電子克隆及序列分析第1頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是電子克隆拼圖游戲一樣的原理應用操作過程優(yōu)點與缺點的討論現(xiàn)狀與展望

內(nèi)容第2頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是電子克隆Watson&Crick成功解析了DNA分子二級結(jié)構，開創(chuàng)了分子生物學時代KarryMullis發(fā)明了PCR反應，體外大規(guī)模、有目的和快速地克隆目標基因成為可能信息科學技術特別是數(shù)據(jù)庫技術在戰(zhàn)后飛速發(fā)展第3頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是電子克隆表達序列標簽（expressedsequencetags，EST）是對某個基因cDNA克隆測序所得的部分序列片段，長度大約為200~600bp由于基因表達調(diào)控作用不同，同一個基因的mRNA剪接位點和方式不同，所以同一個基因的全長cDNA可能包含多個ESTEST既代表了基因cDNA的某一區(qū)段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式第4頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是電子克隆電子克隆技術是生物學數(shù)據(jù)庫中EST數(shù)據(jù)庫、核酸序列數(shù)據(jù)庫、基因組數(shù)據(jù)庫，采用同源性序列比對和歸類分析、重疊區(qū)域組裝和拼接等方法延長EST序列，直至沒有與之同源的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認為是相對應基因的全長cDNA，根據(jù)所得的cDNA序列設計囊括開放閱讀框兩端的引物，進行RT-PCR克隆出相應基因的方法

第5頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是電子克隆傳統(tǒng)的克隆方法是利用基因特異性引物大量擴增cDNA末端或構建cDNA文庫并采用原位雜交進行篩選，實驗進程長、步驟繁瑣、成本高、得率低；運用電子克隆的方法延伸得到的cDNA幾乎囊括了所有疑似為目的基因的cDNA序列，無論表達轉(zhuǎn)錄如何調(diào)控，都能通過PCR擴增出表達的那一段基因傳統(tǒng)的方法如同小規(guī)模地捕撈一條或幾條魚，電子克隆與之相比就如同集約化地捕撈一群魚第6頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月拼圖游戲一樣的原理

相近的物種在核酸序列上有相似性，相近物種中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列可代表程度與兩序列的相似度直接相關，加之遺傳密碼的簡并性，這種混同在理論上是可行的，但需要作同源性檢驗以克服主觀因素的影響第7頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月拼圖游戲一樣的原理借助計算機找到具有相同或相似圖案的圖塊，拼成完整的圖案，我們需要做的是進行局部的微調(diào)。剩下的工作就是對拼接出的cDNA進行可能的開放閱讀框的分析，設計囊括開放閱讀框兩端的引物，RT-PCR擴增侯選基因第8頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月應用電子克隆主要應用于兩個方面：一個是利用EST序列檢索同源性序列，并由此拼接cDNA序列以期挖掘新基因另一方面是在全基因組已經(jīng)測序的物種中，研究整個基因組序列以推測其中可能尚未發(fā)現(xiàn)的基因目前應用比較廣泛的是第一方面

第9頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月應用數(shù)據(jù)庫查詢數(shù)據(jù)庫比對文件下載序列分析序列裝配分子模型結(jié)構分析功能分析第10頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月應用在全基因組已經(jīng)測序的物種中推測新基因的步驟如下：分析和定位開放閱讀框虛擬翻譯并對多肽鏈序列檢索比對可靠性檢查分析與之相關的調(diào)控序列

第11頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月如何做拼圖游戲基于EST的電子克隆基于Unigene的電子克隆第12頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）基于EST的電子克隆1.確定探針序列(電子克隆的基因)（1）以已知物種的基因序列為探針，這個基因可能在這個物種上沒有被測序。（2）已已經(jīng)測序得到的一段EST為探針。如:以小鼠Alox12mRNA為探針,電子克隆牛的Alox12基因第13頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月2.搜索同源的ESTs,并下載到本地，成為*.SEQ文件格式采用Blast在線根據(jù)搜索與探針相似性高（>80％）的大量ESTs，/Blast.cgi

（一）基于EST的電子克隆第14頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月3.拼接采用DNASTAR6.0的Seqman程序進行。注意：對序列進行末段修剪去掉冗余部分。（一）基于EST的電子克隆第15頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月3.拼接采用DNASTAR6.0的Seqman程序進行。注意：序列剔除，以提高準確性。4.保存contig序列。5.重復：以4中的contig為探針，重復步驟2，3，4。直到不能在延伸為止。（一）基于EST的電子克隆第16頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）基于UNIGENE的電子克隆1.確定探針序列（1）以已知物種的基因序列為探針，這個基因可能在這個物種上沒有被測序。（2）已已經(jīng)測序得到的一段EST為探針。第17頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月搜索同源的ESTs,選擇同源性比分最高的一條EST序列。從NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫中進行檢索，得到相應的UniGene編號?？梢詫⑴cUniGeneCluster的所有核酸序列下載到本地，利用Seqman或其他的序列裝配軟件進行組裝，形成較長的新生序列。（二）基于UNIGENE的電子克隆第18頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月常用軟件及網(wǎng)絡資源簡介

DNAStar是一款電子克隆中常用的軟件包，它以功能全面和強大而著稱，它主要包括以下幾個應用程序：EditSeq、GeneMan、GeneQuest、MapDraw、MegAlign、PrimerSelect、Protean、和SeqManII第19頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月常用軟件及網(wǎng)絡資源簡介EditSeq是輸入并且修剪DNA或蛋白質(zhì)序列的工具。EditSeq能讀取大部分的序列格式，也可以通過使用鍵盤輸入，或者從其他地方復制、粘貼得到。序列被打開后，EditSeq能使用標準或者指定的遺傳密碼進行翻譯或反翻譯、尋找開放讀框以及進行閱讀校對

第20頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點與缺點的討論與傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，電子克隆有以下的優(yōu)點：簡便快速，成本低廉，設備簡單對操作人員技術要求不高成功率高第21頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點與缺點的討論盡管電子克隆在理論上已沒有什么障礙，然而在實際操作中依然存在些不足之處：電子克隆得到的cDNA序列是由計算機虛擬出來的，現(xiàn)實中可能并不存在研究人員不可完全迷信軟件提供的結(jié)果，最好對分析做人工可靠性驗證普遍適用性較差電子克隆后需要研究其指導合成的蛋白質(zhì)的功能才更有實際意義第22頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)狀與展望

國外的科研人員做了許多有益的貢獻，特別是水稻、擬南芥等全基因組測序完成后，借助軟件分析，從中發(fā)現(xiàn)和克隆了一系列全新的基因我國的研究人員也進行不少的具有建設性和創(chuàng)造性的探索和嘗試，也取得了令人鼓舞的成果第23頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)狀與展望隨著科學技術的不斷發(fā)展，以及數(shù)據(jù)庫準確性的逐漸提高，電子克隆的兩大制約因素，輔助設計軟件和數(shù)據(jù)庫將日臻完善，電子克隆技術將日趨成熟。電子克隆技術有可能從根本上改變?nèi)藗儗εc基因克隆的看法，改變基因克隆長久以來沿用的策略，改變科研人員關注焦點，促使研究人員致力與生物大分子的功能，以更好的造福于全人類第24頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月電子克隆序列的序列分析鑒定電子克隆的準確性：序列同源性比對（不同物種多序列比對）進化樹構建:DNAMAN;CLUSTAL-W軟件堿基含量分析:DNASTAR6.0EDITSEQ限制性酶切位點分析ORF預測：/gorf/gorf.html

基因的電子表達譜預測:UNIGENE第25頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月電子克隆序列的生物信息學分析DNA序列查找基因的電子定位:與基因組比對?；蚪Y(jié)構預測：r.it/sun/webgene//

外顯子/內(nèi)含子切割位點分析啟動子預測:/seq_tools/promoter.html

啟動子區(qū)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點:.sg/tres/

Cpg島預測:http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html

第26頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）CpGProD(CpGIslandPromoterDetection)，CpG島啟動子鑒定，是一款專注于預測哺乳動物CpG島相關啟動子序列的程序。可以下載下來運行:http://pbil.univ-lyonl.fr/software/cpgprod_query.html

（2）DragonPromoterFinder啟動子預測工具，適用于預測脊椎動物啟動子，支持多種序列格式，多參數(shù)可選。.sg/promoter/promoter1_5/DPF.hm（3）McPromoter,MarkovChainPromoterPredictionServer是麻省理工大學開發(fā)的真核生物(主要是脊椎動物/果蠅)DNA轉(zhuǎn)錄起始位點預測工具，其目標是盡量精確地預測RNA轉(zhuǎn)錄酶II的啟示轉(zhuǎn)錄位點，需要提供一個Email來接收預測結(jié)果，可以特異的選擇脊椎動物或是果蠅。/generegulation/McPromoter/（4）PromoterScan啟動子區(qū)預測工具，其預測基于比較所提交的序列與真核生物RNA聚合酶II啟動子序列同源性。/mol