蔗糖密度梯度離心法和差速離心法提取的臍帶間充質干細胞來源外體的比較

間充質干細胞（msc）的存在對損傷恢復的影響日益受到關注。本課題組的前期研究表明,人臍帶間充質干細胞來源的外體(hucMSC-Ex)能修復四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化以及順鉑誘導的急性腎損傷,但究竟何種蛋白質成分起關鍵作用尚不清楚。近年來,用質譜法對外體進行蛋白質組學分析的技術已得到飛速發(fā)展,為了得到準確、可靠的結果,要求樣品必須有較高的純度和濃度。研究表明,許多高豐度蛋白質的存在必然會干擾一些功能性小分子蛋白質的分離和鑒定,因此,通過改進提取方法以獲得更純的hucMSC-Ex具有重要意義。本研究主要對常用的蔗糖密度梯度離心聯(lián)合超濾超速離心法(以下簡稱蔗糖密度梯度離心法)和差速離心法提取的hucMSC-Ex進行比較,旨在為hucMSC-Ex的基礎與臨床應用提供實驗依據。1材料和方法1.1免疫、定量分析試劑人臍靜脈內皮細胞(EA.hy926)購自中國科學院細胞庫;低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司),無血清培養(yǎng)基(上海依科賽公司),重水(D2O,上海創(chuàng)賽公司),分析純蔗糖(廣州化學試劑廠),兔抗人CD9抗體(美國BioworldTechnology公司),兔抗人CD81抗體(美國Epitomics公司),BCA蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗(北京康為世紀公司),預混HRP化學發(fā)光底物、100-kDaMWCO超濾離心管、0.22μm無菌濾膜(美國Millipore公司),氯甲基苯甲酰氨熒光染料(CM-DiI,美國MolecularProbes公司),hoechst33342染料(美國Sigma公司);超速冷凍離心機(OptimaL-90K,美國BeckmanCoulter公司),透射電子顯微鏡(FEITecnai12,Philips公司),全自動凝膠成像儀(北京賽智公司),二氧化碳培養(yǎng)箱、高內涵分析儀(美國ThermoScientific公司)。1.2hummc的分離和訓練采用本實驗室已建立的方法分離培養(yǎng)及鑒定hucMSC,分離出的hucMSC于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。1.3外體分離和外體分離選擇生長狀態(tài)良好的3~5代hucMSC用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待細胞融合至70%~80%時換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),48h后收集培養(yǎng)上清液,300×g離心10min以去除漂浮的活細胞,用于外體的分離。1.4hummc-ex分離1.4.1蔗糖/重水質糖液的濃縮參照Zhu等的方法并加以改進。將收集的hucMSC上清液于4℃、2000×g離心10min,以去除細胞碎片;收集上清后于4℃、10000×g離心30min,以去除細胞器;將上清液轉移至100-kDaMWCO超濾離心管,4℃、1000×g離心30min進行濃縮;將濃縮液緩慢移至5mL30%蔗糖/重水密度墊(ρ=1.210g/cm3),4℃、100000×g離心3h;收集底部5mL蔗糖/重水層(含外體),用PBS稀釋后加入100-kDaMWCO超濾離心管中,4℃、1000×g離心30min,PBS洗滌3次;最后用0.22μm無菌濾膜過濾除菌,分裝后于-70℃保存,并用BCA蛋白質定量試劑盒進行蛋白質定量檢測。1.4.2離心液的制備參照Clotilde等方法,將收集的hucMSC上清液于4℃、2000×g離心10min,以去除細胞碎片;收集上清液后于4℃、10000×g離心30min,以去除細胞器;將上清液用0.22μm無菌濾膜過濾除菌后直接置4℃、100000×g離心3h;棄上清液,沉淀用無菌PBS重懸后,置4℃、100000×g離心3h;棄上清液,沉淀用無菌PBS重懸,分裝后于-70℃保存,并用BCA蛋白質定量試劑盒進行蛋白質定量檢測。1.5銅網透射電鏡sem觀察取上述兩種方法提取的hucMSC-Ex各20μL,充分混勻后滴加于直徑2mm的載樣銅網上,于室溫靜置5min后,用濾紙輕輕吸去銅網邊緣殘余液體,然后將銅網倒扣于30g/L磷鎢酸(pH6.8)液滴上,室溫下負染5min,最后將銅網在白熾燈下烘干,置于透射電鏡下觀察并拍照。1.6s-東南角電泳將上述兩種方法提取的hucMSC-Ex用15%SDS電泳(80V,90min)分離,取出分離膠,用2.5g/L考馬斯亮藍R-250染色,沸水快速脫色后經全自動凝膠成像儀掃描圖像并分析。1.7免疫兔抗人cd9和cd81的表達配制15%SDS電泳膠,將上述兩種方法提取的hucMSC-Ex充分裂解后加入1/4體積的5×SDS上樣緩沖液,煮沸5min,按200μg蛋白質總量上樣,將蛋白質電轉印(350mA,120min)至PVDF膜上,用含50g/L脫脂牛奶的TBS/0.5%Tween20室溫封閉1h,分別與兔抗人CD9抗體(1∶500稀釋)和兔抗人CD81抗體(1∶500稀釋)于4℃反應過夜,次日用TBS/0.5%Tween20洗膜3次后,與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗37℃溫育1h,TBS/0.5%Tween20洗膜3次后,加入預混HRP化學發(fā)光底物,并用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。1.8細胞表型的制備用親脂性紅色熒光染料CM-DiI按5μL/mL的比例加入上述兩種方法提取的hucMSC-Ex中,充分混勻后于37℃避光溫育30min,然后轉移至100-kDaMWCO超濾離心管,并加入10倍體積的PBS,4℃、1000×g離心30min以洗去未與hucMSC-Ex結合的染料,最終將濃縮液分別加入臍靜脈內皮細胞EA.hy926中,37℃溫育4h后,PBS洗滌2次,再用4%多聚甲醛固定細胞20min,hoechst33342(1∶200稀釋)染細胞核10min,高內涵分析儀上觀察并拍照。2結果2.1膜性囊泡結構透射電鏡下可見兩種方法提取的hucMSC-Ex均具有典型的圓形或橢圓形的膜性囊泡結構,直徑約為30~100nm,腔內為低電子密度成分(圖1)。2.2差速離心法分離細胞外解蛋白的檢測SDS和westernblot檢測結果顯示,兩種方法提取的hucMSC-Ex內均含有多種蛋白質成分,并且均表達外體的標志蛋白CD9和CD81(圖2A),而差速離心法中經2000×g處理的沉淀(即細胞碎片)和100000×g處理的上清液(去除外體成分)均未檢測出外體的標志蛋白(圖2B)。相同濃度條件下,差速離心法提取的hucMSC-Ex其表面標志比蔗糖密度梯度離心法表達更強,但高豐度蛋白質(Mr:55000~70000)含量卻明顯低于蔗糖密度梯度離心法(圖2A),從圖2B中可見100000×g處理的上清液中含有大量高豐度蛋白質,可以推測這些高豐度蛋白質主要來源于無血清培養(yǎng)基的污染。2.3標記和內部控制3不同分離方法的比較外體是一種由胞內多胞體(multivebodies,MVB)與胞膜融合后分泌到細胞外環(huán)境中的膜性小囊泡,其主要特征有:(1)直徑約30~100nm;(2)密度為1.13~1.19g/cm3;(3)具有來源細胞胞質、胞膜成分以及外體相關標志性蛋白,如CD9、CD81等,在細胞與細胞間通訊中起到非常重要的作用。研究表明,MSC來源的外體能有效改善心肌缺血/再灌注損傷以及急、慢性腎損傷和肝纖維化。因此,有望成為一種新的非細胞成分用于組織損傷的修復。蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)外體的蛋白質組成比較復雜,且不同細胞來源的外體其蛋白質組成亦有較大差異,這賦予了外體復雜的生物學功能。在蛋白質組學分析中,高豐度蛋白質的存在會掩蓋很多功能性小分子蛋白質的檢出,對實驗結果的準確性造成嚴重干擾,所以,我們的樣品必須符合純度高、高豐度蛋白質含量盡可能少的標準,此外,還要考慮操作簡便,成本低廉等實際因素。因此,尋找符合上述條件的提取外體的方法非常重要。目前,去除高豐度蛋白質的方法主要有免疫親和層析法、有機溶劑沉淀法和超濾離心法等。免疫親和層析法的去除專一性強、去除效率高,一次可以去除多種高豐度蛋白質,但該方法成本較高,且操作繁瑣;有機溶劑沉淀法雖然成本低廉、操作簡單,但是有機溶劑在沉淀高豐度蛋白質的同時會將部分低豐度蛋白質一同沉淀下來,因此特異性不高;超濾離心法可根據高豐度蛋白質的分子量選擇合適的MWCO超濾膜,并借助離心力作用有效去除高豐度蛋白質,但是該法在截留高豐度蛋白質的同時還會截留某些分子量大于高豐度蛋白質的功能性蛋白質。由此觀之,以上方法在去除高豐度蛋白質的同時都或多或少導致部分功能性低豐度蛋白質的丟失,都不適用于外體中高豐度蛋白質的去除。外體是活細胞分泌的一種多因子復合體,研究表明,超高速(100000×g)離心能夠有效的將外體分離沉淀,利用外體的這一特點可以將其與培養(yǎng)上清液中其他可溶性蛋白質有效地分離,因此,比較外體不同提取方法具有重要意義。本研究中,我們分別用蔗糖密度梯度離心法和差速離心法成功提取了hucMSC-Ex,發(fā)現(xiàn)在相同蛋白質濃度下,差速離心法提取的hucMSC-Ex其表面標志物的表達量明顯強于蔗糖密度梯度離心法,相同時間內外體進入靶細胞的數(shù)量也明顯多于蔗糖密度梯度離心法,但高豐度蛋白質含量卻大大降低,說明差速離心法提取的hucMSC-Ex較蔗糖密度梯度離心法更純,相同作用時間內前者在靶細胞中發(fā)揮的生物學效應也有可能更強,因此,在進行功能實驗時差速離心法提取的hucMSC-Ex的作用效果更具有代表性。綜上所述,差速離心法既能最大限度地去除不需要研究的高豐度蛋白質,同時又不影響外體的生物學活性及其包含的功能性低豐度蛋白質的含量,且操作簡便、成本低廉、重復性好,不僅可以滿