rh缺失型d--個(gè)體及其家系成員rh和rhce基因序列變異分析

rh血型是最復(fù)雜的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)，具有高度多態(tài)性。它的臨床意義僅次于abo血型。Rh缺失型D--是Rh血型系統(tǒng)中極為罕見(jiàn)的變異體,血清學(xué)表現(xiàn)為D抗原增強(qiáng)及C、c、E、e抗原的缺失。Rh缺失型D--個(gè)體,通過(guò)輸血或妊娠,通常會(huì)產(chǎn)生針對(duì)Rh高頻率抗原的抗體,造成輸血前配血極為困難,且再次妊娠時(shí)極易引起嚴(yán)重的新生兒溶血病(Hemolyticdiseaseofnewborn,HDN)。我們?cè)跒?名產(chǎn)婦進(jìn)行交叉配血時(shí)發(fā)現(xiàn),其血清學(xué)表現(xiàn)為C、c、E、e抗原皆缺失,表現(xiàn)為Rh缺失型D--。為了解該個(gè)體出現(xiàn)Rh缺失型D--的原因,本文對(duì)其及其家系成員進(jìn)行了RHD及RHCE基因分型及遺傳背景分析,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1.數(shù)據(jù)和方法1.1新生兒溶血病產(chǎn)婦,女,33歲,有輸血史及妊娠史(孕3胎產(chǎn)3胎,1999年產(chǎn)第1胎,健康成活;2000年產(chǎn)第2胎,未能成活),已產(chǎn)男嬰1名(系第3胎)。產(chǎn)后發(fā)現(xiàn)小兒全身皮膚黃疸,呈進(jìn)行性加重,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查,紅細(xì)胞計(jì)數(shù):1.13×1012個(gè)/L;Hb:54g/L;網(wǎng)織紅細(xì)胞比值:0.33;有核紅細(xì)胞:140個(gè)/100個(gè)白細(xì)胞;血清總膽紅素:266.25μmol/L。臨床初步診斷為新生兒溶血病。產(chǎn)婦因產(chǎn)后大出血,需輸血。為查明新生兒溶血病產(chǎn)生的原因及為產(chǎn)婦提供相配的血液輸注,醫(yī)院將產(chǎn)婦及其患兒標(biāo)本送本單位作進(jìn)一步檢查及交叉配血。標(biāo)本送達(dá)本單位時(shí),患兒已因病情過(guò)重而死亡。前期已完成對(duì)其家系Rh血型血清學(xué)的調(diào)查,見(jiàn)圖1。1.2主試劑基因組DNA提取試劑盒(磁珠法)和PCR-SSPCDE檢測(cè)試劑盒均由德國(guó)Inno-train公司提供。1.3缺失型d--個(gè)體/家系成員edta出現(xiàn)型的檢測(cè)使用基因組DNA提取試劑盒,從Rh缺失型D--個(gè)體及其家系成員EDTA抗凝全血中提取基因組DNA,用蒸餾水將濃度調(diào)節(jié)至約50ng/μl。1.4pcr反應(yīng)體系及條件采用PCR-SSPCDE檢測(cè)試劑盒分別對(duì)Rh缺失型D--個(gè)體及其家系成員RHD基因第1、2、3、4、5、6、7、9、10外顯子及RHCE基因特征性片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物及檢測(cè)基因見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為:雙蒸水6μl,引物混合物3μl,Taq酶0.08μl(0.4U),DNA1μl。反應(yīng)條件為:94℃2min,1個(gè)循環(huán);94℃20s,70℃60s,5個(gè)循環(huán);94℃20s,65℃60s,72℃45s,10個(gè)循環(huán);94℃20s,61℃50s,72℃45s,20個(gè)循環(huán);72℃5min,1個(gè)循環(huán);10℃保存產(chǎn)物。取10μlPCR產(chǎn)物,直接點(diǎn)樣于含0.7μg/mlEtBr的2%瓊脂糖凝膠中,電泳(8~10V/cm)20min,在凝膠成像系統(tǒng)中的紫外光下拍照記錄。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)均含434bp的內(nèi)對(duì)照物,電泳后所有陰性反應(yīng)管應(yīng)出現(xiàn)該對(duì)照帶。2.rhce基因檢測(cè)先證者及其家系成員PCR結(jié)果與血清學(xué)表型基本相符。先證者RHD基因未見(jiàn)異常,未檢出RHCE基因的特異性序列,其他家系成員均有正常表型及RHCE基因PCR產(chǎn)物,見(jiàn)圖2、圖3及表2。3.rh缺失型Rh血型基因位于人類1號(hào)染色體短臂上,由緊密連鎖的RHD基因與RHCE基因串聯(lián)排列組成。RHD基因編碼RHD抗原,RHCE基因編碼C,c,E,e抗原。兩基因具有高度同源性,二者的外顯子與內(nèi)含子有93.8%的同源性。RHD基因和RHCE基因尾對(duì)尾排列(5′RHD3′-3′RHCE5′),二者之間會(huì)出現(xiàn)基因片段的置換重排,形成極為復(fù)雜的Rh血型多態(tài)性。首例D--表型是由Race等發(fā)現(xiàn)的,其個(gè)體紅細(xì)胞上有D表達(dá),但無(wú)C、c、E、e,猜測(cè)是D--純合子。Rh缺失型D--的RHCE基因結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,包括RHD與RHCE基因之間的互換和重組、外顯子重排、缺失、交換、插入和基因的位點(diǎn)突變等;Rh抗原的表達(dá)還與Rh相關(guān)糖蛋白(RHAG)密切相關(guān),這些糖蛋白出現(xiàn)異常,對(duì)Rh抗原均有影響,甚至導(dǎo)致Rh抗原的缺失或不表達(dá)。國(guó)外對(duì)Rh缺失型D--產(chǎn)生的機(jī)制報(bào)道較多。在1個(gè)法國(guó)Rh缺失型D--獻(xiàn)血者和2個(gè)美國(guó)印第安家系中的Rh缺失型D--個(gè)體中,具有完整的RHD基因和RHCE基因,其RHCE基因可能發(fā)生了剪并。在冰島、英國(guó)和意大利發(fā)現(xiàn)的Rh缺失型D--個(gè)體中,只有外顯子1和10是RHCE的,其余皆被RHD取代。對(duì)另外2例意大利Rh缺失型D--個(gè)體的研究發(fā)現(xiàn),有兩種雜交基因,一種是RHCE-D-CE-D,其中只有外顯子1和9是RHCE提供的;另一種是RHD-CE,其中只有外顯子10是RHCE提供的。對(duì)一個(gè)同一家系中2名有Dc-表型的中國(guó)家庭6名成員進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),該2名Dc-個(gè)體均具有Dc-和D-基因,其中發(fā)生RHD與RHCE基因之間的互換和重組,形成RHD(1-9)/RHCE(10)和RHCE(1-3)、RHD(4-10)。國(guó)內(nèi)對(duì)D--產(chǎn)生機(jī)制的研究報(bào)道較少。楊麗艷等報(bào)道的1例D--,先證者的Rh基因分型結(jié)果為CCDee,表明其RHCE并非完全缺失。李碧娟等報(bào)道的2例D--,1例為第5外顯子第22位核苷酸缺失,48與90位發(fā)生突變,另1例為第5外顯子第89位發(fā)生突變。張靜蕊等報(bào)道的兩例D--,1例檢出e基因,另1例檢出C、c、e基因,認(rèn)為是RHD與RHCE基因發(fā)生重排造成的。鄭月明等報(bào)道的1例D--,認(rèn)為是先證者父母均有CE基因的部分缺失,遺傳所致。PCR-SSP作為一種特異性的DNA序列多態(tài)性分析技術(shù),具有費(fèi)用較低、操作簡(jiǎn)便和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是目前國(guó)外最常用的RHCE基因分型方法。孫志剛等用PCR-SSP對(duì)400例個(gè)體進(jìn)行RHCE基因型的檢測(cè),得到了與血清學(xué)分型完全一致的結(jié)果,認(rèn)為亞洲黃種人RHCE基因的遺傳背景比較單純,雜合基因產(chǎn)生的概率較小,RHCE基因的突變相對(duì)較少,因此使用PCR-SSP對(duì)亞洲人進(jìn)行RHCE基因分型,結(jié)果可靠,重復(fù)性好。本例應(yīng)用PCR-SSP對(duì)先證者及其家系成員RHD、RHCE基因進(jìn)行分型,結(jié)果顯示先證者家系成員PCR結(jié)果與血清學(xué)表型基本相符,對(duì)其RHD基因9個(gè)外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,顯示為正常的RHD基因,未見(jiàn)RHCE基因片段的插入和互換。而RHCE基因特異性序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析顯示,無(wú)RHCE基因特異性序列,因此該先證者的RHCE基因極有可能大部分或全部缺失。其他家系成員均有正常表型及RHCE基因PCR產(chǎn)物。在PCR產(chǎn)物分析時(shí),先證者母親出現(xiàn)Dpsi、cw條帶、其兄出現(xiàn)Dpsi條帶,結(jié)合其家系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),與先證者及其姐妹的PCR產(chǎn)物結(jié)果有矛盾,無(wú)法從遺傳學(xué)角度去解釋,因此考慮為PCR假陽(yáng)性結(jié)果,分析時(shí)不予考慮。Rh缺失型D--往往是由近親婚配引起的。但也有文獻(xiàn)報(bào)道,親代雜合狀態(tài)的正常表型也可引起子代的完全缺失。對(duì)于本例,根據(jù)先證者家系血清學(xué)與PCR結(jié)果,其母、兄、姐、妹、女、子均有正常表型,而其本人RHCE基因缺失,很可能其父母雙方分別攜帶一條D--單倍型,為RHCE基因缺失型雜合狀態(tài),在遺傳時(shí)將D--單倍型均遺傳給先證者,從而造成先證者為Rh缺失型D--,其姐、妹、女、子均為RHCE基因缺失型雜合狀態(tài)。推斷先證者家系基因型很可能為:父親:DCe/D--,母親:DcE/D--,其兄:DCe/DcE,其姐:DcE/D--,其妹:DcE/D--,先證者D--/D--,其夫:DCe/DCe,其女:DCe/D--,其子:DCe/D--。上述結(jié)果是根據(jù)目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的最有可能的推斷。若要得到確切的結(jié)論,必須對(duì)該家系進(jìn)行更深入的分析,如對(duì)該家系成