第1章發(fā)酵工程微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)一.選擇培養(yǎng)基1973年，科學(xué)家從美國(guó)黃石國(guó)家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進(jìn)而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶。為什么這種菌能從熱泉中被篩選出來(lái)？因?yàn)樗茉?0-80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。一.選擇培養(yǎng)基1．實(shí)驗(yàn)室中微生物篩選的原理2．選擇培養(yǎng)基在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。人為提供有利于目的菌生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度和pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)。一.選擇培養(yǎng)基思考討論尿素[CO(NH2)2]尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素不能直接被農(nóng)作物吸收，土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗麄兡芎铣呻迕?。?選擇培養(yǎng)基思考討論1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來(lái)，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計(jì)？【答案】設(shè)計(jì)一種選擇培養(yǎng)基,用尿素作為唯一氮源,可以將分解尿素的細(xì)菌分離出來(lái)。2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？【答案】這種培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基相比，只是用尿素作為唯一氮源，培養(yǎng)基的其他營(yíng)養(yǎng)成分基本相同。尿素[CO(NH2)2]一.選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基的比較項(xiàng)目選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基原理用途舉例圖示加入不影響甚至促進(jìn)目標(biāo)微生物生長(zhǎng)，而抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)加入某種指示劑或化學(xué)藥品(不影響微生物正常生長(zhǎng))，使微生物的某種代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中的特定指示劑或化學(xué)藥品發(fā)生反應(yīng)培養(yǎng)、分離出目標(biāo)微生物鑒別目標(biāo)微生物培養(yǎng)酵母菌和霉菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入青霉素，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)；利用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)可分解尿素的細(xì)菌可用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基鑒定飲用水或乳制品中是否含有大腸桿菌(若有，則菌落呈黑色)二.微生物的選擇培養(yǎng)1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌?原理：通過對(duì)土樣進(jìn)行充分稀釋，再將菌液涂布到制備好的培養(yǎng)基上，即可得到能分解尿素的細(xì)菌的純培養(yǎng)物。②將10g土壤加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻，取1mL上清液加入盛有9mL無(wú)菌水的是試管中，依次等比稀釋二.微生物的選擇培養(yǎng)1.操作過程——稀釋涂布平板法①鏟取土壤，將樣品裝入紙袋中二.微生物的選擇培養(yǎng)1.操作過程——稀釋涂布平板法③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中二.微生物的選擇培養(yǎng)1.操作過程——稀釋涂布平板法⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻常用微生物分離方法比較二.微生物的選擇培養(yǎng)比較平板劃線法稀釋涂布平板法工具接種環(huán)涂布器原理在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見的細(xì)胞群體，即菌落在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落特點(diǎn)方法簡(jiǎn)單，但不適宜計(jì)數(shù)單菌落更易分開，可以計(jì)數(shù)，但操作復(fù)雜結(jié)果共同點(diǎn)使培養(yǎng)基上形成由單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖而來(lái)的子細(xì)胞群體——菌落2．菌種培養(yǎng)二.微生物的選擇培養(yǎng)待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30～37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d。培養(yǎng)時(shí)要將一個(gè)未接種的培養(yǎng)基和一個(gè)已接種的培養(yǎng)基放在一起培養(yǎng)，為什么？未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)很關(guān)鍵，如果無(wú)菌落生長(zhǎng)，說明了什么？培養(yǎng)未接種的培養(yǎng)基的作用是對(duì)照。未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫一段時(shí)間后，如果無(wú)菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基制備成功、合格，未受到污染。3．菌種觀察二.微生物的選擇培養(yǎng)在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。三.微生物的數(shù)量測(cè)定1．測(cè)定依據(jù)(1)當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。(2)通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。2．操作過程(1)選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)為30～300、適于計(jì)數(shù)的平板。(2)在同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值。三.微生物的數(shù)量測(cè)定三.微生物的數(shù)量測(cè)定下圖為“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)”實(shí)驗(yàn)中樣品稀釋示意圖。據(jù)圖分析，每克土壤中的菌株數(shù)約為多少？【提示】每克土壤中的菌株數(shù)約為1.7×109個(gè)。3．計(jì)數(shù)方法三.微生物的數(shù)量測(cè)定(1)稀釋涂布平板法：統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來(lái)表示。三.微生物的數(shù)量測(cè)定3．計(jì)數(shù)方法(2)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：是一種常用的、快速直觀的測(cè)定微生物數(shù)量的方法。統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。三.微生物的數(shù)量測(cè)定微生物的計(jì)數(shù)方法比較內(nèi)容直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法主要用具顯微鏡、細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板涂布器計(jì)數(shù)依據(jù)細(xì)菌個(gè)數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)優(yōu)點(diǎn)計(jì)數(shù)方便、操作簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)的是活菌缺點(diǎn)不能區(qū)分死菌與活菌操作較復(fù)雜且有一定誤差計(jì)算公式每毫升原液含菌株數(shù)＝400×1000×每小格平均菌株數(shù)×稀釋倍數(shù)每毫升原液含菌株數(shù)＝平均菌落數(shù)/所用涂布液體積×稀釋倍數(shù)探究實(shí)踐三.微生物的數(shù)量測(cè)定1.結(jié)合對(duì)照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落?！敬鸢浮咳绻麤]有接種的培養(yǎng)基上沒有菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，說明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。探究實(shí)踐三.微生物的數(shù)量測(cè)定2.你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30～300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個(gè)平板的菌落數(shù)接近？【提示】如果得到了兩個(gè)或多個(gè)菌落數(shù)為30-300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。三.微生物的數(shù)量