高溫高壓加熱受試物對(duì)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的影響

1受試物影響自1975年建立以來，細(xì)菌恢復(fù)突變?cè)嚕ㄒ韵潞?jiǎn)稱ases試驗(yàn)）已在世界范圍內(nèi)廣泛使用。高溫高壓對(duì)含碳水化合物、生物活性成分等類型的受試物影響巨大,經(jīng)過高溫高壓后可能會(huì)產(chǎn)生蛋白變性、生物活性降低或喪失、有效成分揮發(fā)等情況,雖然大部分致畸物(致癌物)化學(xué)性質(zhì)都比較穩(wěn)定,但經(jīng)過高溫高壓后可能會(huì)揮發(fā)、解離或產(chǎn)生構(gòu)型變化。這很可能影響Ames試驗(yàn)對(duì)受試物評(píng)價(jià)的客觀性和科學(xué)性。為了研究高溫高壓滅菌對(duì)評(píng)價(jià)受試物致畸性的影響,本研究采用Ames試驗(yàn)常用陽(yáng)性物為對(duì)象,水及保健食品為基質(zhì)經(jīng)高溫高壓處理后,研究陽(yáng)性物誘導(dǎo)自發(fā)回變的效率變化情況。2材料和方法2.1菌株和標(biāo)準(zhǔn)物0.5mmol/L組氨酸-生物素溶液(誘變實(shí)驗(yàn)用,L-組氨酸購(gòu)自西格瑪,D-生物素溶液購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán));頂層瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂粉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán));底層培養(yǎng)基(瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;磷酸鹽購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán));北京陸橋的營(yíng)養(yǎng)肉湯;美國(guó)millipore的0.22nm無菌濾器;上海治宇醫(yī)療器械有限公司的10mL無菌注射器;美國(guó)康寧的50mL離心管。標(biāo)準(zhǔn)菌株全部來自于MOLTOX,名稱及菌株編號(hào)如下:TA97(4710D)、TA98(4703D)、TA100(4711D)、TA102(4712D);陽(yáng)性物名稱、來源及批號(hào)如下:甲基磺酸甲酯(百靈威、L650043);敵克松(Sigma-Aldrich、SZBDO22xv);1,8-二羥蒽醌(百靈威、LS30N53);2-氨基芴(索萊寶、131B102);疊氮鈉(索萊寶、809B053);2-氨基蒽(Sigma-Aldrich、XTBD3302V)。2.2u3000競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)MS205DU型電子天平(瑞士梅特勒-托勒多國(guó)際有限公司);MLS3780型高壓滅菌鍋(日本三洋電機(jī)公司);1300系列A2級(jí)生物安全柜(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);KB115型生化培養(yǎng)箱(德國(guó)BINDERGmbH公司)。2.3實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)GB15193.4-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》平板摻入法及相關(guān)文獻(xiàn)2.3.1陽(yáng)性物的致突變作用采用TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535為試驗(yàn)菌株,甲基磺酸甲酯、敵克松、疊氮鈉、二氨基蒽、1,8-二羥蒽醌、2-氨基芴6種陽(yáng)性物配制見表1,S9作為體外代謝活化系統(tǒng)。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照,根據(jù)陽(yáng)性物不同為水或二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)。將高壓滅菌后的陽(yáng)性物和經(jīng)濾菌處理的陽(yáng)性物分別摻入菌液并接種平板,觀察2種陽(yáng)性物的致突變作用。每個(gè)濃度做三皿平行,整個(gè)試驗(yàn)在相同條件下進(jìn)行2次,結(jié)果為2次平均值。2.3.2陽(yáng)性物的篩選采用TA97、TA98、TA100、TA102為試驗(yàn)菌株,S9作為體外代謝活化系統(tǒng)。將甲基磺酸甲酯、敵克松、1,8-二羥蒽醌、2-氨基芴4種陽(yáng)性物按表1配制后等體積混合作為陽(yáng)性物。設(shè)原液組、2倍、4倍、8倍稀釋4個(gè)濃度組,同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照(根據(jù)陽(yáng)性物不同為水或DMSO)、推薦陽(yáng)性物組(同表1濾菌陽(yáng)性物組)。將高壓滅菌后的混合陽(yáng)性物和經(jīng)濾菌處理的混合陽(yáng)性物分別摻入菌液并接種平板,觀察2種陽(yáng)性物的致突變效力。每個(gè)濃度做三皿平行,整個(gè)試驗(yàn)在相同條件下進(jìn)行2次,結(jié)果為2次平均值。2.4模擬正常的實(shí)驗(yàn)環(huán)境以無致突變作用的瑪咖片為基質(zhì)3結(jié)果與分析3.1加熱對(duì)不同陽(yáng)性物的誘導(dǎo)突變作用根據(jù)GB15193.4-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》判定受試物有致突變作用時(shí),回變率要增加一倍以上,因此本文采用50%為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn);同時(shí)為了研究加熱對(duì)致畸物的影響,將Ames試驗(yàn)中推薦的陽(yáng)性物直接作為研究對(duì)象,按2.3.1方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3。表3顯示,所有菌的溶劑對(duì)照回變率均在自發(fā)回變范圍內(nèi),不加熱陽(yáng)性物組的自發(fā)回變菌超過陽(yáng)性物回變的最低值;證明本試驗(yàn)體系良好。加熱后除二氨基蒽對(duì)TA1535加S9組的回變率有所增加為119%,其余陽(yáng)性物的回變率均降低。其中最顯著的為敵克松對(duì)TA98的回變率降為9.3%。整體來看,加熱對(duì)陽(yáng)性物的誘導(dǎo)突變作用影響較大,所有陽(yáng)性物加熱后回變率均降低,回變率降至50%以下的占60%。證明加熱對(duì)致突變物的影響顯著。從陽(yáng)性物角度分析,受加熱影響較大的為敵克松、2-氨基芴、甲基磺酸甲酯;而二氨基蒽和1.8-二羥基蒽醌2種陽(yáng)性物熱穩(wěn)定性更好。從代謝活化角度分析,需活化(甲基磺酸甲酯、2-氨基芴)和不需活化(敵克松)不受其影響,沒有明顯區(qū)別。3.2加熱對(duì)不同濃度混合陽(yáng)性物的影響按2.3.2方法進(jìn)行加熱對(duì)不同濃度混合陽(yáng)性物的影響實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4。表4顯示,所有菌的溶劑對(duì)照回變率均在自發(fā)回變范圍內(nèi),推薦陽(yáng)性物組的自發(fā)回變菌超過陽(yáng)性物回變的最低值。加熱后所有濃度混合陽(yáng)性物的回變率均降低,稀釋到4倍時(shí),TA98加熱后不加S9組降低至43.4%。稀釋8倍時(shí)TA98不加S9回變率降低為46.1%,TA100加S9降低為49.1%。其余所有加熱過的混合陽(yáng)性物較不加熱的回變率均降低,但降幅未超過50%。在實(shí)際情況中致畸物的污染很少會(huì)是單一物質(zhì),為了進(jìn)一步研究加熱對(duì)致畸物的影響。參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范2003年版》采用推薦的4種陽(yáng)性物用相應(yīng)溶劑配制好后等體積混合,制作為模擬混合陽(yáng)性物為研究對(duì)象,首先分析未加熱情況下變化,結(jié)果見表5。不考慮濃度變化和加熱,由表5可見混合陽(yáng)性物原液較推薦陽(yáng)性物對(duì)4個(gè)菌株的誘導(dǎo)效率均下降,其中TA100受影響最小。本實(shí)驗(yàn)中將4種陽(yáng)性物等體積混合后平板摻入量依然為100μL/皿(與推薦陽(yáng)性物的摻入量相同),等體積混合后相當(dāng)于原匹配的陽(yáng)性物減少為25%;75%為菌種和活化狀態(tài)非針對(duì)性陽(yáng)性物質(zhì)。而Ames試驗(yàn)規(guī)范推薦的陽(yáng)性物劑量、針對(duì)的菌種和活化狀態(tài)均是經(jīng)過專門篩選優(yōu)化的,因此誘導(dǎo)效率下降是符合規(guī)律的。而TA100受影響小證明其較其他菌株對(duì)陽(yáng)性物的選擇性沒有專一性。進(jìn)一步分析濃度和加熱的相互影響,結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示:加熱和不加熱2種情況下4個(gè)菌株隨混合陽(yáng)性物濃度變化的趨勢(shì)顯著(圖1a);即無論加熱還是不加熱,TA98的回變濃度曲線斜率是最大的,可見TA98對(duì)混合陽(yáng)性物的濃度變化非常敏感,而其他3個(gè)菌受濃度影響較小。而圖1b表明經(jīng)過加熱后所有濃度混合陽(yáng)性物對(duì)所有菌的回變數(shù)值均降低,與推薦陽(yáng)性物結(jié)果一致。但以降低至50%以下為標(biāo)準(zhǔn)時(shí),混合陽(yáng)性物原液為0組,稀釋2倍為0組,稀釋4倍為1組,稀釋8倍為2組。加熱對(duì)結(jié)果的影響隨濃度降低而增加。從單個(gè)菌角度分析回變率與混合陽(yáng)性物濃度呈正相關(guān),不管加熱不加熱、加S9和不加S9,所有的回變率都隨濃度降低而降低,同時(shí)具有良好的梯度關(guān)系。3.3加熱對(duì)不同濃度混合陽(yáng)性物的誘導(dǎo)效率為進(jìn)一步模擬實(shí)際情況,在混合陽(yáng)性物基礎(chǔ)上制備模擬污染的保健食品為研究對(duì)象。選取1種以中藥顆粒為主要組分的保健食品“瑪咖片”作為基質(zhì),參照2003年版《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》將其配制為0.05g/mL水溶液作為基質(zhì)。按表2配制混合陽(yáng)性物到瑪咖片溶液中,最終保證混合陽(yáng)性物的濃度與2.3.1的混合陽(yáng)性物完全相同,試驗(yàn)組設(shè)置與2.3.2相同。結(jié)果見表6。由表6可知:所有菌的溶劑對(duì)照回變率均在自發(fā)回變范圍內(nèi),推薦陽(yáng)性物組的自發(fā)回變菌超過陽(yáng)性物回變的最低值。加熱后所有濃度混合陽(yáng)性物的回變率均降低?；旌详?yáng)性物原液加熱后:TA97、TA98、TA100、TA102不加S9及TA102加S9回變率均降低至50%以下;稀釋2倍組加熱后:TA97、TA98、TA100不加S9回變率均降低至50%以下;稀釋4倍組加熱后,TA97、TA98不加S9回變率均降低至50%以下。進(jìn)一步對(duì)比未加熱的混合陽(yáng)性物原液與推薦陽(yáng)性物回變率,結(jié)果見表7。表7結(jié)果顯示:不考慮濃度變化和加熱,混合陽(yáng)性物原液較推薦陽(yáng)性物對(duì)4個(gè)菌株的誘導(dǎo)效率均下降。與無基質(zhì)的結(jié)果主要差異在于TA102受影響最小。進(jìn)一步分析濃度和加熱的相互影響,結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示:加熱和不加2種情況下4個(gè)菌株隨混合陽(yáng)性物濃度變化的趨勢(shì)顯著(圖2a);即與無基質(zhì)情況不完全相同,TA98加熱組的加S9隨濃度變化曲線依然陡峭,其他各組卻趨于平緩。而圖2b表明在基質(zhì)中與前面推薦陽(yáng)性物及混合陽(yáng)性物的結(jié)果一致,經(jīng)過加熱后所有濃度混合陽(yáng)性物對(duì)所有菌的回變數(shù)值均降低。但以降低至50%以下為標(biāo)準(zhǔn)時(shí),趨勢(shì)有所變化。混合陽(yáng)性物原液有5組降至50%以下,稀釋2倍為3組,稀釋4倍為2組,稀釋8倍為0組。與無基質(zhì)的結(jié)果相反,加熱對(duì)結(jié)果的影響隨濃度降低而減少。與無基質(zhì)情況相同,從單個(gè)菌角度來看,回變率與混合陽(yáng)性物濃度是呈正相關(guān)的,不管加熱不加熱、加S9和不加S9所有的回變率都隨濃度降低而降低,同時(shí)也具有良好的梯度關(guān)系。4加熱對(duì)不同陽(yáng)性物的影響目前未見針對(duì)保健食品中致畸物(致癌物)污染情況的相關(guān)調(diào)查研究?？紤]到保健食品原料主要為中藥材及可食用的天然植物食品原料,污染應(yīng)主要來自中草藥及天然植物原料種植時(shí)的土壤及水體污染,因此農(nóng)殘和環(huán)境污染應(yīng)為重點(diǎn)來源。我國(guó)中藥材農(nóng)殘問題近年呈上升趨勢(shì),2013年綠色和平組織發(fā)布的《藥中藥:中藥材農(nóng)藥污染調(diào)查報(bào)告》中,對(duì)包括德國(guó)、法國(guó)、荷蘭、加拿大、美國(guó)、意大利、英國(guó)在內(nèi)的7個(gè)國(guó)家市場(chǎng)上產(chǎn)自中國(guó)的菊花、枸杞、金銀花等常用中藥材進(jìn)行了抽樣檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),90%的樣品中被檢測(cè)出農(nóng)殘最終本研究選定Ames推薦陽(yáng)性物作為研究對(duì)象。推薦陽(yáng)性物中的敵克松是1958年由西德拜耳公司首先開發(fā)的產(chǎn)品,作為一種農(nóng)藥主要用于蔬菜病害的防治,呈紅棕色、油狀,其BOD/COD<0.19,很難降解本研究發(fā)現(xiàn):基于Ames試驗(yàn)平板摻入法,3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均清楚地表明加熱對(duì)陽(yáng)性物誘變物的活力是有明顯影響的。但這種影響在水或中藥材顆?；|(zhì)中并不完全相同。水溶液體系中,推薦陽(yáng)性物方案受加熱影響誘導(dǎo)效率降至50%以下的占60%。當(dāng)單一陽(yáng)性物換為復(fù)雜混合陽(yáng)性物時(shí),誘導(dǎo)效率較標(biāo)準(zhǔn)推薦方案會(huì)大大下降,且在保健食品基質(zhì)和水中的變化也有差異。其可能是中藥顆粒對(duì)陽(yáng)性物有吸附作用,其釋放速遞或與菌株的接觸面積發(fā)生了改變導(dǎo)致。而濃度也是一個(gè)重要因素,在不同基質(zhì)中混合陽(yáng)性物表現(xiàn)出的誘導(dǎo)效率變化規(guī)律差異較大。水溶液中混合陽(yáng)性物隨濃度降低受加熱的影響有增大趨勢(shì),但總的來講影響較小,僅占所有考察情況的4種菌、4個(gè)濃度、加和不加S9共32種情況的(3/32)9.375%。而在以瑪咖片為基質(zhì)時(shí)(瑪咖粉50%,山梨糖醇34.2%,牡蠣提取物9%、其他為賦形劑和添加劑)