流式細(xì)胞儀的熒光補償問題第1頁/共24頁1.熒光素為什么會出現(xiàn)熒光？2.檢測前為什么需要進行熒光補償？3.熒光補償?shù)姆椒ㄓ心男?.熒光補償?shù)脑瓌t是什么？第2頁/共24頁熒光發(fā)生的機理

室溫下熒光素分子大部分處于“基態(tài)”，當(dāng)熒光素在一定波長（激發(fā)波長）的光的照射下吸收光能后（經(jīng)染色后的細(xì)胞在激光束的照射下），熒光染料吸收能量能級躍遷，進入新的狀態(tài)，稱為“激發(fā)態(tài)”，處于激發(fā)態(tài)的分子極不穩(wěn)定，它可以通過在10-9－10-7秒的極短時間內(nèi)以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。第3頁/共24頁第4頁/共24頁熒光素的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何發(fā)熒光的物質(zhì)分子都具有這兩個特征光譜激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission）：是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光。發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max第5頁/共24頁發(fā)射波峰--最大發(fā)射波長FITC--異硫氰酸熒光素第6頁/共24頁PE--藻紅蛋白第7頁/共24頁PE-Cy5--藻紅蛋白偶聯(lián)物第8頁/共24頁熒光染色對照的設(shè)置陰性對照空白對照（自發(fā)熒光）同型（ISO)對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）實驗樣本（特異熒光＋自發(fā)熒光＋非特異熒光）第9頁/共24頁熒光染料平均熒光強度比較

PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PE第10頁/共24頁同型對照的選擇與實驗染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型；與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標(biāo)記④相同劑量和濃度第11頁/共24頁分析類型管功能

加入的抗體單色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC雙色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PC55Sample1,2……A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-ECDγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-ECDγ1-PC55Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDD-PC56Sample1,2……A-FITCB-PEC-ECDD-PC5第12頁/共24頁熒光補償（compensation）定義：指在流式細(xì)胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（spectraloverlap）的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號。

第13頁/共24頁補償方法手動補償自動補償（flow-set)無論手動或自動補償都需將單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體分別進行單色熒光染色※即幾色分析就需要制備幾個補償對照管第14頁/共24頁現(xiàn)舉例進行FITC、PE、PC5三色手動補償1.準(zhǔn)備ISO（陰性對照管）；

IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC52.通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群體落在雙陰性區(qū)域；

FITC與PE、FITC與PC5、PE與PC5第15頁/共24頁第16頁/共24頁FITCFITC與PEPE第17頁/共24頁3.上單染管(CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE)，準(zhǔn)備補償；（注：保持電壓絕對不變；開始補償前，將原補償全部歸零；）第18頁/共24頁調(diào)節(jié)補償原則橫平豎直即X-mean或Y-mean相等第19頁/共24頁雙色熒光補償1第20頁/共24頁雙色熒光補償2

第21頁/共24頁第22頁/共24頁雙陰雙陽單陽CD