文獻(xiàn)解讀：熒光原位雜交（FISH）熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)基于與任何DNA雜交方法相同的原理，該方法利用單鏈DNA與互補(bǔ)DNA退火的能力。在FISH的情況下，靶DNA可以是中期染色體、間期細(xì)胞核或組織切片，附著在玻璃顯微鏡載玻片上。FISH的出現(xiàn)代表了細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域的重要一步，現(xiàn)已被廣泛用于研究和診斷。FISH相對于其他原位雜交方法（放射性或免疫細(xì)胞化學(xué)）的優(yōu)勢主要是由于顯著提高了速度和空間分辨率。除此之外，標(biāo)記的探針是穩(wěn)定的，可以長期儲存，并且不再需要中期染色體上非特異性信號的統(tǒng)計分析[1]。一．熒光原位雜交的關(guān)鍵步驟1.變性寡核苷酸引物（DOP）-PCR法合成DNA探針該方法主要用于大基因組區(qū)域的擴(kuò)增和標(biāo)記，以生產(chǎn)全染色體涂料（WCP）或部分染色體涂料（PCP）。模板通常是流動分選的染色體或染色體微區(qū)。該技術(shù)包括兩輪不同的PCR：第一輪允許擴(kuò)增染色體DNA，而第二輪允許摻入標(biāo)記的核苷酸。第一輪PCR（擴(kuò)增）：在0.5mL無菌離心管中，混合10×DOP-PCR緩沖液、核苷酸混合物（dATP、dCTP和dGTP）、dTTP（2mM），DOPPCR引物（20μM）、TaqSupreme聚合酶（2.5個單位）、500條染色體或染色體片段（通常重懸于2μL中），和DNase游離ddH2O，最終體積為100μL。PCR設(shè)置：在94°C下進(jìn)行9分鐘的初始變性步驟，然后進(jìn)行30個循環(huán)（在94°C下1min，在62°C下1.5min，在68°C下進(jìn)行8min），最后將溫度保持在4°C。使用凝膠電泳（1%瓊脂糖凝膠）以檢查DNA擴(kuò)增是否發(fā)生。第二輪PCR（標(biāo)記）：在5mL無菌離心管中，混合10×DOP-PCR緩沖液、核苷酸混合物（dATP、dCTP和dGTP各2mM）、dTTP（2mM），無DNA酶dd-H2O，最終體積為100μL。PCR程序設(shè)置于（2）相同。標(biāo)記的PCR產(chǎn)物的大小應(yīng)通過1%瓊脂糖凝膠上的電泳檢查（DNA片段的預(yù)期大小應(yīng)為200–600bp）。理想情況下，獲得的標(biāo)記DNA的平均產(chǎn)量應(yīng)約為20–50ng/μL。標(biāo)記的PCR產(chǎn)物在使用前應(yīng)儲存在?20°C下。熒光原位雜交將12μL變性雜交混合物（包含與雜交緩沖液混合的探針）滴在每張載玻片上。蓋上22×22mm的蓋玻片（避免氣泡），并用橡膠溶液密封蓋玻片。將載玻片放置在潮濕的室內(nèi)，并使其在42°C的水浴中漂浮過夜，或放置在42°C的培養(yǎng)箱中。輕輕地取出橡膠溶液，避免蓋玻片移動，這可能會導(dǎo)致染色體和細(xì)胞核受損。在搖晃的平臺上，用裝有2×SSC的Coplin罐清洗載玻片5min，以去除覆蓋物。為了去除未結(jié)合或非特異性結(jié)合的探針片段，將在嚴(yán)格的條件下清洗載玻片。將載玻片放入裝有0.4×SSC的預(yù)熱Coplin罐中，在70°C下放置5分鐘。將載玻片在含有2×SSC的Coplin罐中于室溫下在搖動平臺上轉(zhuǎn)移5分鐘。FISH中常用的熒光染料[2]熒光染料吸收（nm）發(fā)射（nm）顏色DAPI350456藍(lán)色FITC490520黃色/綠色Rhodamine550575紅色Cy3554568紅色Cy3.5581588紅色Cy5652672遠(yuǎn)紅外TexasRed595615深紅色熒光原位雜交（FISH）技術(shù)的發(fā)展[3]3.1Tyr-FISH：信號放大技術(shù)是使用過氧化物酶偶聯(lián)抗體作為信號檢測的第一層，然后使用熒光染料標(biāo)記的酰胺作為過氧化物酶底物，在原位結(jié)合過氧化物酶附近生成并沉積許多熒光染料。使用該信號方法系統(tǒng)，F(xiàn)ISH的靈敏度可提高10-100倍。然而，任何信號放大系統(tǒng)也有可能顯著增強(qiáng)背景信號，需要不斷調(diào)整達(dá)到最佳的信噪比[4]。3.2使用光學(xué)切片顯微鏡的三維FISH：減數(shù)分裂細(xì)胞被輕輕固定在旨在保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)的緩沖液中。然后花粉母細(xì)胞從固定的花藥中輕輕擠出，并嵌入光學(xué)透明的聚丙烯酰胺中進(jìn)行染色和成像。FISH圖像的堆疊被拍攝并組合成一個單一的三維圖像。攜帶FISH信號的個體染色體可以被追蹤和計算拉直。該技術(shù)可以很好地保存染色體結(jié)構(gòu)，因此該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以精確定位細(xì)胞核內(nèi)染色體上的DNA探針。三維FISH系統(tǒng)在定位染色體上的DNA探針方面沒有主要優(yōu)勢，但由于其溫和的固定過程有利于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的保存，在研究細(xì)胞核內(nèi)DNA序列的空間組織和免疫分析中檢測蛋白質(zhì)方面是有價值的[5]。3.3超延伸染色體上的FISH：在有絲分裂中期，經(jīng)過溫和的蛋白酶K消化后，在流動分選的植物染色體可以被拉伸到原來大小的100倍以上。拉伸染色體上的FISH顯示比未經(jīng)處理的對照更亮的信號，這可能是由于探針更容易接近拉伸的染色質(zhì)。超延伸中期染色體上的FISH圖譜分辨率高達(dá)70kb，與減數(shù)分裂粗線染色體的分辨率相似[6]。3.4FISH作為染色體鑒定的工具：許多重復(fù)的DNA元件在單個染色體上產(chǎn)生特定的FISH信號模式。如來自單個重復(fù)DNA探針的FISH信號不能提供足夠的信息來區(qū)分每條染色體，則可以標(biāo)記兩個或多個重復(fù)DNA探針的組合以增加分辨率。例如，來自兩個重復(fù)DNA探針的FISH信號允許鑒定六倍體小麥的所有21條染色體。使用重復(fù)DNA探針的一個潛在缺點(diǎn)是FISH信號模式在不同品種和材料之間的多態(tài)性，特別是對于開放授粉的植物物種[7]。作為基于重復(fù)序列的FISH探針的替代方案，染色體特異性細(xì)胞遺傳學(xué)DNA標(biāo)記（CSCDM）可以使用大插入基因組DNA克隆（如BACs）來開發(fā)單個染色體?？梢蚤_發(fā)一組CSCDM來產(chǎn)生獨(dú)特的FISH信號模式，允許識別所有染色體。Kim等[8]人使用一組22個BAC基因克隆同時鑒定所有10條高粱染色體。BACs可以通過DNA標(biāo)記在遺傳連鎖群上進(jìn)行分離。因此，通過CSCDM鑒定的染色體可以與遺傳連鎖群整合。3.5基于FISH的核型和系統(tǒng)發(fā)育分析：基于FISH的染色體鑒定系統(tǒng)可用于核型分析。例如：幾個重復(fù)的DNA探針在小麥及其相關(guān)物種的染色體上產(chǎn)生特定的雜交模式。來自這些探針的FISH信號模式為每個物種產(chǎn)生了獨(dú)特而穩(wěn)定的FISH核型[8]。卡梅德生物（KMDBioscience）(/)積累了豐富的熒光原位雜交技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗，搭建了完備的FISH技術(shù)服務(wù)平臺，我們能夠提供包括從探針設(shè)計、樣本處理、雜交檢測、基因表達(dá)研究到數(shù)據(jù)分析等一站式FISH技術(shù)服務(wù)。參考文獻(xiàn)：[1]Christine,E,Fuller,etal.FluorescenceInSituHybridization(FISH)inDiagnosticandInvestigativeNeuropathology[J].BrainPathology,2006.DOI:10.1111/j.1750-3639.2002.tb00424.x.[2]PernthalerA,PernthalerJ,AmannR.FluorescenceInSituHybridizationandCatalyzedReporterDepositionfortheIdentificationofMarineBacteria[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2002.DOI:10.1007/s10800-010-0082-1.[3]JiangJ,GillBS.Currentstatusandthefutureoffluorescenceinsituhybridization(FISH)inplantgenomeresearch[J].Genome,2006,49(9):1057-1068.[4]SpeicherMR,BallardSG,WardDC.Karyotypinghumanchromosomesbycombinatorialmulti-fluorFISH[J].NatureGenetics,1996.DOI:10.1038/ng0496-368.[5]RenchengYU,XianghaiT,QingchunZ,etal.Applicationoffluorescenceinsituhybridization(FISH)methodtodetect"tamarense/catenellaspeciescomplex"("TemperateAsian"ribotype)inGenusAlexandriumalongChinesecoast[J].ActaScientiaeCircumstantiae,2006.[6]NatarajanAT.Fluorescenceinsituhybridization(FISH)ingenetictoxicology.[J].Cheminform,2010,33(41):291-291.[7]SzelesA.Fluorescenceinsituhybridization(FISH)inthemolecularcytogeneticsofcancer[J].ActaMicrobiologicaetImmunologicaHungarica,2002,49(1):69-80.[8]WeiHJ,SuTH,ChienCL