中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)檢疫鑒定方法IdentificationandquarantineofMeloi國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)的檢疫鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品、土壤等傳帶的偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)。本標(biāo)準(zhǔn)使用的符號(hào)源于DeMan公式，并作了少部分修改；n—標(biāo)本數(shù)：L——體長(zhǎng)(mm或pm,頭端至尾端的中線距離，不包括尾尖突);a——體長(zhǎng)/最大體寬：c——體長(zhǎng)/尾長(zhǎng)(尾長(zhǎng)指肛門(mén)或泄殖腔口至尾端的長(zhǎng)度，不包括尾尖突);W——最大卵寬：St——口針長(zhǎng)度；Sp——交合刺長(zhǎng)度；h——透明尾的長(zhǎng)度；EP——排泄孔至體最前端的距離；VA——陰門(mén)至肛門(mén)的距離；VL——陰門(mén)寬度。3.1偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)的學(xué)名為MeloidogynefallaxKarssen,1996,異名為MeloidogymechiruondiB-typeKarssen,1995,英文名為Falsecolumbiaroot-knotnematode;隸屬于線蟲(chóng)門(mén)Nematoda,側(cè)尾腺鯛Secernentea,墊刃目Tylenchida,煦囊科Heteroderidae,根結(jié)線蟲(chóng)亞科Meloidogyninae,根結(jié)線蟲(chóng)屬M(fèi)rlaidogyar3.2偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)屬侵染寄主根部的固定內(nèi)寄生線蟲(chóng)，2齡幼蟲(chóng)可在土壤中生存一段時(shí)間，是惟一可遷移的侵染期蟲(chóng)態(tài)，雌蟲(chóng)是固定在植物很部或塊莖組織內(nèi)的侵染期蟲(chóng)態(tài)。因此，偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)可隨著染蟲(chóng)植物組織和土壤傳播擴(kuò)散，其形態(tài)特征、地理分布、寄主范圍、生物學(xué)特性、為害癥狀和傳播途徑等(參見(jiàn)附錄A)是檢疫鑒定的依據(jù)。4儀器及用具4.1樣品袋和標(biāo)簽。4.2貝爾曼漏斗分離器或淺盤(pán)，標(biāo)準(zhǔn)套篩(40目～500目)。4.3數(shù)字智能顯微鏡(含照相裝置、電腦和測(cè)微數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)軟件)、體視顯微鏡。4.4恒溫水浴鍋。4.6酒精燈、線蟲(chóng)挑針。4.7控溫電熱平板、大容量離心機(jī)。24.8普通冰箱和低溫冰箱(-4℃~-10℃,-20℃~-40℃,-70℃以下)。5試劑和材料5.1指甲油、石蠟。5.2線蟲(chóng)保存液(配方參見(jiàn)附錄B中的第B.1章)。5.3線蟲(chóng)脫水液(配方參見(jiàn)附錄B中的第B.2章)。5.4無(wú)水乙醇(純度96%以上)、70%的酒精、碳酸鈣，福爾馬林(4%甲醛溶液》、甘油、硫酸鎂、高峰土、次氯酸的溶液或漂白粉精片。6現(xiàn)場(chǎng)檢癥6.1核查和直觀檢驗(yàn)檢查受檢植物及其產(chǎn)品是否帶有根，塊莖，以及土壤或介質(zhì)土，是否是偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)的寄主等。根上是否有根結(jié)，塊莖上是否有疙瘩狀變異，如果是來(lái)自疫區(qū)的馬鈴薯，應(yīng)去皮檢查是否有腐爛或棕黑色變異等癥狀。6.2抽樣和取樣如果有為害癥狀的，抽取有為害癥狀的受檢物。如果無(wú)為害癥狀的，或土壤、介質(zhì)土等，則隨機(jī)抽樣。7實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)7.1獲取線蟲(chóng)的方法在體視顯微鏡下，將帶有癥狀的植物組織浸泡于盛有自來(lái)水的培養(yǎng)皿中，用小刀或挑針刺破根結(jié)或小疙瘩，檢查球狀蟲(chóng)體或卵塊是否存在，并輕輕從組織上剝離附著的雌蟲(chóng)蟲(chóng)體。將所獲取的雌蟲(chóng)和卵塊用吸管轉(zhuǎn)移至0.9%的氯化鈉水溶液中，將幼蟲(chóng)和雄蟲(chóng)移至蒸餾水中，待用。7.1.2分離法從未見(jiàn)癥狀的植物根或塊莖，土壤和介質(zhì)土分離2齡幼蟲(chóng)或雄蟲(chóng)，可采用貝爾曼漏斗法或淺盤(pán)法。7.2標(biāo)本制作線蟲(chóng)鑒定前，對(duì)雌蟲(chóng)蟲(chóng)體需進(jìn)行會(huì)陰花紋的切片處理，2齡幼蟲(chóng)、雄蟲(chóng)和會(huì)陰花紋的切片需制作臨時(shí)玻片或永久玻片(參見(jiàn)附錄C)。在顯微鏡下，對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)鑒定、測(cè)計(jì)和描述。7.3形態(tài)鑒定7.3.1測(cè)量值L-404am~720μm:BW-256gm~464gm;EP-12.6mm~32.9gm;VA19.0gm;VL=20.2μm~28.4μm;St=L=736μm~1520pm;a=21.2~53.5sc=82.7~202;St=18.9pm~20,9gm:Sp=22.L=381gm~435am:BW=13.3pm~16.4pm;T=46.1gm~55.6pmsh-12.2pm~15.8Sn=10,1mm~11.4L=89.7gm~104gm:W=34.1pm~44.2p(資料性附錄)偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)的生物學(xué)特性和生態(tài)學(xué)特征A.1生物學(xué)特性A.1.1蟲(chóng)口動(dòng)態(tài)偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)與哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)(Mefoidogywechirwwudi)非常相似，由于有關(guān)前者的資料較少，因此，將哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)的有關(guān)信息資料簡(jiǎn)述如下，以供參考。哥倫比重根結(jié)線蟲(chóng)相對(duì)于其他根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)來(lái)說(shuō)，可在相對(duì)較低的溫度下開(kāi)始侵染活動(dòng)；在適宜環(huán)境下.3周~4周可完成1代的發(fā)育，其發(fā)育積溫第1代和第2代分別是600～800和500～600攝氏度日時(shí)，其發(fā)育閥溫是5℃;偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)的生活史相對(duì)哥倫比重根結(jié)線蟲(chóng)的生活史要短，在荷蘭，前者1年可完成2代至3代的發(fā)育：2種線蟲(chóng)均以卵或幼蟲(chóng)越冬。A.1.2發(fā)育史在根結(jié)線蟲(chóng)中，雌蟲(chóng)的存在對(duì)于繁殖的作用尚不清楚。雌蟲(chóng)行孤雌生殖，在哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)和偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)同時(shí)存在的種群中，兩者的發(fā)育是獨(dú)立完成的，不存在種間交配現(xiàn)象。雌蟲(chóng)在寄主上取食，并產(chǎn)卵于幾丁質(zhì)包被中，卵塊突出于根(或莖)表皮下，或在組織中，例如：在馬齡薯塊莖內(nèi)10mm深處可發(fā)現(xiàn)卵塊的存在。A.1.2.2卵卵的解化并不依賴(lài)于寄主根部分泌物的刺激，而是對(duì)環(huán)境濕度作出迅速的反應(yīng)。在干燥環(huán)境下卵不能孵化，但是可在土壤或干枯的根中存在一段時(shí)期。當(dāng)濕度適宜時(shí)，即孵化。根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)共4齡，1齡幼蟲(chóng)在卵中完成發(fā)育，脫皮后，在土壤濕度適宜時(shí)，2齡幼蟲(chóng)從卵中孵化出來(lái)，如果土壤太干燥，幼蟲(chóng)處于體眠狀態(tài)。根結(jié)線蟲(chóng)容易隨著水流傳插擴(kuò)散，可在水中存活3周。2齡幼蟲(chóng)是惟一具有侵染力的活動(dòng)期蟲(chóng)態(tài)，侵染寄主植物的根部，可單個(gè)取食，也可群體取食。一旦發(fā)現(xiàn)適宜的寄主，通常在根冠上或附近取食，并建立固定的取食點(diǎn)，受侵染植物組織的韌皮部或薄壁組織細(xì)胞畸形發(fā)育成多核巨大細(xì)胞，在根尖上表現(xiàn)為圓形腫大(稱(chēng)為根結(jié)),幼蟲(chóng)繼續(xù)發(fā)育成膨大的雌蟲(chóng)。一旦受侵染的細(xì)胞不能發(fā)育成巨大細(xì)胞，幼蟲(chóng)或者離開(kāi)該侵入點(diǎn)，尋找新的侵入點(diǎn)，或者因饑餓而死亡。根結(jié)通常在幼蟲(chóng)成功侵入后的1d～2d內(nèi)形成，幼蟲(chóng)在取食過(guò)程中蟲(chóng)體逐步膨大成年輕雌蟲(chóng)，并繼續(xù)完成發(fā)育，根結(jié)也隨之增大。A.2生態(tài)學(xué)特征A.2.1地理分布A.2.2寄主范圍主要寄主有馬鈴薯(Swammtaberosrm),三葉草(Medicagosatiwu).胡蘿卜(Dayewsc(Betavulgaris),花生(Arachishypogaca)和番茄(Solanawlycoperaicum)(以上寄主是與哥倫比亞共同的寄主》。其他寄主包括；萱草屬(Hemerocallissp.)、荷包牡丹(Dicentraspectahilis),報(bào)春花(Oemotheraerythrospula)、鐘蕙花(Phacelia類(lèi)和雜草等。A.2.3為害癥狀根結(jié)線蟲(chóng)的為害直接影響到植物根部的生長(zhǎng)，植物產(chǎn)量和品質(zhì)。受害寄主地上部分在受害較輕時(shí)通常無(wú)癥狀表現(xiàn)，但是受害較重時(shí)，表現(xiàn)為：矮化，失活或缺水狀萎蔫。地下部分的典型癥狀為根結(jié)。通常，偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)侵染寄主上的根結(jié)相對(duì)于其他根結(jié)線蟲(chóng)侵染引起的根結(jié)要小，面且，根結(jié)上不再長(zhǎng)出次生根。在馬鈴薯上，通常在其表面形成小疙瘩。但是，在有些種類(lèi)的馬鈴薯表面上沒(méi)有明顯的癥狀，皮下組織卻腐爛或變成棕黑色(參見(jiàn)圖A.1)。圖A.1偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)的為害癥狀(引用自thttpr//.au/Regions/May07.pdf)A.2.4傳播途徑和擴(kuò)散方式隨著被感染的植株、土壤殘?jiān)推渌桓腥镜膫}(cāng)儲(chǔ)繁殖材