不同水稻品種種子萌發(fā)特性及其與熱穩(wěn)定蛋白的關(guān)系

所謂的“種子超干”是將成熟種子的含水量降至通常的安全含量以下（5%7%）。目前對超干種子在室溫條件下貯藏可延長種子壽命的效果已基本取得共識。近年來的研究表明不同類型的正常型種子其耐超干的能力即耐脫水性存在差異,油料種子耐超干的能力強,它可忍耐極度的脫水,當種子含水量降低到2%以下種子活力不受影響,且耐藏性提高;淀粉類種子的耐脫水性在種間差異很大,如高粱、小麥、大麥種子耐脫水性較強,而水稻種子和大豆種子的耐脫水性在品種間存在較大的差異。Vertucci和Farrant指出種子耐脫水性可能是一種數(shù)量性狀,與種子內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物的積累呈正相關(guān)。Blackman等指出胚或胚軸在發(fā)育過程中獲得耐脫水性時已經(jīng)積累了一定量的包括貯藏蛋白質(zhì)在內(nèi)的熱穩(wěn)定蛋白,熱穩(wěn)定蛋白積累與種子耐脫水性呈正相關(guān)。但是有關(guān)種子成熟后的進一步脫水耐性以及在不同類型或同一類型不同種、品種之間這種脫水性存在差異性的原因及機理不清楚,至今未見報道。本文報道以秈稻、粳稻、雜交稻為材料,不同水稻品種種子的耐超干性差異及其與熱穩(wěn)定蛋白的關(guān)系,為闡明種子耐超干的機理奠定理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試驗材料供試驗用材料為不同品種的水稻(Oryzasativa),見表1,均為1999年收獲的種子。1.2種子含水量和活力指數(shù)的測定采用硅膠干燥法,參照程紅焱等的方法。將水稻種子置于尼龍網(wǎng)袋中,埋于干燥器內(nèi)的硅膠中,硅膠與種子重量比為10∶1,20℃下脫水干燥,每天更換經(jīng)120℃烘干冷卻后的干硅膠。每隔一定時間稱重,以制備不同含水量種子,將種子密封于雙層鋁泊袋中室溫保存。種子含水量的測定按常規(guī)方法,參照參考文獻。以發(fā)芽率和活力指數(shù)的大小表示種子的耐超干力差異。種子發(fā)芽前進行回水處理,具體參照朱誠等的方法。以胚根長至種子長的1/2定為發(fā)芽,重復3次。發(fā)芽指數(shù)(GI)=Σ(Gt/Dt);活力指數(shù)(VI)=GI×Sx。Gt:t天后的發(fā)芽數(shù),Dt:發(fā)芽天數(shù),Sx:發(fā)芽x天后的鮮苗平均重量。1.3-me、pmsf-sds-1、me-1,10.1%甘油-3-甲基苯磺酸酯cmf的制備取去殼含胚的半粒種子,于冷丙酮中研磨成粉,脫脂過濾,所得脫脂粉風干備用。熱穩(wěn)定蛋白的提取參照Blackman等和楊曉泉等的方法,略加修改。160mg胚軸或脫脂粉,加入600μL預冷的提取緩沖液(50mmol/LpH8.0Tris-HCl、500mmol/LNaCl、10mmol/L2-ME、1mmol/LPMSF),4℃冰浴研磨,10000×g冷凍離心20min,吸取上清液。沉淀再加入200μL提取緩沖液提取一次,合并上清液。取上清液于100℃水浴中煮沸10min,立即在冰浴中冷卻15min,10000×g離心10min,取上清液加入4倍體積的冷丙酮(-20℃),于-20℃過夜沉淀蛋白,然后10000×g離心10min收集沉淀,貯于-20℃,用于電泳分析。取蛋白質(zhì)沉淀加入200uL樣品緩沖液(含50mmol/LpH6.8Tris-HCl、2%SDS、10%甘油、5%2-ME、0.1%溴酚藍),100℃水浴3min,每泳道上樣30μL,標準蛋白質(zhì)分子量范圍為14.4～97.4kD。凝膠的制備具體方法參見文獻,濃縮膠的濃度為3%,分離膠的濃度為12%,采用恒壓電泳,濃縮膠70V,分離膠150V。2結(jié)果與分析2.1種子發(fā)芽率和活力指數(shù)由表2可見,當種子含水量降至4.5%左右時,粳稻品種春江15和春江683的發(fā)芽率和活力指數(shù)均極顯著地降低,而中香糯、雜交稻、秈稻J106和J174的種子發(fā)芽率和活力指數(shù)沒有影響;當種子含水量降至3.5%左右時,中香糯、雜交稻、秈稻J106和J174的種子發(fā)芽率沒有下降,但是中香糯和雜交稻種子的活力指數(shù)與對照相比分別呈顯著和極顯著降低。這一結(jié)果表明,秈稻品種(J174、J106)種子的耐超干能力強,粳稻品種(春江15、春江683)種子的耐超干能力差,而中香糯和雜交稻處于兩者之間,說明不同水稻品種間的耐脫水性存在較大的差異,在進行種子超干時要特別小心。2.2雜交稻和硝化稻種子電泳圖譜相比較由圖1可見,不耐超干的粳稻品種春江15和春江683種子與耐超干的中香糯、雜交稻和秈稻品種J106及J174的種子熱穩(wěn)定蛋白的SDS電泳圖譜相比較,兩者之間有明顯差異,主要表現(xiàn)在分子量為31～43kD的范圍內(nèi),中香糯、雜交稻和秈稻均有一條36.3kD的特異性蛋白條帶,而春江15和春江683種子則無。圖2顯示,當粳稻、中香糯、雜交稻和秈稻種子含水量從11%左右降低到3.5%左右時,該特異性蛋白條帶差異仍然存在。圖3顯示,該36.3kD的蛋白條帶在種子胚根突破種皮時也不消失。這表明水稻種子品種間的耐脫水性差異與該種子中是否存在特異蛋白質(zhì)有一定的關(guān)系。3種子熱穩(wěn)定蛋白的差異本實驗的結(jié)果表明,供試的粳稻品種春江15和春江683耐超干能力差,而秈稻、中香糯和雜交稻種子的耐超干能力較強,其中秈稻品種J106和J174的種子耐超干能力最強。近年來,對種子耐干機制的研究已從胚或胚軸脫水保護物質(zhì)如胚胎發(fā)生后期富集蛋白(LEA蛋白)、熱激蛋白與可溶性糖類等方面進行探討。從本實驗的不同水稻品種種子的熱穩(wěn)定蛋白SDS電泳譜帶分析表明,中香糯、雜交稻和秈稻品種與粳稻品種春江15、春江683比較,兩者之間存在明顯的蛋白質(zhì)譜帶的差異,前者具有一特異性的蛋白質(zhì)條帶,分子量為36.3kD,而后者無此條帶,這種差異性恰好與這些品種的耐超干能力強弱相一致,并且該蛋白質(zhì)條帶不隨種子吸脹萌發(fā)而消失?？梢酝茰y這一特異性的熱穩(wěn)定蛋白(36.3kD)可能與種子的耐超干力相關(guān)。Blakman等和Bradford等已證實許多正常型種子在貯藏物質(zhì)積累后期合成一類特殊的LEA蛋白,其水溶性和熱穩(wěn)定性可能與種子的耐脫水性有關(guān),該類蛋白質(zhì)的分子量大多數(shù)在10～30