經(jīng)穴注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合中藥對糖尿病大鼠下肢血流的影響

下肢缺血性疾病主要由下肢動脈阻塞、血栓閉塞性脈管炎和糖尿病引起。與股淺動脈、腓動脈、脛骨前動脈和脛骨后動脈一樣，也有鎮(zhèn)靜、疼痛、感染、四肢壞死等疾病，最后約1.3名患者需要四肢骨折。臨床常用血管搭橋術(shù)、球囊擴(kuò)張術(shù)、支架植入術(shù)、動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)等手術(shù)方法進(jìn)行治療,但術(shù)后早期容易并發(fā)血栓形成,后期血管再度狹窄。而保守治療效果不佳,給患者身心造成很大痛苦。近年來研究表明,目前主要是骨髓單個核細(xì)胞(bonemarrowmononuclearcell,BMNC)和自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)移植,可定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)“血管生成”及“血管新生”,進(jìn)而改善缺血肢體血液循環(huán)。董建勛教授在傳統(tǒng)移植方法的基礎(chǔ)上不斷探索創(chuàng)新,率先在國內(nèi)開展了辨證循經(jīng)注射BMNC的方法,探索性治療慢性下肢缺血性疾病42例,取得了較為滿意的療效。但是,對于循經(jīng)穴位注射BMSCs、肌肉注射BMSCs,以及聯(lián)合與單用益氣活血中藥這幾種方法哪個更有效以及經(jīng)穴注射BMSCs治療作用機(jī)制仍不清楚。為了比較這幾種治療方法的效應(yīng)差異,本研究采用經(jīng)穴、肌肉注射BMSCs、聯(lián)合以及單用益氣活血中藥的干預(yù)方法,監(jiān)測了各種方法干預(yù)DM大鼠缺血后肢血流灌注量和皮膚溫度的變化并分析了其機(jī)制,現(xiàn)報道如下。材料表面1.藥物、藥品和儀器80只體質(zhì)量為200-220gSPF級雄性SD大鼠,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2012-0001,并隨機(jī)分為8組,每組10只。1×PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物有限公司),鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),100μL微量注射器(高鴿牌,中國),PeriScanPIM型激光多普勒血流成像儀(瑞典PERIMEDABCO.)。益氣活血方藥物組成:生黃芪120g,黨參120g,炙甘草48g,當(dāng)歸120g,雞血藤120g,川牛膝48g等。飲片由北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供,符合1995年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定,并由北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室煎制。以上復(fù)方以大火煎開,文火水煎2次過濾去渣,合并水煎液后在中藥液體包裝機(jī)中濃縮成含生藥1.5kg/L溶液作為灌胃濃度(相當(dāng)于患者臨床正常用藥劑量的18倍)。4℃冰箱保存?zhèn)溆?。方?.造模前后股動脈并傳統(tǒng)采血模型的制備80只雄性SD大鼠,經(jīng)普食水適應(yīng)喂養(yǎng)1周后編號,信封隨機(jī)抽取70只按50mg/kg劑量空腹腹腔注射STZ以制備糖尿病模型。于造模后3、7、14、28d尾靜脈采血針取血檢測隨機(jī)血糖濃度,以血糖值>16.0mmol/L作為糖尿病模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)。造模前,大鼠經(jīng)常規(guī)備皮、消毒、鋪巾,經(jīng)左側(cè)腹股溝韌帶中點(摸到股動脈搏動后)做1個1-1.5cm的縱行皮膚切口暴露股動脈。正常假手術(shù)組與DM大鼠假手術(shù)組:游離股動脈,不行結(jié)扎切除動脈術(shù),直接縫合切口。DM缺血模型:大鼠左側(cè)后肢缺血模型。游離股動脈后,用1號線結(jié)扎近端、遠(yuǎn)端股動脈和部分遠(yuǎn)端隱動脈,切除動脈和所有側(cè)支血管。術(shù)畢,5-0縫合線縫合皮膚,建立糖尿病大鼠左側(cè)后肢缺血模型。2.實驗方法及儀器正常假手術(shù)組(正常血糖假手術(shù)組)、DM假手術(shù)組(糖尿病大鼠假手術(shù)組)、DM缺血組(糖尿病大鼠缺血組):予局部注射1×PBS+蒸餾水灌胃;中藥組:缺血局部注射1×PBS+益氣活血中藥灌胃;局部注射組:缺血局部注射BMSCs+蒸餾水灌胃;局部+中藥組:缺血局部注射BMSCs+益氣活血方灌胃;穴位注射組:穴位注射BMSCs+蒸餾水灌胃;穴位+中藥組:穴位注射BMSCs+益氣活血方灌胃;采用全骨髓貼壁法獲取并傳代培養(yǎng)的第3代BMSCs,經(jīng)流式細(xì)胞分析合格,用于本實驗。局部注射取缺血組織與正常組織交界處等距離選取5個點為注射部位,穴位注射取穴如下:足太陰脾經(jīng)三陰交:后肢內(nèi)踝尖直上10mm處;足少陰腎經(jīng)照海:后肢內(nèi)踝下1cm;足少陽膽經(jīng)環(huán)跳:后肢髖關(guān)節(jié)后上緣;足少陽膽經(jīng)陽陵泉:后三里上外側(cè)5mm處;足陽明胃經(jīng)后三里:膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下約5mm處;每只大鼠共注射100μL濃度為1×107/mLBMSCs,每處注射20μL。中藥濃度與劑量:1.5kg/L濃度中藥與灌蒸餾水灌胃劑量根據(jù)大鼠體重以10mL/kg進(jìn)行換算,于術(shù)后第2天起連續(xù)灌胃7d。使用PeriScanPIM型激光多普勒血流成像儀,激光波長為670nm。本儀器采用NR掃描模式,觀察掃描面積寬10cm×10cm,掃描高度12-14cm,應(yīng)用LDPI2.5圖像軟件,進(jìn)行后肢體表血流圖的記錄、分析、處理。實驗室室溫保持在23-25℃之間。激光多普勒血流成像儀(LDPI)其輸出結(jié)果以相對流量單位PU(灌注量)值表示,采用PU指數(shù)(PUI)=術(shù)側(cè)PU/健側(cè)PU,來表示術(shù)側(cè)微循環(huán)的血流情況,PUI越大微循環(huán)缺血程度越低,側(cè)支循環(huán)建立越好。本研究于術(shù)后2、7、14、21d在北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心檢測激光多譜勒血流流速及血流散斑圖。實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析,計量資料用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),兩兩比較采用LSD檢驗,用ue0af±s表示,交互作用分析采用方差分析,以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。造模情況分析70只糖尿病大鼠造模1個月后,大鼠血糖維持在16.0mmol/L以上者61只,DM模型成模率為87.14%,成模率高,成模穩(wěn)定。在行大鼠左后肢缺血模型制備術(shù)后,DM大鼠左后肢缺血模型存活率為88.52%,每組大鼠造模情況見表1。經(jīng)檢驗,各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布,方差齊,可以進(jìn)行比較。2.1穴位注射對pui術(shù)后第7天pui的影響經(jīng)t檢驗,術(shù)后各組大鼠第7、14、21天PUI與第2天PUI組內(nèi)比較,結(jié)果如下:正常血糖假手術(shù)組第7天PUI較第2天略有降低(P<0.05),穴位注射組、穴位+中藥組PUI于術(shù)后第7天略有升高(P<0.05);DM缺血組、中藥組、局部+中藥組、穴位注射組、穴位+中藥組PUI術(shù)后第14、21天大幅升高(P<0.05),且穴位+中藥組PUI術(shù)后21d顯著升高(P<0.01)。見表2,圖1。2.2各組pui差值比較術(shù)后第7天與第2天PUI差值組間的比較:與正常假手術(shù)組、DM假手術(shù)組比較,局部注射組、穴位注射組、穴位+中藥組的差值增加明顯(P<0.05);與中藥組比較,穴位注射組、穴位+中藥組差值增加明顯(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。術(shù)后第14天與第2天PUI差值組間的比較:與正常假手術(shù)組比較,DM缺血組、中藥組、局部+中藥組、穴位注射組、穴位+中藥組差值增加明顯(P<0.05);與DM假手術(shù)組比較,穴位+中藥組差值明顯增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。術(shù)后第21天與第2天PUI差值組間比較:與正常假手術(shù)組、DM假手術(shù)組比較,局部+中藥組、穴位注射組、穴位+中藥組差值增加明顯(P<0.05),與DM假手術(shù)組比較,DM缺血組、中藥組差值增加明顯(P<0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。3.穴位注射的單獨效應(yīng)與雙方差分析見表4。當(dāng)不用中藥時,局部注射的單獨效應(yīng)為2.7;當(dāng)用中藥時,局部注射的單獨效應(yīng)為1.5。經(jīng)方差分析,兩種干預(yù)方法的交互效應(yīng)F=0.01,P>0.05,兩者不存在交互效應(yīng)。當(dāng)不用中藥時,穴位注射的單獨效應(yīng)為-11.8;用中藥時,穴位注射的單獨效應(yīng)為-9.2,經(jīng)方差分析,兩種干預(yù)方法的交互效應(yīng)F=0.008,P>0.05,兩者不存在交互效應(yīng)。辨證循經(jīng)注射bmscs聯(lián)合中藥的方法及療效評價下肢缺血性疾病主要包括血栓閉塞性脈管炎、肢體動脈硬化閉塞癥、糖尿病周圍血管病變等,屬于中醫(yī)“脫疽”范疇,屬周圍血管疾病中難治性疾病。糖尿病經(jīng)常合并下肢動脈血管病變又稱糖尿病周圍血管病變(peripheralvasculardisease,PVD)是引起下肢缺血,最終導(dǎo)致截肢的主要原因。其發(fā)病率與非糖尿病者相比要高出20倍,嚴(yán)重的PVD患者除面臨下肢截肢的危險,其死亡風(fēng)險也增加了4-7倍。當(dāng)前治療DM下肢缺血性疾病的主要方法有:祛聚、溶栓、擴(kuò)張血管、中醫(yī)中藥等,然而,這些方法主要用于病變早期、輕度的患者及無法行血管重建的患者,且多數(shù)效果不甚理想。臨床將BMSCs移植到缺血的肢體可在局部形成血管內(nèi)皮細(xì)胞,產(chǎn)生新生血管,但臨床患者存在缺血部位廣泛、BMSCs容積、濃度等原因?qū)MSCs的分化及療效產(chǎn)生不利影響。董建勛教授在原有3種骨髓干細(xì)胞移植的方法(局部肌肉注射、靜脈注射與動脈注射)基礎(chǔ)之上不斷探索、創(chuàng)新,提出辨證循經(jīng)注射BMSCs聯(lián)合中藥以提高BMSCs存活率、分化能力,以及療效的觀點。本研究實驗結(jié)果亦證實了該觀點,經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合益氣活血中藥干預(yù)糖尿病后肢缺血大鼠21d后,PUI達(dá)(88.80±10.44)%,使用經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合中藥的方法,大鼠缺血后肢血流灌注恢復(fù)速度快,與經(jīng)穴注射BMSCs、局部注射BMSCs、局部注射BMSCs聯(lián)合中藥、單用中藥的方法相比,能顯著改善缺血大鼠后肢的血流量灌注,即經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合益氣活血中藥的方法要明顯好于其他干預(yù)方法,但是益氣活血方中藥與經(jīng)穴注射BMSCs沒有明顯交互作用,需要進(jìn)一步研究探討。中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為,氣與血的關(guān)系還可以概括為“氣為血之帥”“血為氣之母”?！堆C論·陰陽水火血氣論》說:“守氣者,即是血”,氣能生血、行血、攝血。諸多研究證明,益氣或活血方對改善微循環(huán)有促進(jìn)作用,但目前研究多為單一活血方或益氣方,益氣活血方對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用研究較少。氣有溫煦的作用,血有濡養(yǎng)的功能,四肢百骸、五臟六腑皆賴氣血以濡養(yǎng),氣能行血,血能載氣,血流灌注得以改善。另外,辨證選取足太陰脾經(jīng)、足陽明胃經(jīng)、足少陰腎經(jīng)、足少陽膽經(jīng)進(jìn)行循經(jīng)注射BMSCs。通過對穴位的刺激,一取其可以調(diào)暢經(jīng)絡(luò)之氣血;二可以濡養(yǎng)三陰、三陽之經(jīng)脈;三可以滋養(yǎng)神經(jīng)肌肉組織;四可以通過對軀體傷害性傳入的抑制效應(yīng)達(dá)到鎮(zhèn)痛作用。董建勛教授認(rèn)為BMNC來源于骨髓血,屬于人體“陰中之陽”,具有生發(fā)、溫煦、推動等作用。辨證循經(jīng)注射BMNC,可以更好地發(fā)揮促進(jìn)血管再生,提高BMSCs存活率,以濡養(yǎng)經(jīng)脈,從而起到使缺血肢體