多參數(shù)流式細胞儀

在白血病/淋巴瘤免疫分型的應用

1流式細胞術流式細胞術(FlowCytometry,FCM)

利用流式細胞儀對處在快速直線流動狀態(tài)中的單細胞或者生物微粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術。流式細胞儀（FlowCytometer)

集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。23FACS的工作原理4熒光補償5BeforeAfter6

設門（gating）是流式細胞儀分析中的一種重要技術，只有通過最佳的設門方式，才能準確地獲取和分析。

“設門”是指在細胞分布圖中，根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群。通過“設門”得到不同的區(qū)域（Region）。從而對其中的細胞進行單參數(shù)或多參數(shù)分析。

為什么進行設門？78正常BM各系細胞比率：淋巴：20-30%：T：70%，B：20%，NK：10%；單核：2-6%±；粒細胞：40-60%；有核紅：<50%FCM的主要測定指標：FSC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3（FL4）

FSC：反應細胞的大小。SSC：反應細胞內顆粒的多少。FCM設門法：

FSC/SSC：缺點：不能將淋巴、單核及幼稚細胞區(qū)分開

CD45/SSC：CD45是WBC抗原，RBC、Plt為陰性。

CD45在成熟細胞表達強，幼稚細胞表達弱，在淋巴、單核及粒細胞表達強度不同。優(yōu)點：能將淋巴、單核及幼稚細胞區(qū)分開。特異分析白血病細胞免疫表型

9討論內容FACS在血液病診斷中的應用FACS在白血病MRD檢測中的應用10骨髓細胞發(fā)育不同階段相應抗原的表達11骨髓細胞發(fā)育不同階段相應抗原的表達12骨髓細胞發(fā)育不同階段相應抗原的表達1314AML免疫表型分析理想的AL免疫分型方案應滿足以下幾點要求：①識別白血病細胞，能將其與正常細胞或反應性細胞相區(qū)別；②鑒別白血病細胞的系列來源；③根據(jù)細胞的分化程度對疾病進行亞型分型；④鑒別用于檢測MRD的白血病相關免疫表型（LAIP）；⑤幫助判斷某些特異分子改變，即基因型檢測；⑥提供預后相關及治療靶點的免疫標志檢測結果。15AML免疫表型分析16AML免疫表型分析1718初治急白分型AcuteLeukemia–BlastsPresent>20%MyeloidLineageCD13+and/orCD117+and/orCD33+CD7+and/orCD2+CD19+T-LineageB-LineageMyeloid,noorminimalmaturationCD34+/-CD117+/-HLADR+CD56+CD15-/+CD11b-,CD14-PromyeloidCD15+/-CD117+/-CD34-HLADR-CD11b-,CD14-CD14+CD4+/-HLADR+CD15+CD11b+Myelomonocytic&Monocytic紅系和巨核系的鑒定需要另外增加二線抗體。如:CD71、GPA、CD41、CD6119急性未分化白血?。ˋUL）急性未分化型白血病的主要特點：原始細胞沒有髓系分化的形態(tài)學特征，基本不表達任何已知系列的膜標志物。缺乏T或髓系的特異標志，如cCD3和MPO等；也不表達B系特異標志，如cCD22、CD79a或是CD19等。同時也不表達巨核細胞、漿細胞和DC的特異標志。只表達HLA-DR、CD34或CD38，TDT也是可陽性的。20急性髓系白血病微分化型從左圖CD45和SSC二維散點圖中，可以看出有兩群細胞，R1和R2，R2的CD45表達比淋巴弱，SSC也小。與單核細胞接近。通過分析可以得出：1、不表達CD5、CD7、CD10、CD19、CD14、CD36、GLyA。2、表達HLA-DR、CD13/CD33、CD34、CD33；3、弱表達CD38；由于CD33陽性強度大于CD13，CD34、HLA-DR、CD38陽性強度低，而髓過氧化物酶陽性，結合以上情況，提示這部分細胞屬于分化較差的髓系細胞。21急性髓系白血病未分化型22急性髓系白血病成熟型從左圖CD45和SSC二維散點圖中，可以看出有四群細胞，R1~R5，原始細胞R2的CD45表達比淋巴R1弱，SSC比淋巴細胞大。幼稚或成熟粒增加。通過分析原始細胞R2可以得出：1、不表達CD5、CD8、CD61、CD36、GLyA。2、表達HLA-DR、CD13/CD33、CD34、CD38、CD7；3、弱表達CD4；結合以上情況，符合急性髓系白血病成熟型。23急性髓系白血病成熟型24急性早幼粒白血病從左圖CD45和SSC二維散點圖中，可以看出有兩群細胞，R1和R2，通過分析原始細胞R2可以得出：1、不表達HLA-DR、CD34、CD14、CD36、GLyA。2、表達CD13/CD33、MPO、；3、增加二線抗體，可見CD11a、CD11b、CD18、CD64表達；而粒系標志CD15和CD65弱表達或不表達。結合以上情況，符合急性早幼粒白血病。25急性早幼粒白血病26急性粒單白血病從左圖CD45和SSC二維散點圖中，可以看出有三群細胞，R1~R3，通過分析原始細胞R2（92.1）可以得出：1、不表達CD61、CD36、GLyA。2、表達HLA-DR、CD34和CD14（部分表達）、CD38、CD13/CD33；3、弱表達CD4，CD33表達比CD13高。結合臨床情況，符合急性粒單白血病。27急性白血病從左圖CD45和SSC二維散點圖中，可以看出有三群細胞，R1~R3，通過分析原始細胞R2（92.1）可以得出：1、不表達CD61、CD36、GLyA。2、表達HLA-DR、CD34和CD14（部分表達）、CD38、CD13/CD33；3、弱表達CD4，CD33表達比CD13高。結合臨床情況，符合急性粒單白血病。28急性單核細胞白血病從左圖CD45和SSC二維散點圖中，可以看出R1為成熟淋巴細胞，R3為粒系，R4為紅系（CD36+、GLyA+）R5為原始細胞區(qū)域比例較低。而R2所占比例較大，通過分析得出：1、CD45表達較強，SSC較大，為單核系的特點。2、R2表達HLA-DR、CD4和CD14（部分表達）、CD36、CD38、CD13/CD33；3、不表達CD8，GLyA。結合臨床情況，符合急性單核細胞白血病。29急性單核細胞白血病30急性巨核細胞白血病從左圖CD45和SSC二維散點圖中，R4群的異常細胞有較大的SSC，并且CD45低。通過分析此類細胞得出：1、不表達CD3、CD5、CD7、CD10、CD14、CD19、CD38、CD79a、HLA-DR、MPO、CD15和CD64。2、R2表達CD42a和CD61、CD34、CD13/CD33；結合臨床情況，符合原始巨核細胞的免疫表型。31急性巨核細胞白血病32初治急淋分型AcuteLeukemia–BlastsPresent>20%CD7+and/orCD2+CD19+T-LineageB-LineageCommonThymocyteMatureThymocyteCD2+CD5+DualCD4+/CD8+sCD3-CD2+CD5+CD4+orCD8+sCD3+CD2-/+CD5-/+sCD3-CD4-CD8-TdT+CD10-clg-sig-Pre-BCD10+cig+TdT+sig-Bsig+CD10+/-clg+/-TdT-CommonTdT+CD10+clg-sig-EarlyThymocyteEarlyB-Precursor33B/髓系MPAL和T/髓系MPAL異常細胞的SSC較小，CD45弱表達，似有原淋的特點。此類細胞的免疫標志：1、表達cCD22、mCD22、CD19、CD13、CD33（部分表達）或者表達cCD3、CD5、CD7、CD20、等。2、弱表達CD15、MPO。3、不表達CD10、CD11c、CD14、CD42a、CD64等。34B原淋巴細胞白血病/淋巴瘤35B原淋巴細胞白血病/淋巴瘤36T原始淋巴細胞白血病/淋巴瘤37T原始淋巴細胞白血病/淋巴瘤38CLL/SLL和LPL39漿細胞淋巴瘤404142慢淋和B淋巴瘤分類CLLandNon-HodgkinsLymphomaNKLGLCD2+CD3+T-CellLineageCD38+CD2-,CD19-PlasmaCellLeukemia/MyelomaB-CellLineageCD19+ClonalIgCD16+and/orCD56+CD2+,CD3-CD5-CD10-CD10+FollicularCellOrBurkitt’sLymphomaSLVLorMarginalZoneLymphomaorHairyCellLeukemiaCD5+B-CLLorMantleCellLymphomaMCL：t(11;14)；NCCN要求對所有CLL患者檢測t(11;14)或CCND1表達43Burkitt淋巴瘤和濾泡淋巴瘤44評估慢性淋巴增殖性疾病(CLD)的抗體First:CD5、CD19、kappa、lamda

CD3、CD20、CD23、CD10、CD45B-cell：CD22、FMC7、CD11c、CD103、CD138CD38、CD25、CD79b(約12-15Ab)T-cell：CD4、CD7、CD8、CD2、CD56、CD16、

TCRα/β、TCRγ/δ特殊用途：

CD30、bcl-2、TdT、CD1a、CD34、CD71Total：約12-16個Ａb45CLLandNon-HodgkinsLymphomaNKLGLCD2+CD3+T-CellLineageCD38+CD2-,CD19-PlasmaCellLeukemia/MyelomaB-CellLineageCD19+ClonalIgCD16+and/orCD56+CD2+,CD3-CD4+T-CellCLLT-CellLymphomaT-PLLATLL(AdultT-CellLeukemia)T-CellLGLLCD8+CD7-SezarySyndrome慢淋和T淋巴瘤分類46FACS檢測漿細胞疾病八色FACS標記：CD38、CD138、CD45、CD19、CD56、cyIgkappa、cyIgLamda47多發(fā)性骨髓瘤（MM）

多發(fā)性骨髓瘤是漿細胞異常增生性疾病。正常漿細胞為CD38+/CD45dim/-，使用CD38/CD45雙標記檢測外周血和骨髓標本，可以準確劃定漿細胞群。通常使用CD38和CD45，結合輕鏈檢查，對多發(fā)性骨髓瘤細胞進行分析。另外，正常漿細胞的表面標記為CD19+/CD56-，而多發(fā)性骨髓瘤細胞通常為CD19-/CD56+。CD138目前認為是漿細胞最特異的指標。這樣，使用流式細胞儀對外周血或骨髓標本進行多參數(shù)分析，并計算異常漿細胞含量，對于多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療評估具有重要意義。

48495051

FITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7APCAPC-H7V450V5001cCD3cMPOcCD79aCD34CD117CD19CD7CD452CD64CD33HLA-DRCD13CD11bCD14CD15CD453CD61GlyACD123CD11cCD71CD36CD38CD454CD2CD1aCD5CD4CD56CD8CD3CD455CD58CD22CD9CD10cTdTCD20cIgMCD456kappalamdaCD19

CD45急性白血病模板52皮膚淋巴瘤模板

FITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7APCAPC-H7V450V5001cCD3cMPOcCD79aCD34CD117CD14CD19CD452CD5TCRabCD8CD25TCRgdCD4CD2CD33CD45RACD45ROHLA-DRCD4CD7

CD34CD26CD30CCR4CXCR3CCR6CD4CD7CD353