中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)雞馬立克氏病病毒分離與鑒定方法國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局和山東出入境檢驗(yàn)檢疫局負(fù)責(zé)起草。11范圍磷酸鹽緩沖液(PBS);含0.05%吐溫-20的PBS。以上溶液配制方法見(jiàn)附錄B。2.8標(biāo)準(zhǔn)MDV:MDVI型病毒GA毒株。挑選臨床發(fā)病的MD疑似病雞，無(wú)菌采集枸分層液，200g離心5min,分離收集淋巴細(xì)胞，并用無(wú)菌PBS洗滌兩次，用細(xì)胞維持液稀釋成107個(gè)/mL淋巴細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液直接使用或者加入15%的二甲基亞砜后保存在液氮(一196℃)中備用。取生長(zhǎng)良好的DEF單層，棄去維持液，接種0.2mL處理好在空白細(xì)胞對(duì)照瓶的細(xì)胞生長(zhǎng)良好的前提下，將產(chǎn)生廣泛CPE(蝕斑形成面積占30%以上)的DEF將收集的具有廣泛CPE的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行稀釋，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使每孔平均含有1個(gè)細(xì)同法重復(fù)克隆二至三次。所收集的培養(yǎng)物就是供鑒定用的MDV分離物。25.1電鏡觀察5.2蝕斑測(cè)定次(每次5min),再滴加MDV分型單克隆抗體，放入37℃的水浴中作用90min～120min,用PBS沖洗三次(每次5min),滴加抗鼠免疫熒光抗體，在37℃水浴中作用30min,用含0.05%吐溫-20的PBS沖用2000個(gè)蝕斑形成單位(PFU)的MDV分離物和2000個(gè)PFU的GA標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株分別接種一日齡易感雞20只～25只，同時(shí)設(shè)立相同數(shù)日的易感雞對(duì)照組。分別隔離飼養(yǎng)10周，觀察記錄死亡情況，6.1MDV在電子顯微鏡下表現(xiàn)為近似圓形或者六角形的病毒顆粒或者核衣殼，多數(shù)出現(xiàn)在感染的細(xì)6.2MDV病毒可以在DEF或者CEF單層上產(chǎn)生蝕斑，蝕斑大小一般在1mm之內(nèi)。血清I型產(chǎn)生3(規(guī)范性附錄)A.1將SPF鴨種蛋孵化至12d～14d(SPF種雞蛋孵化至9d～10d)。A.4通過(guò)雙層消毒紗布過(guò)濾細(xì)胞懸浮液，將濾液收集于滅菌離心管，以1000r/m試劑的制備B.1.1Hanks平衡鹽溶液的配制B.2細(xì)胞生長(zhǎng)液的配制5%水解乳蛋白溶液10.0mLHanks平衡鹽溶液9.5mL犢牛血清5.0mL青霉素1.0mL碳酸氫鈉[NaHCO?(7.5%)]1.0mLB.3細(xì)胞維持液的配制方法同細(xì)胞生長(zhǎng)液的配制，只需將犢牛血清含量調(diào)整為1mL～2mL即可。B.4.1所需試劑的準(zhǔn)備氯化鈉(NaCl)氯化鈣(CaCl?·2H?O)氯化鎂(MgCl?·2H?O)0.132g雙蒸水雙蒸水B.4.5分裝于500mL～1000mL滅菌瓶中，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)后貯存于4℃下備用。B.5含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液的配制B.5.1按照PBS配制方法，去掉其中的氯化鈣(CaCl?·2H?O)