代謝調節(jié)與代謝工程(1).直線式代謝途徑中的反饋抑制： 蘇氨酸脫氨酶α-酮丁酸 異亮氨酸 反饋抑制 其它實例：谷氨酸棒桿菌的精氨酸合成(2).分支代謝途徑中的反饋抑制：在分支代謝途徑中，反饋抑制的情況較為復雜，為了避免在一個分支上的產物過多時不致同時影響另一分支上產物的供應，微生物發(fā)展出多種調節(jié)方式。主要有：同功酶的調節(jié)，順序反饋，協(xié)同反饋，積累反饋調節(jié)等。3.2.3反饋抑制的類型代謝調節(jié)與代謝工程(1)同功酶調節(jié)——isoenzyme定義：催化相同的生化反應，而酶分子結構有差別的一組酶。意義：在一個分支代謝途徑中，如果在分支點以前的一個較早的反應是由幾個同功酶催化時，則分支代謝的幾個最終產物往往分別對這幾個同功酶發(fā)生抑制作用?！骋划a物過量僅抑制相應酶活，對其他產物沒影響。舉例：大腸桿菌的天冬氨酸族氨基酸合成的調節(jié)代謝調節(jié)與代謝工程代謝調節(jié)與代謝工程

天冬氨酸 E,R

4-磷酸天冬氨酸

E 天冬氨酸半醛 E,R E二氫吡啶二羧酸 同型絲氨酸 同型絲氨酸磷酸

E,R R O-琥珀酰同型絲氨酸 蘇氨酸

E,R六氫吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸

R

二氨基庚二酸 同型半胱氨酸

R

賴氨酸 甲硫氨酸 異亮氨酸天冬氨酸族

（谷氨酸棒桿菌）代謝調節(jié)與代謝工程合作反饋抑制定義：兩種末端產物同時存在時，共同的反饋抑制作用大于二者單獨作用之和。舉例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反饋抑制，二者共同存在時，可以完全抑制該酶的活性。而二者單獨過量時，分別抑制其活性的70%和10%。代謝調節(jié)與代謝工程(3)積累反饋抑制定義：每一分支途徑末端產物按一定百分比單獨抑制共同途徑中前面的酶，所以當幾種末端產物共同存在時它們的抑制作用是積累的，各末端產物之間既無協(xié)同效應，亦無拮抗作用。代謝調節(jié)與代謝工程(4)順序反饋抑制一種終產物的積累,導致前一中間產物的積累，通過后者反饋抑制合成途徑關鍵酶的活性，使合成終止。舉例：枯草芽孢桿菌芳香族氨基酸合成的調節(jié)代謝調節(jié)與代謝工程分支途徑上游的某個酶受到另一條分支途徑的終產物，甚至于本分支途徑幾乎不相關的代謝中間物的抑制或激活，使酶的活力受到調節(jié)，此即代謝互鎖。

4.1.8代謝互鎖代謝調節(jié)與代謝工程在分支合成途徑中，分支點后的兩種酶競爭同一種底物，如AMP與GMP，Thr與Lys、Met，由于兩種酶對底物的Km值（即對底物的親和力）不同，故兩條支路的一條優(yōu)先合成。3.1.8優(yōu)先合成代謝調節(jié)與代謝工程工業(yè)發(fā)酵的目的——大量地積累人們所需要的微生物代謝產物。在正常生理條件下

微生物通過其代謝調節(jié)系統(tǒng)吸收利用營養(yǎng)物質用于合成細胞結構，進行生長和繁殖，它們通常不浪費原料和能量，也不積累中間代謝產物代謝的人工控制人為地打破微生物的代謝控制體系，就有可能使代謝朝著人們希望的方向進行代謝調節(jié)與代謝工程（1）對于直線式代謝途徑：選育營養(yǎng)缺陷性突變株只能積累中間代謝產物

AaBbCcDdE

1)營養(yǎng)缺陷型菌株的應用

末端產物E對生長乃是必需的，所以，應在培養(yǎng)基中限量供給E，使之足以維持菌株生長，但又不至于造成反饋調節(jié)（阻遏或抑制），這樣才能有利于菌株積累中間產物C。遺傳學方法代謝調節(jié)與代謝工程(2)分支代謝途徑：情況較復雜，可利用營養(yǎng)缺陷性克服協(xié)同或累加反饋抑制積累末端產物，亦可利用雙重缺陷發(fā)酵生產中間產物ABCDEFG代謝調節(jié)與代謝工程谷氨酸棒桿菌的代謝調節(jié)與賴氨酸生產E：表示反饋抑制；R：表示反饋阻遏

高絲氨酸脫氫酶（HSDH）天冬氨酸激酶（AK)賴氨酸生產菌:高絲氨酸缺陷型代謝調節(jié)與代謝工程分支途徑——①賴氨酸發(fā)酵

(谷氨酸棒桿菌的代謝調控)代謝調節(jié)與代謝工程分支途徑——②肌苷酸發(fā)酵

（IMP合成途徑的代謝調控）調控理論的實踐應用代謝調節(jié)與代謝工程2)抗反饋控制突變株的應用★抗反饋控制突變株——是指對反饋抑制不敏感或對阻遏有抗性，或兩者兼有之的菌株?！锟狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產物結構類似物抗性突變株和營養(yǎng)缺陷性回復突變株中獲得?！铽@得方法及其原理：代謝調節(jié)與代謝工程目標產物結構類似物賴氨酸S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸-(AEC)蘇氨酸-氨基--羥基戊酸（AHV)異亮氨酸乙硫氨酸精氨酸D-精氨酸苯丙氨酸對氟苯丙氨酸代謝調節(jié)與代謝工程營養(yǎng)缺陷型回復突變株調節(jié)酶的變構特性是由其結構基因決定的，如果調節(jié)酶的基因發(fā)生突變而失活，則有兩種可能性：一是催化亞基和調節(jié)亞基的基因均發(fā)生突變；另一種可能僅僅是催化亞基發(fā)生突變。一是催化亞基和調節(jié)亞基恢復到第一次突變前的活性水平。如果前者發(fā)生回復突變，則又有兩種可能性另一種是催化亞基得以恢復，而調節(jié)亞基喪失了調節(jié)的功能。營養(yǎng)缺陷型回復突變代謝調節(jié)與代謝工程組成型突變株結構基因不受控制地轉錄，酶的生成將不再需要誘導劑或不再被末端產物或分解代謝物阻遏。調節(jié)基因發(fā)生突變產生無效的阻遏物而不能與操縱基因結合操縱基因突變突變操縱基因不能與阻遏物結合組成型突變代謝調節(jié)與代謝工程DABCEF2.生物化學方法1.添加前體繞過反饋控制點：亦能使某種代謝產物大量產生(-)(-)(-)2.添加誘導劑：從提高誘導酶合成量來說，最好的誘導劑往往不是該酶的底物，而是底物的衍生物。3.發(fā)酵與分離過程耦合：4.控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分：代謝調節(jié)與代謝工程谷氨酸發(fā)酵一、谷氨酸發(fā)酵菌種：CorynebacteriumpekinenseCorynebacteriumglutamicumBrevibacteriumflavu二、發(fā)酵機理：①谷氨酸以-酮戊二酸為碳架；當以糖質為發(fā)酵原料時，合成途徑包括EMP,HMP,TCA循環(huán),乙醛酸循環(huán)等；②谷氨酸產生菌的-酮戊二酸氧化酶活力很弱或缺少，而谷氨酸脫氫酶的活力要很高；③生物素是谷氨酸產生菌必需的一種維生素，在谷氨酸生物合成中起著重要作用，缺乏或量太高都會使谷氨酸合成受阻。生物素通過影響細胞膜的通透性而影響谷氨酸發(fā)酵。代謝調節(jié)與代謝工程回補順序谷氨酸+NH3谷氨酸脫氫酶-酮戊二酸氧化酶代謝調節(jié)與代謝工程1.谷氨酸生產菌中存在2個糖酵解途徑EMP/HMP生物素參與糖代謝作用：增加糖代謝的速度而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變丙酮酸積累乳酸積累2.α-酮戊二酸氧化酶缺失TCA環(huán)阻斷，α-酮戊二酸積累代謝調節(jié)與代謝工程3.四碳二羧酸的來源Δ在生產菌中檢出CO2固定反應酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和蘋果酸酶谷氨酸對糖的轉化率達到81.7%Δ

DCA循環(huán)標志酶：異檸檬酸裂解酶在谷氨酸發(fā)酵中，DCA環(huán)一方面可以作為TCA循環(huán)有缺陷時C4二羧酸的補充在谷氨基酸生產菌的生長中提供能量作用谷氨酸生成期中要封閉DCA環(huán)？通過DCA環(huán)提供C4二羧酸時谷氨酸對糖的轉化率僅為54.4%代謝調節(jié)與代謝工程4.異檸檬酸脫氫酶活力強提供NADPH,用于還原α-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化還原共扼體系5.氨的導入合成谷氨酸的反應有3種：α-酮戊二酸+NH4+NADPH+谷氨酸H2ONADP++谷氨酸脫氫酶α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸轉氨酶谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶代謝調節(jié)與代謝工程生產菌中谷氨酸轉氨酶活力低，轉氨作用可以不考慮谷氨酸合成酶由于不受高濃度谷氨酸抑制，其作用值得重視谷氨酸脫氫酶是合成積累谷氨酸的主要酶氨的導入時生物素缺乏，NH4+影響糖代謝速度：提高糖代謝速度高效合成谷氨酸生物素充足時，NH4+不影響糖代謝速度6.谷氨酸合成的調節(jié)機制谷aa比天冬aa優(yōu)先合成谷aa脫氫酶谷aa對其反饋抑制和反饋阻遏檸檬酸合成酶TCA的關鍵酶，受能荷調節(jié)，谷aa反饋阻遏，烏頭酸反饋抑制異檸檬酸脫氫酶α-酮戊二酸反饋抑制α-酮戊二酸脫氫酶先天喪失或微弱PEP受天冬aa反饋抑制，受谷aa和天冬aa反饋阻遏代謝調節(jié)與代謝工程7.細胞膜通透性控制代謝調節(jié)與代謝工程生物素阻斷脂肪酸的合成影響細胞膜的合成表面活性劑對生物素有拮抗阻斷脂肪酸的合成影響細胞膜的合成在對數(shù)生長期添加青霉素抑制細胞壁合成細胞膜損傷甘油缺陷型磷脂的合成受阻影響細胞膜的合成油酸缺陷型阻斷不飽和脂肪酸的合成影響細胞膜的合成代謝調節(jié)與代謝工程三磷酸腺苷(ATP)是為許多反應提供能量的高能磷酸化物,細胞中的ATP、ADP和AMP含量處于相對平衡的狀態(tài)——細胞中的能量狀態(tài)3.2.5.3能荷（Energycharge）能荷（Energycharge）來表示細胞中的能量狀態(tài)。能荷（EC）可用下式來表示：

系統(tǒng)中只有ATP時，EC值為1；只有AMP時，EC值等于0。代謝調節(jié)與代謝工程能荷不僅能調節(jié)分解代謝形成ATP的酶活性，也能調節(jié)合成代謝利用ATP的酶活性。細胞能荷可調節(jié)酶活性高能荷抑制異檸檬酸脫氫酶和磷酸果糖激酶等檸檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制劑，從而限制了葡萄糖的利用速度。有氧條件下，大量合成ATP，細胞能荷增加異檸檬酸脫氫酶受到ATP抑制，導致檸檬酸的積累代謝調節(jié)與代謝工程在厭氧條件下，酵母菌無法通過呼吸鏈產生ATP，細胞能荷較低。ADP和AMP激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生產酒精的速度加快。代謝調節(jié)與代謝工程第十二章工業(yè)微生物發(fā)酵產品調節(jié)點主要在三個激酶，即己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶。它們是糖酵解途徑中的關鍵酶，是糖酵解途徑的三個不可逆步驟糖代謝的調節(jié)主要是能荷的控制代謝調節(jié)與代謝工程3.2.5.4無機聚磷酸的代謝與功能磷酸鹽和能量的儲存。重金屬陽離子的解毒作用。代謝調節(jié)與代謝工程活性污泥中的聚磷菌

生活在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中，在將進入對數(shù)生長期時，為大量分裂作準備，細胞能從廢水中大量攝取溶解態(tài)的正磷酸鹽，在細胞內合成多聚磷酸鹽。細菌經過對數(shù)生長期而進入靜止期時，若環(huán)境中的磷源仍有剩余，細胞又有一定的能量時，仍能從外界吸收磷元素，這種對磷的積累作用大大超過微生物正常生長所需的磷量，可達細胞重量的6％-8％，有報道甚至可達10％。以多聚磷酸鹽的形式積累于細胞內作為貯存物質。當細菌細胞處于極為不利的生活條件時，例如使好氧細菌處于厭氧條件下，即所謂細菌“壓抑”狀態(tài)時，聚磷菌能吸收污水中的乙酸、甲酸、丙酸及乙醇等極易生物降解的有機物質，貯存在體內作為營養(yǎng)源，同時將體內存貯的聚磷酸鹽分解，釋放到環(huán)境中來，以便獲得能量，供細菌在不利環(huán)境中維持其生存所需，此時菌體內多聚磷酸鹽就逐漸消失，而以可溶性單磷酸鹽的形式排到體外環(huán)境中。代謝調節(jié)與代謝工程概念：有氧條件下，發(fā)酵作用受抑制的現(xiàn)象（或氧對發(fā)酵的抑制現(xiàn)象）。意義：合理利用能源通風對酵母代謝的影響通風（有氧呼吸）缺氧（發(fā)酵）酒精生成量耗糖量/單位時間細胞的繁殖低（接近零）少旺盛高多很弱至消失巴斯德效應(ThePasteureffect)現(xiàn)象：代謝調節(jié)與代謝工程巴斯德效應（Pasteureffect）機理巴斯德在研究酵母的酒精發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)：厭氧條件下酵母菌進行酒精發(fā)酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧條件下，酵母菌進行呼吸作用，糖的消耗速度較低，酒精產量也降低。呼吸抑制發(fā)酵作用的的現(xiàn)象巴斯德效應的本質是能荷調節(jié)。代謝調節(jié)與代謝工程Cratree效應

在一些代謝旺盛的正常組織和腫瘤細胞