實驗十五血清測定（賴氏法）【目的】了解血清 活性測定的原理及測定方法。掌握血清 活性測定的臨床意義?！驹怼勘彼崤ca-酮戊二酸在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（）的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。在反應(yīng)到達(dá)規(guī)定時間時，加入2，4-二硝基苯肼-鹽酸溶液以終止反應(yīng)。生成的丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。后者在堿性條件下顯棕紅色。根據(jù)顏色的深淺，求得血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活力。反應(yīng)式如下：丙氨酸 a-酮戊二酸C二 H^y --丙氨酸 a-酮戊二酸C二 H^y ---丙酮酸 2，4-二硝基苯肼【器材】試管、刻度吸管、恒溫水浴箱、分光光度計。耗材：血清，座標(biāo)紙等?！驹噭苛姿猁}緩沖液（ ）稱取磷酸氫二鈉 , ，磷酸8水溶解并稀釋至 。丙酮酸 谷氨酸C丙酮酸-2，4-二硝基苯腙（紅棕色）g鉀 O ，加少量蒸餾底物液稱取a-酮戊二酸丙氨酸于燒瓶中，加磷酸鹽緩沖液 煮沸溶解后冷卻，用磷酸鹽緩沖液在容量瓶內(nèi)加至沖液 煮沸溶解后冷卻，用磷酸鹽緩沖液在容量瓶內(nèi)加至,混勻，加氯仿數(shù)滴，置冰箱可保存數(shù)周。丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（|J）容量瓶中，加 磷酸鹽緩沖液鹽酸 溶解后，加蒸餾水至精確稱取丙酮酸鈉 于容量瓶中，加 磷酸鹽緩沖液鹽酸 溶解后，加蒸餾水至至刻度。約.，|約-二硝基苯肼溶液稱取I二硝基苯肼 8用置棕色瓶內(nèi)，冰箱保存。溶液稱取 溶于適量蒸餾水中，然后稀釋至【操作】取|支試管按下表操作：表血清測定（賴氏法）操作步驟加入物（） 測定管 對照管血清TOC\o"1-5"\h\z底物液 一混勻，置水浴，保溫分鐘|，約－二硝基苯肼 0.5 0.5底物液 一混勻，置水浴，保溫分鐘混勻，靜置分鐘，用 波長比色，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度，用測定管吸光度值減去對照管吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得 活力單位。【標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制】見下表：表血清測定（賴氏法）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作步驟管號加入物（l 0 1 | 3約5丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（M/底物液磷酸鹽緩沖液混勻，置 水浴，保溫分鐘－二硝基苯肼混勻，置水浴，保溫|混勻，置水浴，保溫|0分鐘相當(dāng)于單位混勻，靜置分鐘，用 波長比色，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度，將各管吸光度值減去“0”號管吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，各管相應(yīng)的酶活性單位為橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。【正常參考范圍】?卡門氏單位賴氏法的酶活力單位是根據(jù)本法中丙酮酸量及其吸光度值與卡門氏單位的對等關(guān)系，套用卡門氏單位而來?？ㄩT氏單位的定義是：血清，反應(yīng)液總量，反應(yīng)溫度℃,波長0比色杯光徑，每分鐘吸光度減少 為一個卡門氏單位。【臨床意義】主要存在各組織細(xì)胞中，以肝細(xì)胞中含量最多，正常情況下只有極少量釋放入血，血清中活性很低。當(dāng)肝細(xì)胞病變、壞死或肝細(xì)胞膜通透性增加時，可大量釋放入血，使血中該酶的活性顯著升高，故此酶是判斷肝細(xì)胞損傷的一個常用的指標(biāo)。急性肝炎、藥物中毒性肝細(xì)胞壞死時，血清活性明顯升高；肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗死時，血清活性中度升高；阻塞性黃疸、膽管炎時，血清活性輕度升高?！窘Y(jié)果及分析】