響應(yīng)面法優(yōu)化南瓜蛋白酶水解法制備膠原多肽工藝

豬的體重是1%。豬的主要成分是水、蛋白質(zhì)和脂肪，以及少量的纖維和礦物質(zhì)。其中，水含量為70%75%，蛋白質(zhì)為21%23%，脂肪約為1%，灰燼約為0.5%。豬皮中的蛋白質(zhì)以膠原蛋白為主,約占80%以上,同時還含有少量白蛋白,球蛋白和彈性蛋白。據(jù)資料顯示,我國豬的存欄數(shù)、出欄數(shù)、豬肉產(chǎn)量多年來均位居世界第一位,中國豬肉產(chǎn)量約占世界產(chǎn)量的一半之多,豬肉的產(chǎn)量占我國肉類總產(chǎn)量的69.4%。動物皮膚最重要的一個應(yīng)用就是制革,但由于豬皮本身質(zhì)地不佳,目前在皮革工業(yè)中已經(jīng)很少采用豬皮,另外,由于豬皮有令人難以接受的特有的異味、不良的口感、消化率低、加工不方便等原因常將其扔棄,很少直接使用,造成了豬皮的大量積壓,豬皮的營養(yǎng)價值和功用沒有得到充分的發(fā)揮。因此,本實驗選用木瓜蛋白酶水解豬皮制備膠原多肽,確定木瓜蛋白酶水解的最佳條件,為豬皮的開發(fā)利用找到一條新的出路。1材料和方法1.1材料和試劑新鮮豬皮為市售。木瓜蛋白酶(食品級)南寧東恒華道生物科技有限公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。1.2華峰儀器與增力電機阻壓器JA5003電子天平上海天平儀器廠;SHJ-A恒溫振蕩水浴鍋金壇市華峰儀器有限公司;Delta320酸度計梅特勒-托利多儀器(上海)公司;JJ-1增力電動攪拌器金壇市恒豐儀器廠;TD5A-WS臺式低速離心機賽特湘儀離心機儀器有限公司。1.3方法1.3.1酶水解反應(yīng)法1.3.1.加熱加熱,保持6min將新鮮豬皮清洗去除污物后,將表面的油脂刮除,放入鍋內(nèi)、加適量的水,加熱至100℃后保持5min。取出煮熟的豬皮,稍涼后再用刀將表面的脂肪刮去,拔掉豬毛,然后將皮塊切成10mm×10mm左右大小的皮塊。1.3.1.2.下降采用皂化法脫脂,脫脂劑為3%的Na2CO3,脫脂溫度為40℃,脫脂時間為40min,冰箱冷凍保存待用。1.3.1.滅活酶離心棄去沉淀經(jīng)過前處理的豬皮→加入一定量的去離子水→調(diào)pH值→加入一定量的蛋白酶→恒定溫度、水解一定的時間→沸水浴10min滅活酶→離心棄去沉淀1.3.2耗堿量的測定采用甲醛滴定法。具體測定方法為:將水解液在4000r/min下離心10min取5ml上層清液,用0.1mol/L的NaOH溶液滴定到pH8.2,加入5ml37%的甲醛溶液(所用甲醛溶液先用NaOH滴定到pH8.2),再用的0.1mol/L的NaOH滴定到pH8.2。記錄加入甲醛后把溶液滴定到pH8.2所耗堿量。pH值測定使用精密pH計。然后計算蛋白質(zhì)的水解度:豬皮膠原蛋白徹底水解的方法是將豬皮在6mol/L的HCl中于105~110℃下水解24h。2結(jié)果與分析2.1單一解水條件分析2.1.1結(jié)果圖1根據(jù)相關(guān)資料初步確定其反應(yīng)條件為:反應(yīng)溫度60℃,酶濃度0.6%(酶量以豬皮重量的百分數(shù)計),底物濃度25%(固液比),反應(yīng)時間4h。選擇了5個pH值進行單因素分析,結(jié)果如圖1所示。由圖1可見,pH值對水解度有一定的影響。當(dāng)pH值從3.0增加到6.0時,水解度有所上升;當(dāng)pH值從6.0增加到9.0時,水解度有所降低。而pH值在4.0~6.0范圍內(nèi)水解度較為穩(wěn)定,且在一個較高的水平上。每一種酶都有其適合的pH值作用范圍,在這個作用范圍內(nèi)酶的催化活性部位含有的可解離的基團得到了最充分的解離,使酶的活性中心與蛋白質(zhì)底物充分結(jié)合,從而將底物最大程度地轉(zhuǎn)化為水解產(chǎn)物,使水解度達到最大值。pH值偏高偏低都會導(dǎo)致水解度的下降。因此,確定pH值范圍為4.0~6.0。2.1.2單因素分析試驗根據(jù)相關(guān)資料初步確定其反應(yīng)條件為:反應(yīng)pH5,酶濃度0.6%(酶量以豬皮重量的百分數(shù)計),底物濃度25%(液固比),反應(yīng)時間4h。選擇了6個溫度值進行單因素分析,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)溫度從30℃增加到60℃,水解度逐漸升高;而當(dāng)溫度從60℃增加到80℃,水解度逐漸下降。其原因是,當(dāng)酶解溫度在30~60℃范圍內(nèi)時,隨著溫度的上升,木瓜蛋白酶逐漸被激活,因而水解度不斷上升。但當(dāng)溫度大于50℃時,由于溫度過高,引起木瓜蛋白酶受熱變性,逐漸失活,所以水解度逐漸下降。因此,溫度取值范圍為50~70℃。2.1.3圖1為不同的對象,我國專家對目前存在的問題a根據(jù)相關(guān)資料初步確定其反應(yīng)條件為:反應(yīng)pH5,反應(yīng)溫度60℃,底物濃度25%(液固比),反應(yīng)時間4h。選擇了7個酶濃度值進行單因素分析,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,當(dāng)酶量從0.2%增加到0.8%,水解度以較快的速度升高;當(dāng)酶量從0.8%增加到2.0%的過程中,水解度上升的速度已十分緩慢。這是由于水解底物是有限的,當(dāng)酶量達到一定程度時,就可將大部分的底物反應(yīng)掉。由于水解底物的缺乏,這時即使再增加酶量,也無法使水解度得到顯著的提高。因此當(dāng)酶量達到0.8%以后,水解度曲線就趨于平坦。考慮到成本問題,選酶濃度的范圍為0.8%~1.0%。2.1.4單因素分析結(jié)果根據(jù)相關(guān)資料初步確定其反應(yīng)條件為:反應(yīng)pH5,反應(yīng)溫度60℃,酶濃度0.6%(酶量以豬皮重量的百分數(shù)計),反應(yīng)時間4h。選擇了8個底物濃度值進行單因素分析,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,底物濃度過低或過高都會降低水解度。底物濃度過低,會降低反應(yīng)體系中的酶濃度,使水解度下降。底物濃度過高,體系有效水濃度過低,降低了底物蛋白分子和酶分子的擴散和運動,從而降低了底物與酶分子的碰撞幾率,使反應(yīng)速度降低;另一方面,體系中高濃度的底物蛋白可能集聚于蛋白酶的活性部位,形成無活性的中間產(chǎn)物,抑制水解反應(yīng)。同時,加水量的增加也給后續(xù)工序,如濃縮增加負荷。故選擇底物濃度的最適范圍為30%~40%。2.1.5反應(yīng)時間h根據(jù)相關(guān)資料初步確定其反應(yīng)條件為:反應(yīng)pH5,反應(yīng)溫度45℃,酶濃度0.6%(酶量以豬皮重量的百分數(shù)計),底物濃度25%(液固比),反應(yīng)時間4h。選擇了7個時間值進行單因素分析,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,反應(yīng)時間超過2h之后,水解度的增加就不太明顯了。另外考慮到水解時間過長,不利于工業(yè)生產(chǎn),我們確定木瓜蛋白酶水解豬皮的最適時間為3h,并固定此條件,在下一步的正交試驗中不再對該因素進行篩選。2.1.6最佳酶解條件的確定分析可知,影響木瓜蛋白酶酶解的主要因素有pH值、溫度、酶用量、底物濃度。通過單因素試驗,找出這些主要影響因素的水平,采用L9(34)正交試驗,水解3h,以水解度為評價指標(biāo),確定最佳酶解條件。因素水平表見表1,正交試驗結(jié)果見表2,各因素與水解度關(guān)系的直觀效果圖見圖6。由表2可知,極差的大小順序為B>C>A>D,因此,影響因素主次順序也為B>C>A>D,即B因素的影響極大,C因素次之,而后是A因素,D因素的影響最小。根據(jù)正交試驗的結(jié)果,初步確定木瓜蛋白酶水解豬皮制備膠原多肽的最佳組合條件為A2B2C2D1,即最適pH為5,最適溫度為60℃,最適酶量為0.9%,最適底物濃度為30%。在最佳條件下,通過驗證實驗確定最優(yōu)組合的水解度為14.91%。3膠原多肽的制備目前在國外對于豬皮已有一些利用,如德國的赫斯特公司己發(fā)明了一種豬皮軟化劑,經(jīng)軟化處理的豬皮質(zhì)地柔軟,很容易進行加工處理成多種豬皮食品。又如德國的漢諾威袋裝香腸中豬皮的添加量竟高達36%。利用豬皮制備膠原多肽的研究成為近年的熱點問題。豬皮中提取膠原多肽的方法主要有:酸法、堿法、酶法。酸堿法是用酸、堿等化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂形成小分子物質(zhì)。但由于堿法水解使氨基酸大多消旋,無生物利用價值,因此不宜采用;而酸法多采用鹽酸、硫酸等強酸在高溫下反應(yīng),反應(yīng)強烈,設(shè)備腐蝕嚴重,水解徹底,多生成氨基酸混合物,同時在高溫下色氨酸完全被破壞,目前已漸被淘汰。酶法水解蛋白的研究,最初是始于利用酶部分降解蛋白質(zhì),增加其分