木質(zhì)素羥丙基磺甲基化改性及其對纖維素酶水解的影響為了減少化石燃料對能源和環(huán)境的負面影響，人們對尋求可再生的清潔能源愈發(fā)關注[1]。木質(zhì)纖維原料作為世界上最大的可再生資源，其具有可再生、成本低、易獲得等特點，已被廣泛用于生物乙醇的生產(chǎn)以替代化石燃料的生產(chǎn)[2]。在木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為生物乙醇的過程中，酶水解是葡萄糖轉(zhuǎn)化的關鍵步驟之一，纖維素酶、水解條件、底物等因素都會對酶解效率產(chǎn)生影響[3-4]。底物木質(zhì)素作為木質(zhì)纖維原料的主要成分，對酶水解的影響主要表現(xiàn)在木質(zhì)素引起的非生產(chǎn)性吸附和空間阻礙這兩方面，其中纖維素酶與木質(zhì)素之間的非生產(chǎn)性吸附主要與疏水作用、靜電作用、氫鍵作用有關[5-6]。木質(zhì)素結(jié)構中含有多種官能團，如酚羥基、羧基、甲氧基等，這些官能團使木質(zhì)素具有疏水性、表面電荷等特性，使之與酶發(fā)生相互作用，影響酶水解過程[7-8]。酚羥基被認為是影響木質(zhì)素抑制作用的關鍵因素，已有研究表明，木質(zhì)素模型化合物上的酚羥基會影響纖維素酶的吸附，對其適當?shù)母男钥梢韵举|(zhì)素帶來的抑制作用[9]。趙存異等[10]對堿木質(zhì)素進行了羥丙基化改性，研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素表面特性的改變能夠減少木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附。除此之外，常用的改性方法還包括羧化改性，Nakagame等[11]通過研究證實增加木質(zhì)素的羧酸含量能夠顯著降低纖維素酶的非生產(chǎn)性結(jié)合，從而增加了纖維素的酶水解效率。Yang等[12]也在研究木質(zhì)素理化性質(zhì)與抑制纖維素酶解的相關性時發(fā)現(xiàn)，分別對木質(zhì)素進行羧化和磺化改性能夠提高木質(zhì)素的親水性，將其疏水性降低22%~30%，從而消除木質(zhì)素76%~96%的抑制作用。木質(zhì)素的磺化可以減少木質(zhì)素與纖維素酶之間的疏水作用，降低酶水解過程中底物中木質(zhì)素對酶的無效吸附[13]。Wu等[14]在實驗中發(fā)現(xiàn)，在木質(zhì)素中引入磺酸基團能夠提高木質(zhì)素的親水性，降低木質(zhì)素與纖維素酶結(jié)合程度的同時能夠增強了纖維素的水解能力。也有研究表明，在酶水解體系中加入磺化木質(zhì)素（sulfonatedlignin,SL）后，纖維素酶和SL相互作用形成SL-纖維素酶復合物，從而增強底物木質(zhì)素與纖維素酶之間的靜電斥力，減少纖維素酶對其非生產(chǎn)性吸附[15]。

綜上所述，對木質(zhì)素進行改性獲得具有特定性質(zhì)的木質(zhì)素是提高纖維素酶與纖維素吸附、增強纖維素酶水解的重要手段。然而現(xiàn)有的改性技術往往只是針對解決疏水作用、靜電作用或氫鍵作用中某一種單一因素，對木質(zhì)素綜合性能提高的改性還亟待進一步的研究。研究木質(zhì)素的復合改性，將兩種或多種改性方式結(jié)合起來對減少木質(zhì)素與纖維素酶之間的非生產(chǎn)性吸附有著重要的作用。本文旨在從疏水作用、靜電作用兩方面著手從而降低木質(zhì)素與纖維素酶之間的作用力，通過兩步法對木質(zhì)素進行羥丙基磺甲基化改性，封閉木質(zhì)素結(jié)構中酚羥基的同時引入親水性的磺酸基團，以期制備一種高負電性、低疏水性的木質(zhì)素。探究改性木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附及對纖維素酶水解的影響，以期為開發(fā)經(jīng)濟、高效的預處理技術提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1原料與試劑

木質(zhì)素原料來源于江蘇造紙企業(yè)，純度96.0%。微晶纖維素AvicelPH-101購于Sigma-Aldrich公司。實驗所用的纖維素酶（Cellic?CTec2）購自于丹麥Novozymes公司，濾紙酶活為200FPU/g，其余化學藥品購于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2改性木質(zhì)素的制備

改性木質(zhì)素的制備參考文獻[9,16]。稱取4g木質(zhì)素，加入蒸餾水配制成30%（質(zhì)量）溶液，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為11。加熱至70℃后，加入1ml37%的甲醛溶液。反應2h后升溫至95℃，加入1.2g無水Na2SO3，反應3h后用0.1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2，將所得木質(zhì)素反應產(chǎn)物過濾、水洗、冷凍干燥。取其中固體3g，加入9ml6%NaOH和6ml環(huán)氧丙烷，室溫下反應48h。反應結(jié)束后轉(zhuǎn)移到含有3ml36%HCl的100ml蒸餾水中，經(jīng)沉淀、過濾即得羥丙基磺甲基化木質(zhì)素（反應式見圖1）。

圖1

圖1改性木質(zhì)素的制備流程

Fig.1Preparationprocessofmodifiedlignin

1.3纖維素酶水解

取適量的微晶纖維素于Fritsch微型行星式高能球磨機中球磨2h，轉(zhuǎn)速為600r/min，球磨機每運行5min，休停10min。

以球磨后微晶纖維素和添加了木質(zhì)素的微晶纖維素為底物，木質(zhì)素與微晶纖維素的添加量為0.53∶1，按酶用量30FPU/g葡聚糖加入混合酶液。用pH為4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)酶水解底物質(zhì)量分數(shù)為5%。在50℃、180r/min的條件下于恒溫振蕩器中反應72h。采用美國Waters1525分析型高效液相色譜檢測水解液中各單糖的濃度，葡聚糖轉(zhuǎn)化率按式(1)計算。

Y=c×v×0.9m×w×100%（1）

式中，Y為葡聚糖轉(zhuǎn)化率，%；c為水解液中葡萄糖濃度，g/L；v為水解總體系水解液體積，ml；0.9為葡萄糖轉(zhuǎn)化系數(shù)；m為原料質(zhì)量，g；w為原料中葡聚糖的含量，%。

1.4木質(zhì)素傳感器的制備

以LiCl/DMSO為溶劑，溶解木質(zhì)素，采用旋涂法將溶解后的木質(zhì)素涂在金片表面。旋涂后的金片置于60℃的烘箱中干燥，待液膜變干后，用超純水浸泡除去LiCl和DMSO。然后用氮氣將膜的表面吹干，放入干燥器中備用。

1.5分析方法1.5.1紅外光譜分析稱取1mg干燥后的木質(zhì)素樣品與100mg的溴化鉀混合，研磨成細粉末后進行壓片，在BruckerVERTEX80V紅外光譜儀中進行檢測。掃描范圍為4000~400cm-1，掃描分辨率為4cm-1，掃描次數(shù)為60次/s。

1.5.2核磁氫譜分析分別取20mg改性前后木質(zhì)素樣品，溶于0.5mlDMSO-d6中，在25℃的條件下，使用BrukerBiospin公司的AVANCEIII600MHz全數(shù)字化超導核磁共振譜儀在氫譜的模式下進行測試。測試條件：掃描次數(shù)16，數(shù)據(jù)采集時間2s，掃描寬度12022Hz，采集數(shù)據(jù)點65536。

1.5.3XPS分析利用島津公司的AXISUitraDLDX射線光電子能譜儀對木質(zhì)素的表面元素和官能團組成進行分析。具體測試條件為：輻射源為AlKαX光源，測試能量為1486.6eV，測試管電壓為15kV，管電流為5mA。

1.5.4酚羥基測定根據(jù)文獻[17]采用Folin-Ciocalteu試劑法（FC法）進行酚羥基的測定。

（1）標準曲線繪制

精確稱取一定量的香草醛，分別配制濃度為2.65、5.29、10.58、21.17、26.46、37.05μmol/L的溶液50ml，然后再加入3mlFC試劑，充分搖勻30s后加入10ml20%Na2CO3，攪拌反應2h。利用TU-1900型紫外分光光度計在760nm下測試濃液吸光度，得到標準曲線為y=0.01362x+0.00115。

（2）木質(zhì)素樣品測定

稱取10mg待測樣品，溶解于100ml蒸餾水中（為保證木質(zhì)素充分溶解，可加入少量的NaOH），按上述步驟測量吸光度并對照標準曲線計算酚羥基含量。

1.5.5表面電荷測定根據(jù)文獻[18]測定改性前后木質(zhì)素的表面電荷。將120mg木質(zhì)素溶解在10g的0.1mol/LNaOH溶液中，加入3g的1mol/LHCl，混合均勻。加入30g0.1mol/LNaOH進行中和，以不含木質(zhì)素的空白為對照樣，用0.1mol/LHCl滴定樣品和空白樣品至pH為4.8。木質(zhì)素樣品溶液的滴定體積記為Vsample，空白樣品的滴定體積記為Vblank，表面電荷Q的計算公式如下：

Q=Vsample-Vblank×M/W（2）

式中，M為HCl的濃度，0.1mol/L；W為木質(zhì)素樣品的質(zhì)量，0.12g。

1.5.6接觸角測定改性前后的木質(zhì)素分別配制成質(zhì)量分數(shù)為0.25%水溶液，可加入微量的NaOH保證木質(zhì)素充分溶解。取100μl的木質(zhì)素溶液和羥丙基磺甲基化木質(zhì)素溶液分別涂覆于載玻片上，室溫下風干24h，在105℃的烘箱中干燥1h除去剩余的水分。使用瑞典百歐林公司的T200-Auto3Plus光學接觸測試儀進行接觸角的測定。

1.5.7QCM分析將涂覆的木質(zhì)素薄膜金片放入QCM模塊中，溫度設定為40℃，以0.1ml/min的速度向模塊中通入pH為4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液。待基線穩(wěn)定后，通入濃度為0.1mg/ml的纖維素酶溶液，30min后停止通入酶溶液，再次向模塊中通入緩沖液，沖洗15min。每組實驗至少測定3次，頻率選用3次測定的平均值。所有頻率變化的基頻為5MHz，頻率為15、25、35和45MHz的倍頻被同時監(jiān)測。數(shù)據(jù)處理時選用3倍頻（15MHz）下的數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與討論

2.1紅外光譜分析

木質(zhì)素和羥丙基磺甲基化木質(zhì)素的紅外光譜圖如圖2所示，主要峰的范圍在4000~400cm-1。3420cm-1處的吸收峰為羥基的伸縮振動，2931cm-1處為亞甲基、次甲基伸縮振動的吸收峰。1590、1509、1420cm-1處的吸收峰為苯環(huán)骨架振動，說明改性后的木質(zhì)素芳香環(huán)結(jié)構保存完好。與木質(zhì)素相比，2931cm-1處改性后木質(zhì)素的吸收峰增強，表明木質(zhì)素中甲基、亞甲基的含量增多。改性后木質(zhì)素在1147、1070、532cm-1處的吸收峰較強，該處為磺酸基團的特征峰[19-20]，說明木質(zhì)素的結(jié)構中引入了磺酸基團。

圖2

圖2改性木質(zhì)素和木質(zhì)素的紅外光譜圖

Fig.2FT-IRspectraofmodifiedligninandoriginallignin

2.2核磁氫譜分析

木質(zhì)素改性前后的核磁氫譜圖如圖3所示。δ=3.10~3.32是酚羥基的質(zhì)子峰[21]，從圖3中可明顯看出，改性木質(zhì)素在此處的信號強度與木質(zhì)素相比有所減弱，說明經(jīng)過改性后木質(zhì)素中的酚羥基被封閉。此外，δ=3.32~4.00是—CH2SO3Na中亞甲基的質(zhì)子峰，羥丙基磺甲基化改性后的木質(zhì)素在此處的信號強度增加，表明改性后木質(zhì)素的結(jié)構中成功接入了磺酸基團。

圖3

圖3改性木質(zhì)素和木質(zhì)素的核磁氫譜圖

Fig.31HNMRspectraofmodifiedligninandoriginallignin

2.3木質(zhì)素表面特性分析

木質(zhì)素和羥丙基磺甲基木質(zhì)素的表面元素含量通過XPS進行測定，結(jié)果如表1所示。從表中可知，木質(zhì)素未改性前的C元素含量為77.97%，O元素的含量為21.65%，S元素含量為0.38%。經(jīng)過羥丙基磺甲基化改性后，木質(zhì)素中C元素含量降低至77.33%，O元素的含量為21.89%，由于木質(zhì)素結(jié)構中磺酸基團的引入，S元素的含量提升至0.78%。

表1木質(zhì)素和羥丙基磺甲基木質(zhì)素的表面特性

Table1Surfacepropertiesofligninandhydroxypropylsulfonmethyllignin

樣品元素組成/%酚羥基含量/(mmol/g)表面電荷/(mmol/g)COS木質(zhì)素77.97±0.0321.65±0.010.38±0.025.28±0.21-0.33±0.04羥丙基磺甲基木質(zhì)素77.33±0.0321.89±0.020.78±0.050.36±0.01-0.58±0.02新窗口打開|下載CSV

木質(zhì)素與改性木質(zhì)素的酚羥基含量由FC法測得（表1），Xu等[22]已經(jīng)運用這一方法對不同堿預處理甘蔗渣制備的木質(zhì)素中酚羥基的含量進行測定與比較，并進一步探究其對酶水解的影響，F(xiàn)C法被認為是一種簡單、快速地測定木質(zhì)素酚羥基的方法[23]。根據(jù)表1可知，木質(zhì)素中酚羥基的含量為5.28mmol/g，羥丙基磺甲基木質(zhì)素中酚羥基的含量為0.36mmol/g，改性后木質(zhì)素中的酚羥基含量遠低于改性前木質(zhì)素，意味著木質(zhì)素中大量的酚羥基在經(jīng)過羥丙基磺甲基化反應后得到成功封閉。

纖維素酶水解過程中，木質(zhì)素和纖維素酶之間的吸附會受到疏水作用和靜電作用的影響[24-25]，例如，Yu等[26]發(fā)現(xiàn)在酶水解過程中添加陽離子聚合物能夠通過靜電吸引增強纖維素酶對纖維素的吸引，達到改善酶水解效果的目的。在研究纖維素酶對低共熔溶劑（deepeutecticsolvent,DES）提取的木質(zhì)素的非生產(chǎn)性吸附時，Song等[27]發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素在DES處理過程中會發(fā)生縮合，這些縮合的芳香結(jié)構通過疏水作用增加了對酶的吸附。因此本研究測定了木質(zhì)素和改性木質(zhì)素的疏水性和表面電荷。從表1中表面電荷的數(shù)據(jù)可以看出，木質(zhì)素和羥丙基磺甲基木質(zhì)素的表面電荷均具有負電性，分別為-0.33mmol/g和-0.58mmol/g，木質(zhì)素經(jīng)過改性后，在木質(zhì)素結(jié)構中引入了磺酸基團，使得其負電性得到提高。木質(zhì)素的疏水性則通過木質(zhì)素的接觸角來表征，圖4為木質(zhì)素改性前后的接觸角，兩種木質(zhì)素接觸角的大小為：改性前木質(zhì)素改性后木質(zhì)素。與木質(zhì)素相比，改性后的羥丙基磺甲基木質(zhì)素的接觸角減小，說明改性后的木質(zhì)素疏水性減弱。經(jīng)過改性，木質(zhì)素的酚羥基含量降低，同時結(jié)構中引入了親水性基團磺酸基，導致了改性后木質(zhì)素負電性增強、疏水性減弱[28]。

圖4

圖4木質(zhì)素（a）和羥丙基磺甲基木質(zhì)素（b）的接觸角

Fig.4Thecontactangleoflignin(a)andhydroxypropylsulfonmethyllignin(b)

2.4木質(zhì)素對纖維素酶的吸附

耗散型石英晶體微天平(QCM-D)是一種極其靈敏的質(zhì)量傳感器，目前已廣泛應用于多種領域[29]。它利用石英晶體的壓電效應，通過監(jiān)測表面頻率（?F）的變化，了解傳感器表面微質(zhì)量的變化以及表面薄膜的性能[30]。本文借助QCM-D實時、原位地研究木質(zhì)素對纖維素酶的吸附影響，纖維素酶在木質(zhì)素、羥丙基磺甲基木質(zhì)素薄膜上的吸附過程如圖5所示。由圖可知，纖維素酶在木質(zhì)素薄膜上的吸附均分為兩段：快速吸附(Ⅰ)和緩慢吸附(Ⅱ)。通入酶溶液后的前10min為快速吸附階段，之后的20min為緩慢吸附階段。在通入緩沖液后(Ⅲ)，兩種木質(zhì)素薄膜吸附纖維素酶的頻率均有所上升，由于QCM-D輸出的頻率與傳感器上薄膜的質(zhì)量成反比，說明木質(zhì)素薄膜的質(zhì)量在減少，僅有少量的纖維素酶被緩沖液沖洗掉。

圖5

圖5纖維素酶在木質(zhì)素薄膜上的吸附

Fig.5Adsorptionofcellulaseonligninfilm

通過對兩種木質(zhì)素的最大吸附頻率的比較發(fā)現(xiàn)羥丙基磺甲基化木質(zhì)素對纖維素酶的吸附量遠低于原木質(zhì)素，說明在酶水解過程中，與未改性木質(zhì)素相比，經(jīng)羥丙基磺甲基化的木質(zhì)素與纖維素酶之間產(chǎn)生的無效吸附更少。纖維素酶是由內(nèi)切葡聚糖酶EG、纖維二糖水解酶CBH、β-葡萄糖苷酶β-G三部分組成[31]。一般情況下，纖維素酶具有電荷，因此它們可以被木質(zhì)素表面相反或相同的電荷吸附或排斥，有研究表明，CBHⅠ和EGⅠ在pH=4.8時帶負電荷[32-33]。根據(jù)前面木質(zhì)素的表面電荷可知，羥丙基磺甲基化木質(zhì)素的負電性更高，幾乎是改性前木質(zhì)素的兩倍，羥丙基磺甲基化木質(zhì)素與纖維素酶之間會有更強的靜電斥力，因此會減少木質(zhì)素與纖維素酶之間的非生產(chǎn)吸附，有利于提高纖維素的酶水解效率。Li等[34]在研究不同分子量木質(zhì)素對酶水解的影響時也發(fā)現(xiàn)，負電性更高的木質(zhì)素對纖維素表現(xiàn)出較低的親和力，說明木質(zhì)素表面電荷的差異會導致纖維素酶與木質(zhì)素親和力的不同。除了靜電作用外，木質(zhì)素與纖維素酶之間的吸附也受到疏水作用的影響[35]。酶水解過程中，底物木質(zhì)纖維素的疏水性會影響纖維素酶在底物上的吸附，木質(zhì)素的存在則會增加底物的疏水性[36]。此外，木質(zhì)素表面的疏水基團還會與纖維素酶結(jié)構中芳香性氨基酸的殘基進行結(jié)合，導致木質(zhì)素對纖維素酶的不可逆吸附[18]。Yu等[37]在研究糠醛殘渣木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附時發(fā)現(xiàn)，綠液與過氧化氫或乙醇預處理可通過增加木質(zhì)素的親水性來減少纖維素酶和β-葡萄糖苷酶在木質(zhì)素上的吸附。Huang等[38]研究有機溶劑木質(zhì)素對酶水解的抑制作用時發(fā)現(xiàn)，降低木質(zhì)素的疏水性能減少木質(zhì)素與酶的相互作用。同樣地，本研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合改性前后木質(zhì)素表面疏水性的大小可知，木質(zhì)素經(jīng)羥丙基磺甲基化改性后，由于木質(zhì)素結(jié)構中酚羥基含量的減少，親水性基團磺酸基的引入，改性后木質(zhì)素表面的疏水性顯著降低，導致木質(zhì)素與纖維素酶之間的作用力減弱，發(fā)生的無效吸附也因此減少。

QCM獲得的頻率數(shù)據(jù)還可以進一步與指數(shù)衰減模型[式(3)]相結(jié)合，建立木質(zhì)素和纖維素酶的吸附動力學方程[39]。由于木質(zhì)素膜表面吸附的酶的質(zhì)量?m與頻率?F還符合Sauerbrey線性方程[40][式(4)]，因此可以計算出纖維素酶在不同木質(zhì)素膜上的最大吸附量和不可逆吸附量。

ΔF=ΔFmax1-e-tτ（3）Δm=-c?Fn（4）

式中，ΔFmax為達到最大吸附量時的頻率，Hz；t為時間，min；τ為吸附速率的倒數(shù)，min；Δm表示吸附質(zhì)量，ng/cm2；c為質(zhì)量敏感常數(shù)，這里取c=17.7ng/(cm2·Hz)；ΔF為頻率，Hz；n為倍頻值，n=3，5，7，9，11，這里取n=3。

表2是纖維素酶在木質(zhì)素薄膜上的吸附參數(shù)，擬合相關系數(shù)R2均達到0.9以上。由表可知，兩種木質(zhì)素對纖維素酶的吸附能力具有明顯的差異，羥丙基磺甲基化木質(zhì)素的吸附速率1/τ低于未改性木質(zhì)素，最大吸附量ΔF也較少，此外，根據(jù)表中的最大吸附量和不可逆吸附量可知，纖維素酶在羥丙基磺甲基化木質(zhì)素薄膜上的解吸量更多，達到43.1ng/cm2。表明羥丙基磺甲基化木質(zhì)素高負電性、低疏水性的特點使得其與纖維素酶之間的吸附疏松，作用較弱，對纖維素酶的吸附能力較低。

表2纖維素酶在木質(zhì)素薄膜上的吸附參數(shù)

Table2Adsorptionparametersofcellulaseonligninfilms

樣品-ΔFmax/Hz（1/τ）/min-1R2最大吸附量/（ng/cm2）不可逆吸附量/（ng/cm2）解吸量/（ng/cm2）木質(zhì)素膜57.810.0640.92341.1311.929.2羥丙基磺甲基木質(zhì)素膜50.590.0530.95298.5255.443.1新窗口打開|下載CSV

纖維素酶在木質(zhì)素薄膜上的吸附過程也可以用ΔD-ΔF的函數(shù)表示，這種表示方法消除了時間參數(shù)，能夠直接比較ΔD和ΔF的比值。較低的ΔD/ΔF值表示隨著質(zhì)量的增加耗散沒有顯著的增加，這是一個剛性薄膜的特征；相反，若ΔD/ΔF值較大，則表示薄膜較柔軟[41]。

圖6是纖維素酶在木質(zhì)素薄膜吸附過程中ΔD、ΔF的變化。木質(zhì)素和羥丙基磺甲基木質(zhì)素薄膜的ΔD/ΔF值分別為0.05845、0.0757，說明纖維素酶在改性木質(zhì)素薄膜上的吸附表現(xiàn)出較大的黏彈性，結(jié)構疏松，酶與木質(zhì)素之間的作用力弱，很容易從底物木質(zhì)素上脫附，進一步表明羥丙基磺甲基化木質(zhì)素能夠減少與纖維素酶之間的非生產(chǎn)性吸附。

圖6

圖6纖維素酶在木質(zhì)素薄膜吸附過程中ΔD隨ΔF的變化

Fig.6Changeofdissipation(ΔD)versusfrequency(ΔF)