是

利用氫氧化鋼堿水解和用特定熒光測定的HPLC分析技術(shù)。

另一種創(chuàng)新是對飼料原材料中氨基酸的近紅外光譜（NIRS）測定方法的發(fā)展，這種方

法以可靠的濕化學分析為基礎(chǔ)。這些使如今的原材料中氨基酸組成的快速而簡單的分析和最

新的飼料優(yōu)化成為可能。這一發(fā)展也將在此給予詳細介紹。

Kivi（2000）所作的針對色譜法等檢測方法的綜述也值得特殊關(guān)注，因為它是對本綜

述的極好補充。

二、濕化學分析

（-）樣品制備

1.酸水解及氧化

氨基酸的測定需要蛋白質(zhì)水解為不同的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域由于其R側(cè)鏈功能的不同

而具有不同的作用。天冬酰胺和谷氨酰胺失去側(cè)鏈中的酰胺殘基而分別形成天冬氨酸和谷氨

酸，反應產(chǎn)生的氨可以由色譜法檢測出來，但是氨基酸分析只能測出天冬氨酸/酰胺和谷氨

酸/酰胺的總量。大部分色氨酸在酸水解中破壞，而蛋氨酸和胱氨酸部分氧化成幾種衍生物。

歐盟和美國的標準水解條件是在110℃（鹽酸沸點）下用6M鹽酸水解24h?？梢栽诨亓餮b

置中進行，也可以在恒溫烘箱的密閉容器中進行。這些條件可以使所有氨基酸得到最佳還原。

攜帶一個羥基基團的絲氨酸和蘇氨酸隨著水解時間的延長和酸性的增強而慢慢降解。異亮氨

酸、亮氨酸和繳氨酸等支鏈氨基酸，尤其當它們在蛋白質(zhì)中相鄰排列時，其被水解時空間位

阻的釋放更加緩慢。Albin等（2000a,b）最近研究了這個課題，還研究了酸濃度對大豆產(chǎn)

*注：E-mail上也址：iohannes.tbntaine血

品的影響。Rowan等(1992)檢測了水解時間(8-72h)對日糧、回腸食糜和糞便樣本的

影響。標準條件下的最佳還原量通常是5—10%,有時可達20%或更高。作者都推薦使用矯

正因子。

在微波烘箱內(nèi)150℃水解可以減少蛋白質(zhì)分解為小分子所需的時間(Carisano,1992;

Joergensen和Thestrup,1995;Marconi等,1996;Shang和Wang/997;Kroll等，1998)。如果僅

能獲得微量蛋白，那么使用氣態(tài)氯化氫就好些(Schrijver等，1991；Molnar-Perl和Khalifa,

1994)。Fountoulakis和Lahm(1998)對蛋白質(zhì)水解技術(shù)做了概述，其中還包括不常用的酸，

如甲烷酸或?qū)妆交撬?或是利用酶(Hauck,1990;Chen等，1996)。Weiss等(1998)利用

色譜純化蛋白比較了不同水解技術(shù)。在歐盟標準方法(CommissionDirective98/64/EC)中，

水解的矯正因子像之前荷蘭所實行的那樣，被排除了。水解的側(cè)鏈反應依賴于基質(zhì)，并且可

能很大量，尤其是在微波水解中。所以，矯正因子應該在不同飼料原材料中分別給予定義，

尤其是在配合飼料中。而且，在編制原材料組成表時，應用不同的矯正因子將導致分析誤差

的增加。另一方面，全球應用一致的標準水解條件才可能產(chǎn)生一致的氨基酸分析結(jié)果。含硫

氨基酸在蛋白質(zhì)水解之前就被過甲酸氧化為蛋氨酸颯和磺基丙氨酸，它們存在于酸水解中，

損失很少。在歐盟和AOAC的官方方法中，每含10mg氮的樣本對應于5ml過甲酸在0℃

過夜(16h)。在此之前，過甲酸是在室溫下由4.5ml88%的過甲酸和0.5ml30%的過氧化

氫，再加少許苯酚配制而成，不可濃縮或儲藏。幾十年前這些反應條件就在Schram等人

(1954)的工作基礎(chǔ)上標準化了。過量的過甲酸之后可以被加入的濱化氫或氯化氫還原，生

成澳或氯,由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)掉。Spindler等(1984)、Elkin和Griffith(1985),還有Gehrke

等(1987)研究了在這些條件下所有氨基酸的還原情況，他們的研究表明，除苯丙氨酸、組

氨酸和酪氨酸外的所有酸穩(wěn)定氨基酸，在氧化之后都由水解產(chǎn)物完全還原了。Mason等

(1980a,b)和Bech-Andersen等(1990)試圖精簡這一步驟，提出通過加入焦亞硫酸鈉鹽

來還原過甲酸。它的好處是不再需要在水解前去除鹵素，而且苯丙氨酸和組氨酸也可以從氧

化水解產(chǎn)物中測定出來。這種方法能夠測定除色氨酸和酪氨酸以外的所有氨基酸。但是，這

樣一來，水解產(chǎn)物就包括由去除了鹽酸后而濃縮的亞硫酸鹽所形成的硫磺酸或是硫酸，它們

可以由絲氨酸和蘇氨酸合成硫酸酯，在氨基酸分析儀中將對磺基丙氨酸產(chǎn)生干擾。歐盟的方

法就是以這種方法為基礎(chǔ)，對水解產(chǎn)物進行中和，這完全可以實現(xiàn)自動化，或是通過蒸餌去

除部分鹽酸?？赼mes和Fontaine(1994)將這種改進了的氧化和酸水解方法與世界范圍內(nèi)

28個研究者合作參與的，針對小肉雞和大肉雞、玉米、魚粉和雞肉粉進行測定的試驗結(jié)果

相比較，得到了相近的結(jié)果(表2.1)。Toran等(1996)還建議用氧化方法測定嬰兒配方中

的胱氨酸和蛋氨酸。

Slump和Bos(1985)指出，如果添加劑或濃縮料中鹽的氯水平超過1%,就會干擾蛋

氨酸的氧化。這使得過甲酸被部分降解，生成氯，于是僅磺基丙氨酸完全形成，而不是蛋氨

酸颯。如果這種方法可行，那么作者建議用稀釋過的過甲酸進行氧化測定蛋氨酸，但并不適

用于胱氨酸。德國VDLUFA(1997)視此步驟為分析氯含量高的日糧中蛋氨酸的官方方法。

Tuan和Phillips(1997)的工作也值得一提，他們在1450c下，分不同時間在真空安甑管中

用鹽酸水解時加入二硫化物和33-二硫代二丙酸的混合物，以此來研究以酪蛋白和高梁為

主的日糧和食糜中胱氨酸的還原情況。他們用100倍摩爾濃度的試劑還原胱氨酸的效率達到

99%.但是，在飼料和食糜中的得到的結(jié)果非常不一致，使得不能對這種方法進行評價。

2.色氨酸分析

色氨酸，這一必需氨基酸可能成為口糧中的限制性氨基酸，尤其是在母豬口糧中。目前

已經(jīng)對其分析方法進行了廣泛的研究。近些年，主要研究在完全無氧條件下進行堿水解來分

析。Simat和Steinhart(1998)最近發(fā)表了對游離和結(jié)合色氨酸氧化的詳細研究過程，并對

其反應產(chǎn)物給予了描述。Nielsen和Hurrell(1984)在真空容器中用氫氧化鈉另加內(nèi)標5-

甲基色氨酸和水解淀粉水解(110℃,20h)進行對比試驗。而Werner(1986)以及Rogers

和Pesti(1990)則在充氮氣后，在無內(nèi)標的情況下用氫氧化鋰進行水解，因為氫氧化鈉會

腐蝕玻璃。在他們的試驗中，色氨酸還原率為97—99%。Slump等(1991)比較了在高壓

滅菌鍋內(nèi)(130℃,8h)氫氧化鋰和氫氧化釧的水解效果，僅在水解后添加了內(nèi)在標準，且

獲得了相同的還原效果，即先前估計的對確定蛋白和純色氨酸的92%的還原率。

Bech-Andersen(1991)建議在滅菌鍋內(nèi)用氫氧化鈉溶液添加乳糖進行水解，從而提高還原

率，并用a-甲基色氨酸作為內(nèi)標。Ranfft和Faure(1993)利用14個歐洲試驗室的不同內(nèi)

部方法對配合飼料和四種飼料原材料進行相互比較，發(fā)現(xiàn)協(xié)方差的變化范圍為4%(大豆)

到10%(玉米)，且在所用氫氧化物、溫度、時間或水解技術(shù)方面未看到顯著差異。Landry

和Delhaye(I992a,b,1994a)以及Delhaye和Landry(1992,1993)在色氨酸的測定方面

進行了廣泛的研究。水解時采用了三種氫氧化物、不同的反應時間和溫度以及幾種試驗步驟,

并對各種變換進行了比較。他們最終得到結(jié)論，認為在高壓滅菌鍋內(nèi)用氫氧化鋼添加5-甲

基色氨酸作為內(nèi)標來彌補損失而進行水解。他們還建議在反向(RP-)硅膠上的HPLC條件

應為獨立反應10分鐘，并用熒光檢測。Landry和Delhaye(1994b)對所有協(xié)作研究得到的

色氨酸值進行了評估。他們認為以上條件使色氨酸的還原率提高15-20%。許多研究者建議

用紫外或熒光的HPLC技術(shù)進行檢測，其中熒光檢測因為其對色氨酸檢測的特異性而更受

推崇。

Landry和Delhaye(1992a)還對用交聯(lián)葡聚糖膠滲透進行的分離、用陽離子交換柱進

行的分析或在用對二甲氨基肉桂醛染色后的比色分析之間進行了比較。其他研究者還用由對

二甲氨基苯甲醛(Lee等，1996)或硝酸(Shan等，1996)轉(zhuǎn)化形成的酸性苛三酮方法對色

氨酸進行了比色測定(Pinter-Szakacs和Molnar-Perl,1990)?不過，把這種方法與HPLC方

法進行比較，HPLC因為操作更簡單且結(jié)果更精確而更受重視。對HPLC的廣泛認同使得先

前普遍應用的分光光度法測色氨酸的方法漸漸消失。Molnar-Perl(1997)對分析肽和蛋白質(zhì)

中色氨酸的各種方法進行了編輯，包括在飼料原材料中不常使用的技術(shù)，如酸水解或酶水解,

氣相色譜法或沒有化學衍生現(xiàn)象的衍生光譜法。Carisano(1993)在溫度控制條件下用氫氧

化鋰進行微波水解，使得肉和魚在不到60分鐘的時間內(nèi)就全部水解，與用氫氧化鋼在110℃

下水解12h得到的結(jié)果相似。他用鄰苯二甲醛(OPA)在HPLC之前對色氨酸進行衍生，而

Algeria等(1996)用異硫氟酸苯酯(PITC)對色氨酸進行轉(zhuǎn)化。

歐盟委員會的一個專家組，DGXII,已經(jīng)在建立歐盟一致的飼料分析系統(tǒng)的相關(guān)研究上

進行了4年之久的研究。Fontaine等(1998)報道了由12-16研究者參加的三個合作試驗結(jié)

果，試驗比較了氫氧化鋰、氫氧化鈉和氫氧化鋼，比較了在水解當時和水解之后對內(nèi)標的使

用，比較了5-甲基或a一甲基色氨酸作為內(nèi)標的穩(wěn)定性，并比較了真空或除氮的水解容器與

高壓滅菌鍋使用的差別。其中的試驗參加者，Landry和Delhaye(1994b)提出了之前敘述

的觀點，即在用氫氧化鋼水解的過程中加入5-甲基色氨酸做內(nèi)標，并且用他們特殊的高壓

鍋條件獲得的色氨酸濃度比其它技術(shù)所得的高15%。然而，又一個合作試驗表明，在不考

慮水解技術(shù)條件下，這種內(nèi)標的使用時分析值比a-甲基色氨酸作為內(nèi)標時顯著提高

13-20%。比較兩種內(nèi)標的水解穩(wěn)定性，得到5-甲基衍生物不如色氨酸穩(wěn)定，而a-甲基色氨

酸顯然比色氨酸更穩(wěn)定。這導致對結(jié)合態(tài)色氨酸水解損失的過校正，從而使水解過程中內(nèi)標

的添加受阻。在高壓鍋內(nèi)用4M氫氧化鋼水解是最佳的條件。而且，在水解后添加穩(wěn)定的a

-甲基色氨酸可以提高各實驗室之間試驗結(jié)果的相似程度。測定添加的色氨酸的方法也得到

了優(yōu)化，就是在內(nèi)標存在情況下用0.1M鹽酸進行水解。CommissionDirective2000年出版的

書中將所采用的方法在歐盟強制施行，其精確性很高，重復性CVR在2.2—6.3%之間，第二

次實驗為1.5—4.7%之間。

(-)添加的或游離的氨基酸與?；撬?/p>

目前，所有配合飼料都添加氨基酸，并且對這種添加的測定是飼料工業(yè)重要的質(zhì)量保

證工具。Fahnenstich和Tanner(1973)發(fā)展了一種用經(jīng)稀釋的0.1M冷鹽酸從幾克細粉料中

提取游離氨基酸的方法。Mason等(1980a)采用了相似的提取條件，但是添加硫代雙乙醉

作為色譜分析前提取物中蛋氨酸和蛋白質(zhì)沉淀物的穩(wěn)定劑。CommissionDirective(1998)規(guī)

定的提取條件，實質(zhì)上與歐盟的官方方法相同，遂將二者合并，用于測定飼料中的添加氨基

酸。在歐盟的合作試驗中，用預混料對這種提取方法進行了測試，實驗的CVr及各實驗之間

的CVR都有很好的重復性(表2.2)。稀釋后的鹽酸不能引起蛋白質(zhì)的水解。但是，我們不

能把添加的氨基酸和自然的飼料原材料以外的非蛋白結(jié)合氨基酸區(qū)分開。在進行陽離子交換

色譜之前需要做的就是將PH值調(diào)到2.20,并且據(jù)我們的經(jīng)驗所知，并不需要對提取物進行

特殊的清理。在我們實驗室用正亮氨酸作內(nèi)標對不同的配合飼料進行提取，可以得到較好的

1-1.5%的實驗重復性(Fontaine,2002)。Foulon等(1990)比較了用水、85%乙醇和如前

所述的加了緩沖溶液的酸水解提取物對蛋氨酸和賴氨酸提取的效果，其中在用0.1M鹽酸時

獲得最佳還原率。Saurina和Hemandez-Cossou(1993)介紹了專門測定商業(yè)飼料中添加賴

氨酸含量的流動注射分光光度法。Bech-Andersen(1997)發(fā)展了在含重金屬濃度高的礦物

質(zhì)預混料中采用的堿/酸水解條件，從而得到不含重金屬離子的提取物，因為重金屬離子會

極大程度的干擾陽離子交換柱。Fontaine和Eudaimon(2000)詳細介紹了在氨基酸分析儀

中用于測定的一種酸提取方法，尤其是用于測定商業(yè)氨基酸產(chǎn)品和濃縮預混料。他們在17

個國際合作試驗中對這些產(chǎn)品進行了測定。他們的實驗室間重復力CVR為1.5-2.6%,在精

確配制的預混料中氨基酸產(chǎn)品的還原率為97.5-102.8%。這種方法被AOAC國際組織采用，

作為官方首要方法。

日糧氨基酸對血漿、肌肉或肝臟等的游離氨基酸濃度的影響也成為許多動物試驗所研

究的課題。這些模型需要加入酸或溶劑，通過物理方法(超濾等)進行脫蛋白沉淀。Walker

和Mills(1995)在綜述中寫到，在人類疾病的診斷工作中，沉淀物中主要含終濃度為4-5%

的5-磺基水楊酸，這在Jonge和Breuer(1994)在豬血漿，以及Hagen等(1993)在牛血漿

中得到的結(jié)論是一致的。Sedgwick等(1991)用丙酮或乙月青比較了在牛血漿和牛血清白蛋

白溶液中的蛋白質(zhì)沉淀和高氯酸或三氯乙酸沉淀。酸沉淀的氨基酸在較寬泛的溶解蛋白質(zhì)濃

度范圍內(nèi)(4-16%)的還原率較高。然而，在沉淀中含有游離氨基酸的溶劑隨著蛋白質(zhì)含量

的增加，其還原率降低到僅有50%。另一方面，Aristoy和Toldra(1991)在用高氯酸、三

氯乙酸、苦味酸和乙曙沉淀蛋白質(zhì)或用10kDa排阻限進行超濾測定新鮮豬肉和干腌火腿時，

也得到了同樣令人滿意的結(jié)果。但是用磺基水楊酸或在1kDa時超濾得到的還原率較差。

Peter等(1999)也用三氯乙酸對海藻細胞提取物進行蛋白質(zhì)沉淀，Bugueno等(1999)乙

晴對雄魚肉進行脫蛋白。Antoine等(1999)用75%甲醇分析魚肉樣本中的游離氨基酸。還

有，Hara等(1999)用30%磺基水楊酸制備尿樣。VandeMerbel等(1995)介紹了利用分

離蛋白的超濾技術(shù)和離子交換色譜進行發(fā)酵的過程中，對氨基酸的在線監(jiān)控技術(shù)。因此，在

開始的試驗中，需要測定去除多余蛋白的多種變量以及添加氨基酸的還原率。

半胱氨酸的代謝衍生物，牛磺酸為貓所必需，但在嬰兒營養(yǎng)中也具有重要作用。它以

非結(jié)合形式存在，原則上也可用分析游離氨基酸的方法進行測定。Balschukat和Kunesch

(1989)介紹了在氨基酸分析儀中用0.1M高氯酸提取后，測定魚粉、寵物飼料和動物原材

料中?；撬岷康姆椒?。Nicolas等(1990)同時使用超濾和離子交換色譜方法對嬰兒配方

奶粉和人乳中的?；撬釢舛冗M行了測定。McCarthy等(2001)在一項合作試驗中用酸水解

(6MHC1,110℃,16h)和丹磺酰氯的柱前衍生對寵物食品中的?；撬徇M行測定。六個濕

的和干的貓狗糧樣本的實驗室間重復性CVRS為6.1-13.3%,這一步驟成為AOAC國際組織

的官方方法。

Porter等(1988)、Amiss等(1990)、Sakai和Nagasawa(1992)以及Messing和Sturmann

(1993)介紹了用不同試劑的柱前衍生后HPLC分離來測定貓和其它物種血液和血漿中的

?；撬岷?。

(三)色譜分離與測定

近來兒篇有關(guān)氨基酸分析的綜述文章需要在此首先提及。Morr和Ha(1995)報道了食

品中蛋白質(zhì)和氨基酸的普遍分析方法，而Rutherfurd和Moughan(2000)的工作主要集中在

分析動物飼料中的氨基酸。Molnar-Perl(2000)介紹了測定食品中糖、竣酸和氨基酸的色譜

技術(shù)，并提及氣相色譜和毛細現(xiàn)象技術(shù)。Fekkes(1996)以及Walker和Mills(1995)對分

別在生理樣本或生物液體中進行氨基酸測定的進展進行了報道。以分離程度為例，對不同色

譜技術(shù)進行了詳細描述。

1.離子交換色譜(IEC)

通過陽離子交換柱(聚苯乙烯硫酸鈉或鋰鹽)用三到五種檸檬酸鹽，有時用具有不同離

子作用力、PH和不同修飾物的醋酸緩沖液進行所有氨基酸的色譜分離，這種方法從1948

年就開始發(fā)展，Spackman等人在1958年利用其原理發(fā)明了自動化氨基酸分析儀。50多年

后，這種方法因其突出且穩(wěn)定的分離效果而成為氨基酸分析的標準方法，使我們可以分析血

漿中多余45種的氨基酸進行分析(鋰緩沖液)，沉積時間和達到最大量的范圍都具有較高的

重復性，校準值也具有廣泛的穩(wěn)定性?？紤]到配合飼料的復雜組成，樹脂因其可以抵抗基質(zhì)

的影響而具有重要的作用。污垢的加厚和分離效果的降低在多數(shù)情況下都可以通過簡單的改

變流動方向而得以校正。在作者的實驗室里，離子交換柱通常連續(xù)使用一年之久；然后才對

其進行清理，并再生樹脂，重包裝柱子。因此，一臺氨基酸分析儀的運行耗費遠遠比使用

RP-HPLC柱少，因為后者不能再生且易受脂肪和飼料中的非極性物質(zhì)所損害而需要經(jīng)常更

換。我們通常用加熱的線圈中的苛三酮或用OPA進行柱后衍生，后一試劑的敏感性大約是

前者的20倍。柱后衍生的主要好處是，每種氨基酸，無論是樣本中的還是標樣中的，都是

在各自的洗提緩沖液中利用相同的條件進行衍生。而且，衍生狀態(tài)下的氨基酸在用色譜分析

時，比常規(guī)的HPLC柱前衍生具有更高的分化程度，柱前衍生時氨基上結(jié)合有一個很大的

非極性分子。而且，這種反應必須在相應的基質(zhì)中進行，因為各自的基質(zhì)可以影響反應產(chǎn)物

的量和衍生物的穩(wěn)定性。Butikofer等(1992)主持了一項合作實驗，在乳產(chǎn)品和飼料樣品

中，對柱后衍生后的HPLC分析與作為經(jīng)典的離子交換柱另一選擇的OPA和氯甲酸-9-笏甲

酯(FMOC)的混合物方法進行了比較。雖然這兩種方法得到的結(jié)果相似，但是正C的重復

性和精確性都較高，如果試驗需要較高精確性的話，還是推薦使用IEC,因為IEC的設(shè)備技

術(shù)已經(jīng)非常成熟，所以較少文章對其操作細節(jié)進行描寫。Grunau和Swiader(1992)以及

Moeller(1993)在有兩或三個洗提梯度的HPLC儀器中使用IEC柱。LeBoucher等(1997)

使用新的氨基酸分析儀一一HitachiL-8500A,用生物液體對具最高重復力的生產(chǎn)性能、沉積

時間穩(wěn)定性和線性濃度作了廣泛的測試，得到了較理想的結(jié)果。

2.其它對非衍生氨基酸的分離和檢測技術(shù)

氨基酸的分離還可以用陰離子交換色譜與毛細管電泳脈沖安培法(PAF)相結(jié)合進行測

定。這種分離方法的原理很有趣，因為它的洗提順序與陽離子交換柱是相反的，比如，精氨

酸和賴氨酸在短時間內(nèi)就可洗提出來。PAD的金屬電極涂有可氧化的有機基團，如含有羥

基、氨基和硫基的化合物，而不是無機鹽或碳酸。Martens和Frankenberger(1992)成功地

將這種新方法運用在不同的蛋白和小麥變種上，雖然精氨酸(高)和谷氨酸的檢測靈敏度差

異因子為30且色譜圖的基線不是很穩(wěn)定，但所獲得的分離度和重復性還是滿足條件的。

Simonson和Pietrzyk(1993)系統(tǒng)的檢測了陰離子在用于間接光度法(IPD)中提高效率與

敏感性的分離緩沖液中的影響。最近，戴安公司的儀器制造者，Jensen和Hofler(1999)成

功地將陰離子交換色譜儀器用于肉產(chǎn)品、發(fā)酵液和果汁得PAD分析上。Casella等(2000)

對奶酪樣本進行測定，發(fā)現(xiàn)絕對值5-10pmol的測定范圍足夠用于線性檢測。Jandik等(2000)

提高了精氨酸在樹脂上的沉積時間，測定了大豆水解產(chǎn)物。DeBruijn和Bout(2000)對甜

菜進行了測定，但必須去除大部分糖，因為糖會對測定產(chǎn)生干擾。Jandik等(2001)為了避

免這種干擾，采用氫離子形式的陽離子交換柱，從而在允許糖通過的情況下保留了氨基酸。

在8年多的發(fā)展時間后，陰離子交換色譜法還是沒能在飼料分析行業(yè)中廣泛接受。

很少研究者用RP-HPLC分離非衍生氨基酸。Saurina和Hernandez-Cassou(1994)詳細

描述了運用離子對色譜的洗提系統(tǒng)，并于柱后衍生后在309nm,65℃時用

1,2-naphthochinone-4-sulphonate對氨基酸進行測定。這種方法適用于動物飼料和奶粉中氨基

酸的測定。Arlorio等(1998)還用離子對色譜法分析芳香族氨基酸、食品中維持生命所需

的胺以及奶酪中的高濃度氨基酸。紫外測定對這些氨基酸的靈敏性很高。最近發(fā)展起來的化

學發(fā)光氮檢測儀可以對未衍生的氨基酸進行特異且敏感的度量(Fujinari等，1993；Bizanek

等，1996；Petritis等，2001)?Pei和Li(2000)介紹了專門測定氨基酸的安培感應器,這

種儀器利用固定的氨基酸氧化酶并用在HPLC上。

最近發(fā)展起來的在不同分離介質(zhì)中測定氨基酸的毛細管電泳法(CE,毛細管區(qū)域電泳

(CZE),膠束動點毛細管色譜法(MECC))也得到了廣泛的研究。在這種方法中，氨基酸

離子或衍生物在電場中通過毛細管遷移，涉及到多種技術(shù)。我們在此僅提及Smith(1997)

對這項技術(shù)的綜述文章，近來有些研究利用CE分析了飼料和皮膚(Michaelsen等，1994)

或大豆蛋白中的氨基酸組成(Oguri等，1997)、啤酒(Klampfl等，1998)或醬油和飲料(Soga

和Ross,1999)中的游離氨基酸，以及人血漿中的蛋氨酸和同型半胱氨酸(Vecchione等，

1999)。

3.柱后衍生后的HPLC

在用非極性、紫外-可見光光度計或熒光活性試劑對氨基基團進行柱前衍生后，所有氨

基酸都可以由RP-HPLC分離出來。這對實驗室來說很有利，因為實驗室僅僅是偶爾測定氨

基酸，HPLC設(shè)備與氨基酸分析儀不同，它是多功能的。我們一直在研發(fā)新的衍生劑，且可

以被專利權(quán)保護，這對HPLC制造者很有利。實驗技術(shù)主要在衍生條件(溫度、時間、試

劑分離)、衍生穩(wěn)定性和檢測方法等方面有差別(參見表2.3)。目前還未找到理想的試劑，

近來的研究進展也沒能替代己建立的老方法。

由PITC衍生的方法很早就建立起來，操作起來有些繁瑣(反應時間長，需要在真空容

器內(nèi)蒸儲去除多余試劑)。Waters用特定設(shè)備進行Pico-Tag方法使這種衍生方法得以廣泛的

商業(yè)化。形成的PITC氨基酸在酸性環(huán)境中非常穩(wěn)定，可以在堿性環(huán)境中環(huán)化成乙內(nèi)酰苯硫

HR(PTH)氨基酸(二次反應)。首次命名的衍生物通常在紫外光下進行色譜檢測。樣本經(jīng)

過甲酸氧化后，所產(chǎn)生的磺基丙氨酸和蛋氨酸颯也可以經(jīng)色譜法分離出來。

Cohen和Strydom(1988)以及Molnar-Perl(1994)對這一課題寫過綜述,Khalifa和

Molnar-Perl(1996)研究了水解產(chǎn)物中和過程產(chǎn)生的鹽對衍生的影響，并未看到差別，所以

通常采用的通過蒸偏除鹽酸的方法并不必要。Vasantis和Molnar-Perl(1999)系統(tǒng)地研究并

優(yōu)化了27種氨基酸的分離條件。Elkin和Wasynczuk(1987)成功地將此技術(shù)應用在飼料原

材料和配合飼料上，并將其與IEC進行了比較。通常介紹的PITC方法與IEC是等價的。Zhao

等(1992)還對動物飼料和谷物進行了檢測，報導了對高淀粉含量物質(zhì)衍生的干擾作用。

Suzuki和Early(1993),Shang和Wang(1996)以及Gonzalez-Castro等(1997)報導了在

植物產(chǎn)品中進行的PITC氨基酸分析。Toran等(1996)對嬰兒配方奶粉進行了研究，并對

含硫氨基酸的色譜測定條件進行了優(yōu)化。另外，Alonso等(1994)對這些產(chǎn)品中的游離氨

基酸進行了測定，20分鐘就可以對其定量，實驗室內(nèi)CM低于10%。其他研究者還用這項

技術(shù)分析了血漿以及其他生物樣本中的游離氨基酸。(Hagen等，1993；Hariharan等，1993；

Bugueno等，1999；Campanella等，1999)。

OPA與硫醇的復合物產(chǎn)生的柱前衍生既具有快速的反應速度(室溫下一分鐘)，又能用

于特定且靈敏的熒光檢測。雖然次要氨基酸不參加反應，但是這可以通過在用OPA完全反

應后添加FMOC來避免這種現(xiàn)象，F(xiàn)MOC-脯氨酸的形成就是一個例子。OPA衍生的穩(wěn)定性

非常有限，在測定賴氨酸時尤其如此。因此，OPA衍生最好是完全在自動取樣器內(nèi)實行自

動化測定。May和Brown(1989)、Molnar-Perl和Bozor(1998)Molnar-Perl和VasantisC1999)

以及Molnar-Perl(2001)系統(tǒng)地分析了不同硫醇、試劑混合物和衍生條件對氨基酸衍生物

產(chǎn)量和穩(wěn)定性的影響。Butikofer等(1991,1992)對飼料、乳/谷物混合物和奶酪進行測定,

比較了OPA/FMOC柱前衍生和經(jīng)典的離子交換色譜的精確性和重復性。根據(jù)他們的實驗結(jié)

果，水解產(chǎn)物分析的重復性在各實驗室間相似，但熒光檢測對出賴氨酸以外的所有氨基酸的

檢測靈敏度要高5-20倍。雖然環(huán)狀試驗得到的平均濃度幾乎相同，但是對幾乎所有氨基酸

(尤其是限制性蛋氨酸、賴氨酸和蘇氨酸)而言，重復性明顯要低。飼料樣本的重復性最差,

作者解釋是衍生過程中的基質(zhì)產(chǎn)生了干擾作用。Puchala等(1994)用對牛瘤胃中的蛋氨酸

亞颯和其他氨基酸進行了測定。Li等(1998)用這種方法對飼料樣本進行了測定，Heems

等(1998)對豆餅和飲料進行了測定,Zunin和Evangelisti(1999)測定了嬰兒配方奶粉,

Baek等(1999)測定了醬油中的氨基酸和胺，Herbert等(2000)和Pripis-Nicolau等(2001)

分析了葡萄汁和葡萄酒中的游離氨基酸。其他研究者還測定了海產(chǎn)品中的游離氨基酸濃度

(Vazquesz-Ortiz等，1995；Antoine等，1999,2001)?這種方法還可以用于分析血漿和尿

液中的游離氨基酸的濃度(VanEijk等,1993；Begley等，1994；Fekkes等，1995,2000：

Czaudema和Kowalczuk,1998；Tcherkas等，2001)。

另一種用于柱前衍生的熒光試劑是FMOCo它可以在室溫下與所有氨基酸快速反應，

但是比OPA要慢。得到的衍生物很穩(wěn)定，且分析溶液可以在冰箱里保存幾天。在有水的情

況下，9-笏甲醇從高熒光活性試劑中逐漸產(chǎn)生，并在氨基酸色譜途中央處洗提出來。因此，

我們需要一個提取步驟用到非極性試劑，如果不能在一個特定自動取樣器內(nèi)取樣，這就會變

成一個不利條件。Cottingham和Smallidge(1988)使用這個技術(shù)測定全價料中的總賴氨酸

和預混料中的添加賴氨酸，取得了較好的結(jié)果。Femandez-Trapiella(1990)測定了豆粕、

肉粉、魚粉和其他飼料原料中經(jīng)過甲酸氧化后的蛋氨酸、胱氨酸和賴氨酸，獲得了與通常使

用的IEC方法相等價的結(jié)果.不過，目前還沒有將FMOC用于飼料分析的論文發(fā)表。

Kirschbaum等(1994a,b,c)用這種方法測定了氨基酸和胺，Arnold等(1994)對未成熟的

咖啡豆進行了分析，Or-Rashid等(2000)和Sultana等(2001)對瘤胃液中的游離氨基酸進

行了檢測。也有對生物樣本進行的試驗(Ndibualonji等，1992；Ou等，1996；Or-Rashid等,

1999)?

1993年，Millipore公司推出了一種新的衍生試劑一一6-氨基喳咻基一N-羥基琥珀酰亞

氨基甲酸酯(AQC),他們用這種試劑和IEC兩種方法同時分析飼料樣本進行比較(Cohen和

DeAntonis,1994)。據(jù)這些研究的結(jié)果，高熒光活性的試劑可以與氨基酸快速反應，且較易

發(fā)生衍生反應，形成的衍生物在室溫下可以穩(wěn)定保存幾周。研究者介紹了分離氧化水解產(chǎn)物

中磺基丙氨酸和蛋氨酸颯的HPLC條件，且試劑間互不干擾。Liu(1994)測定了添加到飼

料水解產(chǎn)物的14種氨基酸標準的還原情況，發(fā)現(xiàn)還原率在92-112%之間，平均為98%。相

比較而言，1EC除蘇氨酸(85%)和精氨酸(117%)外，對其他氨基酸的還原率為93-110%。

Liu和其他研究者結(jié)束衍生步驟時，在反應區(qū)的封閉的自動取樣器小瓶中于50-55℃對衍生

混合物加熱10分鐘。Liu等(1995)在食品和飼料樣本中用這種方法進行檢測，排除了中

性水解產(chǎn)物中鹽的干擾作用。肉雞飼料和玉米的色譜圖表明氧化水解中所有氨基酸都較好的

分離開來。在幾種樣本中，用IEC也得到了一致的結(jié)果，包括對精氨酸和蘇氨酸的檢測。

Wendelen和Cohen(1997)研究了骨膠原水解產(chǎn)物和細胞培養(yǎng)介質(zhì)中的氨基酸分離條件，

并設(shè)計了一套由四部分組成的優(yōu)化洗提系統(tǒng)。Reverter等(1997)用這項技術(shù)對豬的血漿進

行了分析，但是用雙梯度系統(tǒng)不能使所有血漿氨基酸完全分離。Miao等(2000)對不同飼

料所有氨基酸分析得到的還原率為88-110%o另一種廣泛使用的衍生劑是二甲基氨基蔡磺酰

氯，在氨基酸和產(chǎn)物穩(wěn)定的情況下需要在70℃保持12分鐘來進行轉(zhuǎn)化，著色后的衍生物用

光度計在436nm進行檢測。Beckman公司的Schneider(1989)對這項技術(shù)的分離條件和重

復性進行了綜述。Drnevich和Vary(1993)用這種方法對血漿樣本進行了分析，Ikeda等(1993)

利用此試劑對骨膠原中的羥脯氨酸和脯氨酸進行了測定，并且Krause等測定了生物樣本和

食品中的氨基酸和生物合成胺。

另外值得一提的是，Sanz等(1996)利用早已使用的、具熒光活性的二甲基氨基蔡磺

酰氯分析了乳和蛋中的蛋白質(zhì)，還把它用于兩個課題中，這兩個課題分析了用氣相色譜

(GC-MS)后，衍生為易揮發(fā)化合物的飼料和植物原材料中的氨基酸(Oh等，1995；

Muranszky,1996)?

(四)單一氨基酸的特殊測定

如果想要測定水解產(chǎn)物中的單一氨基酸或發(fā)酵溶液、果汁或提取物中這種游離形式氨基

酸的濃度，就可以不用色譜分離法，不過需要用到一種特異于此種氨基酸的試劑或酶。

Marko-Varga等(1993)報導了氨基酸的特定酶檢測系統(tǒng)。Pohlmann等(1990)發(fā)明了一種

專門測定賴氨酸的酶流動注射方法，每小時可以檢測30個樣。Lavagnini等用相似的流動注

射分析法，對飼料水解產(chǎn)物中的賴氨酸濃度進行了測定，Chen等(1996)測定了魚飼料中

的添加賴氨酸。Vrbova等(1992)介紹了能夠用于測定小麥提取物中特異于L-賴氨酸的酶

電極。Hikuma等(1991)介紹了在使用L-賴氨酸氧化酶后的熒光檢測法測定飼料水解產(chǎn)物

中的賴氨酸，這種方法在測定配合飼料、魚粉和大豆時結(jié)果與IEC方法高度一致。Hsieh等

(1995)用荀三酮鐵測定了培養(yǎng)肉湯中的賴氨酸.色氨酸的比色試驗已在上文提到。

(五)有效/活性賴氨酸

蛋白質(zhì)中的賴氨酸在熱處理時易被破壞，而且還表現(xiàn)出糖的減少，這是因為它含有一個

活性L氨基基團。賴氨酸在參加過美拉德反應后，對動物或人的蛋白質(zhì)合成就不再有效。

1960年，Carpenter介紹了體內(nèi)測定有效且活性較高賴氨酸的實驗方法，在這種方法中，蛋

白質(zhì)用2,4-二硝基氟苯(FDNB)進行反應，產(chǎn)生的著色的二硝基苯①NP)-賴氨酸用水解后光

度法測定。理論上，只有L氨基基團具有活性的轉(zhuǎn)化賴氨酸在動物蛋白質(zhì)代謝中有用。還

有人介紹了其它試劑和測定條件，如用OPA或肌:基化轉(zhuǎn)化為同型精氨酸(見下)。但是，

這種試驗被許多問題困擾著，比如L氨基基團在樣本蛋白質(zhì)懸液中衍生的化學可進入性問

題，還有由基質(zhì)產(chǎn)生的干擾和二次反應問題。因此，我們通常使用另一種更為復雜精密的

FDNB方法，在這種方法中，非衍生樣本中的總賴氨酸和未轉(zhuǎn)化賴氨酸在用FDNB反應并

水解后由色譜法進行測定。二者的有效賴氨酸有差別。Carpenter等(1989)將這些方法以

及體外測定魚和肉中有效賴氨酸的另兩個試驗，和大鼠體內(nèi)生長試驗測定植物源性食品的有

效賴氨酸進行了比較；除了純蛋白樣本酪蛋白和大豆蛋白外，其他體外試驗都失敗了。Faldet

等(1991,1992)為了反芻動物對蛋白質(zhì)的利用率達到最大，且獲得賴氨酸利用的最佳條件,

而將之前提到的不同方法和大鼠生長試驗應用在經(jīng)不同條件熱處理后的大豆樣本上進行了

試驗。最近的一些試驗，多是利用HPLC測定以谷物為基礎(chǔ)的嬰兒食品、嬰兒配方奶粉和

其它食品中的DNP-賴氨酸，但是并未用生物學實驗對結(jié)果進行比較(Castillo等，1997；

Albala-Hurtado等，1997；Femandez-Artigas等，1999：Hermandez等，2001）。

Mauron和Bujard（1964）建立了一種可利用賴氨酸的分析方法，這種方法基于￡-氨基在

堿性環(huán)境下。-甲基異胭胭基化形成同型精氨酸，經(jīng)水解后同型精氨酸可以用IEC進行層析

測定。雖然這種蛋白質(zhì)中的衍生現(xiàn)象僅在室溫下可行，且需要幾天的反應時間，但是它在今

天還被普遍應用。Mao等（1993）利用這種方法測定了經(jīng)葡萄糖和堿處理后的大豆蛋白中

的有效賴氨酸，并將其結(jié)果與總賴氨酸分析試驗進行了比較。他們的實驗結(jié)果表明，雖然在

用葡萄糖處理后總賴氨酸下降了17-40%,但是有效賴氨酸含量卻下降了78-85%。用臟基反

應證實熱堿處理所引起的損害更為有效，因為在酸水解時一些被損害的賴氨酸（如美拉德反

應初始產(chǎn)生的果糖-賴氨酸）可以再除去。Imbeah等（1996）對酪蛋白和豆粕中的胭基化反

應條件進行了優(yōu)化。他們在可溶奶蛋白中測得賴氨酸轉(zhuǎn)化率為100%,而大豆中低于80%。

許多研究者，如Ravindran等（1996）在消化試驗中對飼料原料進行胭基化，以此測定內(nèi)源

氨基酸分泌量。后者主要研究棉籽蛋白中的最佳轉(zhuǎn)化率，棉籽蛋白中有64%的賴氨酸轉(zhuǎn)化

為同型精氨酸，同時還給出了其它飼料原料的賴氨酸轉(zhuǎn)化率。Moughan和Rutherford（1996）

設(shè)計了最佳衍生條件，并在相一致的試驗條件下，比較了用胭基反應法和FDNB法測定經(jīng)

熱處理后酪蛋白/乳糖混合物中活性賴氨酸的結(jié)果。此試驗與后續(xù)研究（Rutherfurd和

Moughan,1997；Rutherfurd等，1997）旨在建立一個新的分析“可消化活性賴氨酸”生物

分析方法，這種方法對測定消化試驗中賴氨酸消化率的準確性更高，因為它在分析原材料和

食糜中的賴氨酸食，不能除去蛋白質(zhì)水解前被損壞的賴氨酸。還有些試驗用OPA測定了蛋

白質(zhì)、乳產(chǎn)品或奶中有效賴氨酸的含量（Vigo等，1992；Medina-Hernandez和Alvarez-Coque,

1992；Morales等，1996）。這種方法的有利之處在于熒光測定的快速性和簡單性，因為并不

需要在此之前進行蛋白質(zhì)水解。

比較飼料原料和飼料的不同方法中，體外方法較適宜且有效。這些試驗中的相關(guān)影響有

一定意義，但是有關(guān)賴氨酸有效性的確定結(jié)果很大程度上受基質(zhì)對測定系統(tǒng)的影響，且通常

與動物試驗得到的結(jié)果有很大分歧。

（六）數(shù)據(jù)的準確性與精確性

定期進行的用于氨基酸分析的合作試驗已經(jīng)由不同組織開展了幾年。如今，如果一個實

驗室想要使其被公眾認可，就必須保證試驗結(jié)果的確定性。但是，合作試驗試驗的結(jié)果還未

公開出版。所有實驗室都可以加入的組織包括每月都要進行環(huán)形試驗的AAFCO（美國）以

及每進行四到八個樣本測定的Bipea（法國）和KDLL（荷蘭）。這些組織和其他不可輕易加

入的組織所得到的數(shù)據(jù)對氨基酸分析技術(shù)狀態(tài)的說明比那些已出版的合作試驗結(jié)果更為準

確，這些已出版的結(jié)果多數(shù)是重視方法的設(shè)計和標準化。表2.2對之前提到的一些文獻上報

導的結(jié)果進行了總體的描述，多是采用國際AOAC組織和歐盟協(xié)會的官方方法。之前的蛋

白質(zhì)氧化是含硫氨基酸總濃度分析準確性稍低的原因之一，蛋白質(zhì)的氧化使得在樣本制備過

程中產(chǎn)生了額外的變異；另一個原因是，含硫氨基酸在蛋白質(zhì)中含量普遍偏低，其濃度僅

0.6-3%,因此峰值較低且峰值積分誤差較高。而且，在IEC中，磺基丙氨酸通常以分離柱

的最大容積進行洗提，限制了基質(zhì)對這個區(qū)域的干擾作用。由于抽提的簡單化，對添加氨基

酸分析的重復力比測定總氨基酸要低。對2-5個因子來講，實驗室內(nèi)重復力CM通常比實驗

室間重復力CVR好，因為后者因其使用不同的設(shè)備、處理手段和標度而使隨機誤差不可避

免地有所提高。倘若實驗室一直受環(huán)形測試和比對試驗的監(jiān)視，那么氨基酸分析的準確性和

精確性就有了保證。

三'飼料中氨基酸的近紅外光譜分析

反射比技術(shù)中的近紅外光譜（NIRS）是一種簡化的分析方法，僅需要對樣本進行研磨

并在NIRS設(shè)備中對飼料進行掃描。這種無害的測定方法不需要化學藥品，且結(jié)果在幾分鐘

內(nèi)就可以得到。自二十世紀七十年代早期，原材料和配合飼料的光譜范圍就與粗成分各自的

濃度相關(guān)聯(lián)，由濕化學進行分析，用化學統(tǒng)計相關(guān)性對一組樣本建立了多元標準(Kramer,

1998及其引用專著)。在那時僅大學和研究院有可以進行此項工作的大型計算機。這種校正

應該包括至少50個樣本，才能囊括多數(shù)樣本類型，從而用于估計新樣本的校正參數(shù)。

Rubenthaler和Bruinsma(1978)以及Gill等(1979)首先建立了小麥和大麥中氨基酸含量

的校正方法,幾年后有了關(guān)于谷物和豌豆中氨基酸校正方法的論文(William等，1984,1985)。

但是，直到二十世紀九十年代，這項吸引人的測定技術(shù)才隨著低成本、強大功能的個人電腦

的出現(xiàn)和可以使標準相互轉(zhuǎn)化的軟件的發(fā)明，而被包括飼料廠在內(nèi)的公眾廣泛接受，并適應

了近紅外分光光度計。Workman(1991)、Michalski和Mroczyk(1992)>Shenk(1994)、

Dyer和Feng(1996,1997)以及Pazdernik等(1997)還建立了分析豆粕和種子、谷物和油

菜籽中氨基酸的準確校正方法,從而在分析大范圍原材料種類時,有一部分原料實現(xiàn)了NIRS

方法對花費較高的濕化學分析方法的替代。所有這些試驗方法對氨基酸標準的使用都受到地

理和季節(jié)的限制。氨基酸生產(chǎn)廠家，Rhone-Poulenc(現(xiàn)在稱Aventis)是第一家用消化率研

究中的原材料樣本設(shè)計分析家禽可消化和總氨基酸濃度的公司，以此來為全世界消費者提供

服務(wù)。VanKempen和Jackson(1996)>VanKempen和Simmins(1997)、VanKempen和Bodin

(1998)以及Bodin等(1999)發(fā)表的論文中介紹了對所有主要飼料原材料中的必需氨基酸

進行分析得到的試驗結(jié)果。工作的目的是提高日糧配制中的可消化氨基酸含量，這樣使得原

材料的質(zhì)量波動可以用NIRS分析出來，而不必僅僅依靠總結(jié)好的消化率數(shù)據(jù)。因為做消化

率試驗花費太高，所以研究者因為缺乏足夠的特征性原材料而被迫建立起從66個樣本(包

括魚粉、禽肉粉和肉骨粉)中得到的動物粉料分析標準以及僅以每種原料20—30個樣本為

基礎(chǔ)建立起豆粕、小麥和玉米的分析標準。合作試驗并未對原材料變異的不完全范圍和未知

分析誤差給予定量，動物試驗測得的消化率系數(shù)使得預測結(jié)果的可靠性有待商榷。德固薩專

門分析氨基酸的實驗室旨在建立單一原材料中總氨基酸含量的標準。Fontaine等(2001,

2002)介紹了14種原材料的分析標準，大多包括100—330個樣本，這些標準會定期更新。

在多數(shù)情況下，交叉檢驗的方差P遠高于0.8,一部分原因是由于NIRS與濕化學之間具有

相關(guān)性?？紤]到富含蛋白質(zhì)飼料的必需氨基酸含量平均值標準，交叉檢驗的標準差(SECV)

僅2—5%。另外，大豆、肉骨粉和小麥各100個樣本的分析標準用于確認分析NIRS氨基酸

的準確性。這些標準可以用于飼料廠內(nèi)的設(shè)備上，德固薩每年都用這些標準分析5000多個

原材料樣本。富有經(jīng)驗的專家建立的NIRS標準是一個使NIRS在飼料分析業(yè)廣泛使用的有

效方法，第一次使單一原材料對時間要求嚴格的質(zhì)量分析成為可能。

四、飼料中氨基酸分析的應用

(-)飼料配方的優(yōu)化

如今對家禽和豬所有日糧的配制都力求適應各物種對氨基酸的需要，以滿足最佳的生長

和飼料轉(zhuǎn)化率。為了達到這個目的，營養(yǎng)學家必須有其所用原材料的氨基酸組成的可靠數(shù)據(jù)。

如果可以得到NIR氨基酸標準，那么通過添加氨基酸可以使所有質(zhì)量波動得以校正。因為

這項技術(shù)操作復雜且消費較高，所以氨基酸的色譜分析通常不被飼料制造商所利用，但是他

們將在外部實驗室中對自己的飼料原材料進行分析，從而發(fā)展其中期基質(zhì)的數(shù)據(jù)。由國際組

織(CVB,2001；NRC,1998,2001)總結(jié)的許多原材料樣本的氨基酸濃度得到的更新數(shù)

據(jù)也很有幫助。Fickler等(2001)已經(jīng)編纂總結(jié)了120種原材料的有關(guān)氨基酸的15,000多

個文件，這些文件給出了原產(chǎn)國所提供的濃度以及講解變化的信息。作者已經(jīng)建立了多數(shù)原

材料的線性回歸方程，從而可以用于分析粗蛋白樣本中的氨基酸含量。

（-）可消化氨基酸的測定

專家?guī)啄昵熬烷_始以原材料的可消化氨基酸為基礎(chǔ)對配合飼料的配制提出建議，尤其是

受熱處理后富含蛋白質(zhì)的原材料，如豆粕和菜籽粕、肉骨粉、禽副產(chǎn)品粉以及羽毛粉。我們

必須在復雜的動物試驗中對每種物種進行獨立的試驗，通常需要去除腸道內(nèi)食糜。因為對所

測原材料的消化率系數(shù)的計算把日糧氨基酸濃度與食糜和糞中未吸收的氨基酸聯(lián)系起來，所

以提高分析的準確性和精確性就顯得非常重要。因為分析的是不同的基質(zhì)，所以用IEC和

柱后背三酮方法進行分析要優(yōu)于柱前衍生后的HPLC方法。

（H）對配合飼料質(zhì)量的檢測

許多國家要求必須對商業(yè)動物飼料中的氨基酸含量給予注明，且由官方氨基酸分析方法

進行監(jiān)督。但是對配合飼料和預混料中氨基酸組成的常規(guī)分析，即檢測日糧配方和產(chǎn)量，也

是質(zhì)量保證的一個必要工具。添加氨基酸結(jié)合入飼料的準確性和均勻性也具有重要的作用，

因為占據(jù)了總氨基酸含量的大部分比例，從而對動物生產(chǎn)性能的發(fā)揮具有重要的影響。這些

添加氨基酸的提取和分析的較好的重復性導致了混合試驗可以測定混合樣本中典型的十個

樣本的濃度和變異度（CV）（Poole,1991；Fontaine,2002）,幾年內(nèi)對分析方法的總結(jié)表

現(xiàn)出，大約五分之一飼料的方差高于10%,飼料中氨基酸的分布不具有足夠的均勻性。

五'結(jié)論

1.現(xiàn)在對飼料中氨基酸分析的重要性比以往任何時候都重要，因為目前所有配合飼料都需

要由添加氨基酸配制而成，而且對原材料中氨基酸含量的充分認識可以節(jié)省大量成本。

2.離子交換色譜（IEC）和柱后荀三酮衍生對氨基酸的分析因其高精確性和對基質(zhì)影響的耐

受性，而在最近幾年成為官方的標準方法。水解條件也已經(jīng)進行了標準化。這一經(jīng)典技術(shù)的

應用比柱前衍生后的高效液相色譜（HPLC）分析的所有方法都要普遍。

3.測定飼料中的色氨酸時，在堿水解后不進行衍生化，在反相（RP-）硅膠上用HPLC進行

分離，并特異地用熒光檢測進行度量。在自動取樣器內(nèi)用氫氧化鋼水解得到了最佳的還原率。

4.氨基酸制造商的客服實驗室建立的全球各種飼料原材料氨基酸分析的NIRS標準,及其在

飼料廠中首次轉(zhuǎn)化成的分光光度法，使得日糧配方不斷地適應目前原材料的批量生產(chǎn)。

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