浙江山林灘涂海泥水溶體系的抑菌活性研究

在加工、運輸、儲存和銷售過程中，商品、食品和藥物通常會因腐敗和變質(zhì)而造成直接經(jīng)濟損失。添加抗生素是預(yù)防微生物污染的主要手段（鄭坪等人，2008；周建新等人，2002）。但由于合成防腐劑具有一定的毒副作用,人們傾向于選擇安全性高的天然防腐劑。當前,對天然防腐劑的研究開發(fā)已成為備受矚目的熱點,1931年McClean首先報道了魚精蛋白具有抑菌活性(Uytlendaleetal,1994),Miller等(1942)發(fā)現(xiàn)魚精蛋白能夠抑制多種好氧菌和厭氧菌的呼吸和代謝,從而影響起生長繁殖,此后有關(guān)魚精蛋白抗菌作用的研究日益深入,并逐漸應(yīng)用于食品的防腐保鮮(Motohino,1996)。李治等(2000)進行了O-羧甲基殼聚糖抗菌性的研究,結(jié)果表明:O-羧甲基殼聚糖的抗菌性隨著羧甲基化度的升高呈現(xiàn)出先升后降的規(guī)律,并且在比較寬的羧甲基化度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較殼聚糖更好的抗菌性。趙小釩(2000)進行了松蘿酸的抑菌實驗研究,結(jié)果表明:在pH5—6的條件下抑菌效果最好。賈建波(2000)研究了生姜和荸薺皮提取物的抗菌作用,結(jié)果表明:生姜和荸薺皮提取物以5:5混合,對細菌、啤酒酵母、黑曲霉菌具有良好抑菌作用。周建新等(2002)研究了銀杏葉提取物(EGb)的抗菌特性,結(jié)果表明,EGb對細菌和真菌的最低抑菌濃度(MIC)為1.25%和5.0%,EGb的抗菌活性具有熱穩(wěn)定性,能忍受高溫短時的熱處理;EGb在pH5—9的范圍內(nèi)均具有抗菌活性。民間早有用礦物泥治療腳癬、真菌感染等皮膚病的應(yīng)用實例,且效果較好。位于東海之濱的浙江秀山灘涂海泥屬于礦物泥,集東海生態(tài)環(huán)境和錢塘江沖積之精華,天然、潔凈、細膩,含有豐富的礦物質(zhì)、膠體成分、海洋特有的微生物及維生素、氨基酸、抗菌素等,具有獨特的抗氧化、保健治療等功效(Maoetal,1997)。但對海泥水溶體系抑菌作用的研究,迄今鮮有報道。本文采用固體培養(yǎng)基體外抑菌法,在不同濃度,相同pH條件下,研究秀山海泥水溶體系對細菌、霉菌以及酵母菌的抑菌作用和抑菌動力學曲線,并選用公認較好的合成防腐劑對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸甲酯作為對照。在菌株的選擇上,選用大腸桿菌代表革蘭氏陰性菌、金黃色葡萄球菌代表革蘭氏陽性菌、黑曲霉菌代表霉菌、白色念珠菌代表酵母菌。本研究可為秀山海泥在食品防腐、化妝品工業(yè)、醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用提供資料。1材料和方法1.1復(fù)合涂層的制備海泥:采自浙江省岱山縣秀山鄉(xiāng)滑泥主題公園的灘涂。在灘涂的起始位置,按高、中、低潮位各取一點,合并三點的泥樣作為此位置的樣品。然后每隔200m取一次樣,共取五次,得到灘涂不同位置的五個樣品。菌株:大腸桿菌(Escherichiacoli)(ATCC8739),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC6538),黑曲霉菌(Aspergillusniger)(ATCC16404),白色念珠菌(Candidaalbicansa)(ATCC10231),均購自美國標準菌庫。培養(yǎng)基(中華人民共和國衛(wèi)生部,1995):牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細菌);察氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)霉菌);沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基(培養(yǎng)酵母菌)。1.2海泥干法/水泥粉體系將采集的海泥加水攪拌,得到的泥漿水過篩(400目),經(jīng)離心后收集濕泥,干燥粉碎過篩(600目),制得海泥干粉(含水量<5%)。取適量海泥干粉溶于50ml雙蒸水中,經(jīng)攪拌、混勻、離心處理后取澄清液,沉淀加適量水重復(fù)處理三次,合并三次澄清液定容至250ml,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100ml,制得不同濃度的海泥水溶體系。采集的五個樣品均按上述方法制備海泥水溶體系,分別稱為秀山海泥水溶體系A(chǔ)、B、C、D、E。1.3菌種和酵母的培養(yǎng)細菌于37℃條件下,在牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h;霉菌于28℃條件下,在察氏斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d;酵母菌于28℃條件下,在沙堡氏斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h?；罨蟮木N用生理鹽水稀釋成一定濃度的菌懸液。1.4菌落培養(yǎng)和對照將海泥水溶體系A(chǔ)、B、C、D、E分別以不同濃度加入到已滅菌的培養(yǎng)基中混勻,取含海泥水溶體系的培養(yǎng)基(45℃左右)15ml與1ml菌懸液傾入無菌培養(yǎng)皿混合后于恒溫箱中培養(yǎng)[細菌:(36±1)℃,24h;真菌:(28±1)℃,72h],以未加海泥水溶體系的培養(yǎng)基作為對照。每個濃度試驗作3個平行樣,按稀釋分離平板菌落計數(shù)法進行計數(shù),并計算抑菌率:陽性對照物選擇同濃度的對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸甲酯?？梢愿鶕?jù)抑菌率為100%時的試樣的濃度,推出試樣的最低抑菌濃度(MIC)。1.5hac溶液的制備分別取最低抑菌濃度的海泥水溶體系A(chǔ)、B、C、D、E各5ml到含有90ml培養(yǎng)基的搖瓶中,并加入5ml菌懸液,將搖瓶置于恒溫搖床[細菌:(36±1)℃,真菌:(28±1)℃]中以180r/min振蕩,每隔一定時間取樣5ml,與不加水溶體系及加入HAc溶液的菌液作對照。以去離子水為空白樣作參比,用紫外分光光度計于650nm波長下測定培養(yǎng)液的濁度(以O(shè)D值表示),并以此表征防腐劑的抗菌活性。1.6統(tǒng)計處理采用SPSS11.3統(tǒng)計軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行檢驗。2結(jié)果與討論2.1對細菌抑菌效果選用了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌,分別接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板來測定不同濃度的海泥水溶體系對細菌類抑制效果。其結(jié)果見表1和表2。各組海泥水溶體系對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用,且抑制作用隨水溶體系濃度的增大而增強。各組海泥水溶體系在0.75%下就可對大腸桿菌達100%的抑制,濃度為1.00%時,對金黃色葡萄球菌達100%的抑制。各組海泥水溶體系同濃度時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果差異無顯著性(t檢驗:P>0.05),說明各組海泥水溶體系對細菌的抑菌效果無顯著性差異。各組海泥水溶體系與對羥基苯甲酸丙酯相比,在濃度小于0.50%時,后者抑制大腸桿菌的效果明顯優(yōu)于前者,差異有顯著性(LSD:多個實驗組與一個對照組均數(shù)間兩兩比較,P<0.05),而當濃度大于0.75%后,其抑菌效果差異無顯著性(LSD:P>0.05);與對羥基苯甲酸甲酯相比,當濃度小于1.50%時,抑制大腸桿菌的效果存在顯著性差異(LSD:P<0.05),各海泥水溶體系組優(yōu)于對照組。各組海泥水溶體系與對羥基苯甲酸丙酯相比,在濃度≥1.00%時,抑制金黃色葡萄球菌效果差異無顯著性(LSD:P>0.05),與對羥基苯甲酸甲酯相比,當濃度小于3.00%時,抑制金黃色葡萄球菌的效果差異有顯著性(LSD:P<0.05)。說明海泥水溶體系對細菌的抑菌效果與對羥基苯甲酸丙酯相當,且優(yōu)于對羥基苯甲酸甲酯。2.2海泥水溶體系b、c、d、e選用黑曲霉菌為指示菌,接種在察氏瓊脂平板上來測定不同濃度海泥水溶體系分別對霉菌的抑制效果,其實驗結(jié)果列于表3。各組海泥水溶體系對黑曲霉菌有顯著的抑制作用,且抑制作用隨水溶體系濃度的增大而加強。海泥水溶體系A(chǔ)、C、D、E均在0.50%時就完全抑制黑曲霉菌的生長,海泥水溶體系B雖然在0.75%達100%的抑制,但在0.50%時其抑菌率高達98.4%。同濃度的各組海泥水溶體系的抑菌效果差異無顯著性(t檢驗:P>0.05),說明各組海泥水溶體系對霉菌的抑菌效果相同。與對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸甲酯相比,當濃度小于0.50%時,抑菌效果均比陽性對照組差,且差異呈現(xiàn)顯著性(LSD:P<0.05);當濃度大于0.50%以后,試驗組與陽性對照組間抑菌效果差異無顯著性(LSD:P>0.05)。2.3海泥水溶體系抑菌效果的比較選用白色念珠菌為指示菌,接種在沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基上,測定不同濃度海泥水溶體系分別對酵母菌的抑菌效果,其實驗結(jié)果見表4。各組海泥水溶體系對白色念珠菌都有一定的抑制作用,且抑制作用隨濃度的增大而增強,各濃度組的海泥水溶體系抑制白色念珠菌的效果無顯著性差異(t檢驗:P>0.05),說明各組海泥水溶體系對酵母菌的抑菌效果相同,當濃度為2.00%時,對白色念珠菌可達到100%的抑制。當濃度小于2%時,各組海泥水溶體系與對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸甲酯相比,抑菌效果均有顯著性差異(LSD:P<0.05),說明海泥水溶體系對酵母菌的抑菌作用弱于對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸甲酯。2.4保健體系的mic值MIC值越低,試樣的抗菌效力越強,由以上表中數(shù)據(jù)可以得出海泥水溶體系A(chǔ)、B、C、D、E的MIC值,結(jié)果見表5。從表5可以看出,各組秀山海泥水溶體系對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌都有很強的抑制作用,對白色念珠菌的抑制作用相對較弱。各組海泥水溶體系對各供試菌的最低抑制濃度均近似相同,說明秀山灘涂海泥不同區(qū)域的樣品其抑菌效果相當。2.5培養(yǎng)基濁度的測定研究了海泥水溶體系A(chǔ)、B、C、D、E在其最低抑菌濃度時,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌及白色念珠菌的抑制活性。表6、表7、表8和表9分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌以及白色念珠菌在含有海泥水溶體系培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h的過程中,培養(yǎng)基濁度的變化情況。從表6～表9可知,各組秀山海泥水溶體系和兩個陽性對照組的抑菌效果均較強,在72h的培養(yǎng)期間,供試菌生長均被抑制在一個較低水平,達到100%的抑制。各組海泥水溶體系相互之間的抑菌活性無明顯的差異,再次證明秀山灘涂海泥不同區(qū)域的樣品其抑菌效果相同。3海泥水溶體系的抑菌機理秀山海泥水溶體系對細菌、霉菌和酵母菌都有較強的抑制作用,抑菌濃度也相對較低,其中秀山海泥水溶體系抗菌效果與公認較好的合成防腐劑對羥基苯甲酸丙酯相近,在質(zhì)量百分比濃度為0.75%左右時,就可以表現(xiàn)出很強的抗菌活性,且抗菌活性隨著濃度的增大而增強。同時本次試驗還證實,秀山灘涂不同區(qū)域的海泥泥樣其抑菌效果無顯著性差異,說明采樣的區(qū)域具有廣泛性。目前有關(guān)天然防腐劑的抑菌機理多與破壞細菌的細胞壁或細胞膜有關(guān)(Leeetal,1998;Galatietal,2003),因此海泥水溶體系抑菌機理推測也可能是由于