免疫組化顯色系統(tǒng)第一頁，共三十頁，2022年，8月28日免疫組化技術(shù)原理用標(biāo)記物或顯色物標(biāo)記抗體或抗原通過免疫學(xué)中的抗原與已知抗體反應(yīng)來檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原成分免疫組化染色是一項(xiàng)綜合性技術(shù)組織材料的準(zhǔn)備免疫組化染色前處理免疫組化染色(一抗,顯色系統(tǒng))第二頁，共三十頁，2022年，8月28日免疫組化原理圖標(biāo)注解一抗1一抗2抗兔二抗抗鼠二抗組織抗原1抗原2過氧化物酶堿性磷酸酶雙染阻斷劑顯色劑(棕色)顯色劑(紅色)葡聚糖骨架分子第三頁，共三十頁，2022年，8月28日回顧過去直接法二步間接法三步間接法酶免疫復(fù)合物法鏈親和素-生物素法(ABC)第四頁，共三十頁，2022年，8月28日目前常用的顯色系統(tǒng)一步法:EPOS(EnhancedPolymerOne-StepStaining)二步法:EnVisionSystems雙染:GeneralDoublestain

三步法:LSAB(LabeledSstreptavidin-biotin)催化放大系統(tǒng):CSA(CatalyzedSignalAmplicationSystem)動(dòng)物研究試劑盒:ARK(AnimalResearchKit)第五頁，共三十頁，2022年，8月28日一步法EPOS原理:

在一抗上通過多聚骨架標(biāo)記過氧化物酶.即一抗上已標(biāo)記過氧化物酶.這種一抗與抗原結(jié)合后即可直接顯色.多聚骨架分子特異性一抗組織抗原過氧化物酶第六頁，共三十頁，2022年，8月28日一步法EPOS主要實(shí)驗(yàn)流程組織片脫蠟,水化阻斷(S2001)TBS沖洗(S1968)一抗/HRP(U…)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(K3467或K0697)水漂洗素木精復(fù)染(S3309)第七頁，共三十頁，2022年，8月28日一步法EPOS特點(diǎn):一抗孵育后直接顯色即用型試劑快速(一步)完成敏感性較差昂貴使用對象:要求快速出結(jié)果的免疫組化實(shí)驗(yàn)對象第八頁，共三十頁，2022年，8月28日二步法EnVision原理:

在葡聚糖大分子上標(biāo)記二抗及酶,將傳統(tǒng)的二抗和三抗(酶)連接在一起,形成一個(gè)復(fù)合物EnVision.兩步孵育完成免疫組化.第九頁，共三十頁，2022年，8月28日二步法EnVision原理圖一抗與抗原結(jié)合EnVision二抗復(fù)合物與一抗結(jié)合第十頁，共三十頁，2022年，8月28日二步法EnVision主要實(shí)驗(yàn)流程阻斷內(nèi)過氧化酶(S2001)TBS沖洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)EnVision(Mo.K4001Rb.K4003)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(K3467或K0697)蘇木精復(fù)染(S3309)TBS沖洗(S1968)

第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日二步法EnVision

特點(diǎn):

二抗及酶通過葡聚糖連成一個(gè)大分子試劑(避開了傳統(tǒng)的生物素與鏈親和素結(jié)合),不受內(nèi)源性生物素干擾.即用,方便,快速(兩步).敏感性強(qiáng).背景低.是目前最理想的免疫組化顯色系統(tǒng)使用對象可向所有做免疫組化的用戶推薦.第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日EnVision二步法雙染原理:

與EnVision二步法原理相同,只是為達(dá)到在同一組織上標(biāo)記兩種抗原.必需用兩種動(dòng)物來源的一抗(常用抗小鼠和兔),分別配相應(yīng)的EnVision(二抗),再用兩種顏色的顯色劑顯色.第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日EnVision二步法雙染原理圖鼠一抗接抗原1鼠EnV/HRP接抗鼠一抗DAB(顯色劑1)雙染阻斷劑兔一抗接抗原2兔EnV/AP接抗兔一抗FastRed(顯色劑2)第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日EnVision二步法雙染主要實(shí)驗(yàn)流程阻斷內(nèi)過氧化酶(S2001)TBS沖洗(S1968)一抗(1Mo.)孵育TBS沖洗(S1968)EnVision/HRP(1Mo.)TBS沖洗(S1968)顯色劑1DAB(K3467)蒸餾水沖洗雙染阻斷劑(Kit含)一抗(2Rb.)孵育TBS沖洗(S1968)EnVision/AP(2Rb.)TBS沖洗(S1968)顯色劑2FastRead(K0597)蒸餾水沖洗蘇木精復(fù)染(S3309)第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日EnVision二步法雙染特點(diǎn):即用,方便,快速,省時(shí).敏感性強(qiáng).背景低.在同一組織切片上,用兩種不同標(biāo)記物標(biāo)記兩種不同的抗原.使用對象需在同一張切片上標(biāo)記兩種抗原者主要是形態(tài)學(xué)科研人員第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)

原理:

應(yīng)用生物素標(biāo)記二抗與過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素(Streptavidin)的親和作用,連接一抗及抗原,形成大分子.再通過相應(yīng)酶的底物(顯色劑)作用使之顯色.第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)原理圖:一抗與抗原結(jié)合二抗/Bio與一抗結(jié)合STPA/HRP(AP)與二抗/Bio結(jié)合第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)主要實(shí)驗(yàn)流程阻斷內(nèi)過氧(S2001)TBS沖洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)TBS沖洗(S1968)

TBS沖洗(S1968)二抗/生物素(Mo.E354Rb.E353)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(K3467或K0697)FastRead(K0597或K0699)蘇木精復(fù)染(S3309)鏈親和素/HRP或AP蒸餾水沖洗第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)特點(diǎn):便宜有現(xiàn)成的兔,鼠,羊通用試劑盒會(huì)有內(nèi)源性生物素造成的非特異性背景使用對象可向所有做免疫組化的用戶推薦.第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

原理在經(jīng)典三步法免疫組化放大基礎(chǔ)上,通過生物素化酪胺的催化,將又一次加入的酶標(biāo)記鏈親和素(Streptavidin-enzyme)與二抗中生物素親和,使已放大的分子再一次放大.第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

原理圖一抗與抗原結(jié)合二抗/Bio與一抗結(jié)合STAV/Bio與二抗/Bio結(jié)合放大液催化加入STAV/HRP與Bio再結(jié)合第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

主要實(shí)驗(yàn)流程:阻斷內(nèi)過氧(S2001)水洗TBS沖洗(S1968)二抗孵育(Rba-Mo/Bio)TBS沖洗(S1968)

放大液(Kit含)鏈親和素/生物素Strep./Bio(Kit含)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(Kit含)蘇木精復(fù)染(S3309)鏈親和素/過氧化物酶Strep./HRP(Kit含)蒸餾水沖洗蛋白阻斷劑(Kit含)一抗孵育(Mo)TBS沖洗(S1968)TBS沖洗(S1968)TBS沖洗(S1968)第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

特點(diǎn):敏感性極強(qiáng)實(shí)驗(yàn)步驟較多較貴使用對象:需做免疫組化實(shí)驗(yàn)者,特別適用于某些石蠟片不易出結(jié)果的一抗.第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日動(dòng)物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)原理在一抗與組織抗原反應(yīng)之前:小鼠一抗F(c)與生物素化抗小鼠F(ab)片斷結(jié)合,再加入小鼠免疫球蛋白,中和未被結(jié)合的生物素化抗小鼠F(ab).用該復(fù)合物再與小鼠組織中特異抗原反應(yīng),可降低非特異性背景.第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日動(dòng)物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)原理圖小鼠一抗抗小鼠IgF(ab)/Bio免疫復(fù)合物/Bio和游離抗小鼠IgF(ab)/Bio免疫復(fù)合物/Bio和游離抗小鼠IgF(ab)/Bio小鼠Ig免疫復(fù)合物/Bio和被中和的抗小鼠IgF(ab)/Bio與組織抗原結(jié)合按LSAB法繼續(xù)免疫組化染色第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日動(dòng)物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)主要實(shí)驗(yàn)步驟一抗與組織抗原反應(yīng)之前需做試劑的預(yù)處理:小鼠一抗+抗小鼠Ig的F(ab)/Bio復(fù)合物1復(fù)合物1+小鼠Ig復(fù)合物2(已優(yōu)化的一抗)用復(fù)合物2作為一抗同LSAB三步法免疫組化染色第二十七頁，共三十頁，2022年，8月28日動(dòng)物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)特點(diǎn)小鼠一抗在小鼠組織切片上做免疫組化可降低背景.使用對象需用小鼠一抗做小鼠組織的免疫組化實(shí)驗(yàn)者.第二十八頁，共三十頁，2022年，8月28日幾種顯色系統(tǒng)復(fù)雜與敏