乳蛋白水解液中多肽含量的快速測(cè)定

牛奶蛋白是優(yōu)良動(dòng)物蛋白的來(lái)源。乳蛋白在酶的作用下降解,可釋放出很多具有功能性的短肽,如二肽、三肽,其吸收的速度比同一組成的氨基酸快。目前已從發(fā)酵乳中分離出具有功能性的短肽,如抗高血壓肽(VPP和IPP)。因此,來(lái)源于蛋白質(zhì)水解的肽成為當(dāng)今研究的熱門(mén)課題之一。在水解蛋白質(zhì)的過(guò)程中,控制蛋白質(zhì)的水解程度,盡可能少地產(chǎn)生氨基酸,盡可能多地得到目標(biāo)產(chǎn)物多肽,是水解的根本目的。這就要求建立一種能快速測(cè)定水解液中多肽含量的有效方法。對(duì)于測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度有多種方法,三氯乙酸法是常用的一種方法,它是利用三氯乙酸沉淀水解液中的大分子蛋白質(zhì),繼而以微量凱氏定氮法測(cè)定上清液中可溶性氮的含量,然后減去水解之前樣品溶液中可溶性氮的含量,再與樣品中的總氮量相比,從而確定其水解程度。此法中微量凱氏定氮法測(cè)定的是水解液中可溶性總氮的含量,若改用雙縮脲法,便可測(cè)定其中含2個(gè)(包括2個(gè))以上肽鍵的多肽的含量。本文利用10%的三氯乙酸沉淀樣品水解液中的大分子蛋白質(zhì),經(jīng)離心過(guò)濾后,在上清液中加入雙縮脲試劑,于310nm測(cè)定其OD值,繼而在谷胱甘肽三肽標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品中的多肽含量。從而建立了一種快速測(cè)定乳蛋白水解液中多肽含量的有效方法。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)室、標(biāo)準(zhǔn)品米曲霉:陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室;鮮牛乳:市售;谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品:北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司;CuSO4·5H2O、三氯乙酸等:分析純。1.2儀器和水浴鍋UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼柯(上海)分析儀器公司;LD5-2A型低速離心機(jī):常州國(guó)華電器有限公司;HH-2型超級(jí)恒溫水浴鍋:上海浦東物理光學(xué)儀器廠;BS224S型電子分析天平:北京賽多利斯天平有限公司;1.3測(cè)量1.3.1吸收光譜法的測(cè)定取2mg/mL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,加入雙縮脲試劑,在300~800nm范圍內(nèi)掃描,得到其吸收光譜曲線。1.3.2空白樣的測(cè)定取1mg/mL的谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,分別加入2、3、4、5、6mL雙縮脲試劑,定容至10mL,分別做空白樣對(duì)照,測(cè)OD值。1.3.3空白樣的測(cè)定取1mg/mL的谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,加入雙縮脲試劑,定容至10mL,放在30、40、50、60、70℃水浴5min,分別做空白樣對(duì)照,測(cè)OD值。1.3.4空白對(duì)照研究取1mg/mL的谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,加入雙縮脲試劑,定容至10mL,放在25、30、35℃水浴鍋中,分別做空白對(duì)照,測(cè)OD值。1.3.5固相前后雙縮哌試劑法取2.5mL樣品溶液,加入2.5mL10%(w/v)的三氯乙酸(TCA)水溶液,于漩渦混合儀上混合均勻,靜置20min,然后在3500r/min下離心10min。然后取1.0mL上述溶液置一試管中,加入雙縮脲試劑3.0mL(樣液∶雙縮脲試劑=3∶2,v/v),于漩渦混合儀上混合均勻,60℃水浴顯色5min,2000r/min離心10min。取上清液于310nm下測(cè)定OD值,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的多肽濃度C(mg/mL),進(jìn)而可求得樣品中多肽含量。2結(jié)果與討論2.1圍內(nèi)掃描結(jié)果將GSH標(biāo)準(zhǔn)品用雙縮脲試劑顯色,在300~800nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1知,最大吸收波長(zhǎng)在585nm和310nm處,在310nm處時(shí)最大吸收波長(zhǎng)是0.187,585nm處為0.097,所以選310nm波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。2.2雙縮蝽試劑加量?jī)?yōu)化取1mg/mL的谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,分別加入2、3、4、5、6mL雙縮脲試劑,定容至10mL,OD值隨雙縮脲試劑加量變化情況見(jiàn)圖2。由圖2可知,可能由于隨加入量的增多體積變大使標(biāo)樣濃度降低,所以O(shè)D值反而下降。加入量為3mL雙縮脲試劑為最好,試劑與標(biāo)樣反應(yīng)充分。2.3溫度對(duì)od值的影響取1mg/mL的谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,加入3mL雙縮脲試劑,定容至10mL,放在30、40、50、60、70℃水浴5min,OD值隨溫度變化情況見(jiàn)圖3。由圖3可知,溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響比較顯著,反應(yīng)的速率常數(shù)隨溫度的升高而很快增大。在60℃時(shí)為最高,高于60℃,溫度對(duì)反應(yīng)速率有抑制作用。故60℃水浴為最好。2.4雙縮蝽試劑對(duì)od值的影響取1mg/mL的谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,加入3mL雙縮脲試劑,定容至10mL,放在25、30、35℃水浴鍋中,OD值隨室溫變化情況見(jiàn)圖4。由圖4可知,60℃水浴后放置在室溫25~35℃范圍內(nèi)OD值幾乎無(wú)變化,穩(wěn)定時(shí)間為80min。2.5固相色譜法測(cè)定od取谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.8mg/mL),依次吸取上述溶液0、1、2、3、4、5mL置于6支試管中,分別加3mL雙縮脲試劑,用蒸餾水定容至10mL,60℃水浴顯色5min,水浴期間不停地振蕩,然后冷卻至室溫(25~35℃),于310nm下測(cè)定OD值(以第1管做空白對(duì)照)。以肽濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL),OD值為縱坐標(biāo)Y,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5),得到回歸方程y=0.3789x+0.0024,R2=0.9966。2.6甘肽三肽溶液的測(cè)定配制0.28mg/mL的谷胱甘肽三肽水溶液,按程序測(cè)定其中多肽含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,結(jié)果見(jiàn)表1,回收率為92.8%~100%。2.7精密度和標(biāo)準(zhǔn)偏差配制0.4mg/mL的谷胱甘肽三肽水溶液,按相同程序進(jìn)行3輪平行測(cè)定,以檢驗(yàn)測(cè)定程序的精密度,結(jié)果見(jiàn)表2。精密度Sw=(∑Si2/n)1/2為0.0208(n為測(cè)定輪數(shù)),標(biāo)準(zhǔn)偏差Cv=((Sw/x)×100)(x為測(cè)定平均值)為5.3%,平均值為0.39mg/mL。注:xi1和xi2為平行測(cè)定值,Si2為方差。3在乳液中，對(duì)氨基乙酸鈉的分析3.1甘肽三肽水溶液成分配測(cè)定用鮮乳配制2mg/mL的谷胱甘肽三肽水溶液,按標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)定其中多肽含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果見(jiàn)表3,回收率為92.5%~102.5%。3.2方法的精密度配制2mg/mL的谷胱甘肽三肽水溶液,按相同程序進(jìn)行3輪平行測(cè)定,以檢驗(yàn)測(cè)定程序的精密度,結(jié)果見(jiàn)表4。精密度Sw=(∑Si2/n)1/2為0.0938(n為測(cè)定輪數(shù)),標(biāo)準(zhǔn)偏差Cv=((Sw/x)×100)(x為測(cè)定平均值)為4.78%,平均值為1.96mg/mL。注:xi1和xi2為平行測(cè)定值,Si2為方差。3.3米曲霉的水解量取50mL滅菌鮮乳,然后加入粗酶液10mL(酶液制備:滅菌的鮮乳30mL,米曲霉接種量6%,溫度28℃,轉(zhuǎn)速180r/min,培養(yǎng)6d)于溫度45℃、自然pH下進(jìn)行水解。每隔1d