葛根素的提取與質(zhì)量控制

野生葛根是薔薇科植物科的一種廣泛使用的植物。這是中醫(yī)臨床常用的一種抗風(fēng)解劑。野葛根為常用生藥,味甘辛,性平,現(xiàn)代藥理研究表明,其具有降低血管阻力,改善心、腦血液循環(huán),減慢心率,降低心肌耗氧量等作用。野葛根主要有效成分為異黃酮類化合物,以葛根素的含量最高。葛根素已作為原料制成藥品在臨床上廣泛使用,用于治療心絞痛,高血壓,心肌梗塞,心率失常,高粘血癥,?-高敏癥和視網(wǎng)膜阻塞等疾病。目前,關(guān)于葛根中提取純化葛根素的研究報(bào)道較多[1~5],本文根據(jù)葛根素在水和正丁醇中溶解度都小的特性,對(duì)野葛根醇提取物進(jìn)行了水和正丁醇的反復(fù)萃取。選出了操作簡(jiǎn)單,成本低,易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的工藝從野葛根中提取葛根素,并對(duì)其進(jìn)行了定性和定量分析?，F(xiàn)報(bào)道如下:1實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料1.1儀器、儀器和儀器紫外分光光度儀(HITACHI557),紅外分光光度儀(HITACHI220-50,美國(guó)DELL公司),核磁共振分析儀(MERCURY400BBP,美國(guó)),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE120)。1.2藥物、試劑、儀器野葛根(購(gòu)自蘭州佛慈制藥廠,產(chǎn)地陜西,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所鑒定),葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所),薄層層析硅膠GF254(青島海洋化工有限公司),酸性三氧化二鋁、正丁醇、乙醇氯仿、甲醇(均為分析醇),羧甲基纖維素鈉(CMC)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1對(duì)照溶液的制備精密稱取葛根素對(duì)照品5mg于5mL量瓶中,加乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,備用。2.2葛根素檢測(cè)取一定量薄層硅膠G,加0.5%的CMC溶液(1∶4)攪拌均勻,制備2cm×10cm薄層板若干,自然涼干后,在105℃下活化1h,置干燥器中備用。選用展開劑為氯仿-甲醇(4∶1)對(duì)葛根總黃酮(酒精提取物)進(jìn)行分析,被檢測(cè)組分葛根素顯一蘭色熒光斑點(diǎn),在硅膠板上的展開效果理想,Rf為0.31(圖1)。因此,以下薄層層析(TLC)均選用此展開劑及比例。2.3濾渣中葛根素的檢測(cè)稱取葛根2000g于3口圓底燒瓶中,加入95%乙醇2000mL,在水浴鍋中(58~60℃)熱浸29h,過濾,濾液備用。再加入95%乙醇1000mL于濾渣中,在同樣溫度下,熱浸29h,過濾,取一小部分濾液與對(duì)照品溶液做薄層層析,濾液中有與葛根素對(duì)照液Rf相同的斑點(diǎn),表明濾液中含有葛根素,因此,重復(fù)以上步驟并用TLC跟蹤,重復(fù)7次,TLC結(jié)果顯示濾渣中已無葛根素。將前8次濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮為浸膏。2.4葛根素的分離和提取2.4.1飽和正丁醇和正丁醇對(duì)樣品中葛根素的影響將濃縮得到的浸膏用400mL水飽和正丁醇和400mL正丁醇交替溶解,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)振蕩1h,靜置2h,吸取上清液。在溶解的過程中,水飽和正丁醇和正丁醇的量可逐漸遞減并用TLC進(jìn)行檢測(cè),TLC結(jié)果顯示第17次用水飽和正丁醇溶解的上清液中無葛根素。將前16次上清液合并后濃縮至原體積的一半,以備待用。2.4.2萃取過程中已存在葛根素的檢測(cè)把前16次上清液用水分批進(jìn)行萃取,第1次萃取所用水量為上清液體積的4倍;第2次為3.5倍;第3次為3倍;第4次為2.5倍,第5次以及第5次以后均為2倍;萃取過程中同樣采用TLC對(duì)水萃液進(jìn)行跟蹤檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)第11次水萃液中已無葛根素。合并前10次水萃取液并濃縮至原體積的一半,再用正丁醇對(duì)濃縮后的水萃取液進(jìn)行分批萃取,所用正丁醇的體積第1次為水萃液體積的1/2;第2次為1/3;第3次為1/4;依次類推。用TLC檢測(cè)第9次的正丁醇萃取液中已無葛根素。合并前8次萃取液以備待用。2.4.3三氧化二鋁柱骨折2.4.4結(jié)晶3識(shí)別和分析產(chǎn)品3.1定性評(píng)價(jià)3.2定量分析3.2.1,0.6,1.8%乙醇溶液配制稱取干燥至恒重的葛根素5mg,于25mL容量瓶中,加95%的乙醇溶解并稀釋至刻度,吸取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL溶液置10mL容量瓶,以1.0mL95%乙醇精密加水至10mL,搖勻。同時(shí)以1.0mL95%乙醇加水至10mL作空白對(duì)照,在250nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。處理數(shù)據(jù),得回歸方程為:A=0.0658C+0.2469,r=0.9997。3.2.2乙醇溶液的配制按文獻(xiàn),采用紫外-分光光度計(jì),精密稱取葛根素25mg于50mL容量瓶中,加95%的乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。吸取1.0mL于25mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度,搖勻,取1.0mL乙醇同樣稀釋作空白對(duì)照,在250nm處測(cè)定吸收度由回歸方程計(jì)算出產(chǎn)品中葛根素的純度為97%。4葛根素的檢測(cè)1)由于葛根素在水和正丁醇中溶解度都小的特點(diǎn),因此本實(shí)驗(yàn)采兩相溶劑萃取法進(jìn)行葛根素的分離,正丁醇溶解浸膏后,用水進(jìn)行多次萃取,這樣使得葛根素全部溶解在水相,其它水不溶性物質(zhì)被除去;同樣,用正丁醇和水飽和正丁醇進(jìn)行萃取,葛根素全部溶解在有機(jī)相,而脂不溶性物質(zhì)被除去。通過上述兩次萃取過程,水不溶性和脂不溶性物質(zhì)全部被除去。從而達(dá)到分離葛根素的目的。該法操作簡(jiǎn)單,成本低(所用正丁醇和乙醇可大部分回收)。2)萃取過程分為兩個(gè)階段:第一階段為水萃,所用水量與上清液體積比(V水∶V有)逐級(jí)遞減,即逐級(jí)提高萃取效率(E%=D/D+V水/V有D為萃取常數(shù))。這樣有利與葛根素從上清液中萃出,因?yàn)楦鸶卦谏锨逡褐械暮侩S著萃取次數(shù)的增多而逐漸減少。第二階段為正丁醇萃取,其V水∶V有也逐級(jí)遞減,這一方面有利于提高葛根素的萃出率,另一方面使所用的正丁醇溶劑體積不至于過大,從而使葛根素在正丁醇濃度較高,這有利于進(jìn)一步的分離和純化。3)據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,葛根提取液進(jìn)行TLC后在薄層板上顯天蘭色熒光斑點(diǎn)的為葛根素,另外也有報(bào)道葛根有效成分的檢查是在GF254薄層板上與葛根素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照觀察紫色熒光,提示本實(shí)驗(yàn)在沒有確定最佳提取工藝的條件下,采用薄層層析譜上熒光成分的消失作為提取終點(diǎn)的判斷指標(biāo)是可行的。本實(shí)驗(yàn)選用氯仿:甲醇=4∶1為展開劑,葛根素Rf為0.31,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。4)近紅外光譜分析技術(shù)是隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展起來的一種高新技術(shù),具有快速、無污染、樣品不需要預(yù)處理和同時(shí)檢測(cè)多組分等優(yōu)點(diǎn)。但它只能反映化合物的一些特征官能團(tuán),并不能準(zhǔn)確的鑒定化合物。我們進(jìn)行了近紅外光譜快速檢測(cè)葛根素的研究,查閱有關(guān)文獻(xiàn)可知:3398為-OH特征峰,1630為C=O特征峰,1584、1515、1443、1384四個(gè)吸收峰為芳香系統(tǒng)特征峰,1257、1178、1118三個(gè)吸收峰為C-O-C的特征峰。這符合葛根素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),再綜合核磁圖譜,可做出比較準(zhǔn)確的判斷。5)采用紫外分光廣度法對(duì)產(chǎn)品中葛根素的含量及純度進(jìn)行了檢測(cè),所得產(chǎn)品葛根素收得率為1.41%純度為97%;潘娓婕等利用酸水解法所得葛根素收得率為1.36%,純度為98.32%,而張尊聽等分離所得葛根素產(chǎn)率為1.2%,純度為93.4%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)葛根素收得率比上述兩者都高,純度略低于前者,因此該工藝可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。6)萃取過程中振搖時(shí),有時(shí)會(huì)發(fā)生乳化現(xiàn)象,為了減少乳化程度,用細(xì)金屬絲攪動(dòng)乳化部分,可以起到一定程度的緩解;另可收集乳化液,因其為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系,長(zhǎng)時(shí)間放置,便可自然分層。所得正丁醇萃取液為透明,亮黃色的液體,經(jīng)三氧化二鋁柱脫色,再經(jīng)減壓濃縮,濃縮液靜置析出后,抽濾并經(jīng)自然干燥得粗制品0.75kg。取粗制品75g,加入95%的冰醋酸262mL,加熱至116℃溶解,并結(jié)晶得精品28.2g。白色粒狀,mp327~328℃,與葛根素標(biāo)準(zhǔn)品做混合對(duì)照,熔點(diǎn)不下降;TLC分析,紫外燈下觀察熒光斑點(diǎn),其Rf值也一致(如圖2);IRUKBrMax(cm-1):3398,1630,1584,1515,1443,1384,1257,1178,1118,1081,1041。與葛根素對(duì)照品IR數(shù)據(jù)基本一致:3370,1631,1607,1514,1447,1396,1273,1210,1103,1059,1008。精品與葛根素標(biāo)準(zhǔn)品