高效液相色譜法

highperformanceliquidchromatography

1以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜的理論與實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)展而成的分離分析方法。以高壓泵輸送液體流動(dòng)相，采用高效固定相，實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)和儀器化。具有分離效能高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等的優(yōu)點(diǎn)。第一節(jié)

概述

2與氣相色譜法對(duì)比GC快速、分離效率高、樣品用量少。在約300萬個(gè)有機(jī)化合物中，可以直接用該法分析的占20%。HPLC快速、分離效率高、樣品不受揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性的約束，因而分析對(duì)象廣。3第一節(jié)高效液相色譜法的主要類型和原理LLC和LSC分配、吸附、離子交換和空間排阻化學(xué)健合相色譜法ISC和PIC/IPC5二、化學(xué)鍵合相色譜法將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體的表面構(gòu)成化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為鍵合相色譜法。鍵合相色譜法是應(yīng)用最廣的色譜法。6鍵合相色譜法正相色譜法反相色譜法RHPLCISCPICorIPC7（二）反相鍵合相色譜法常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS）

常用流動(dòng)相：甲醇—水，乙腈—水分析對(duì)象：非極性、中等極性的分子型化合物分離機(jī)制：疏溶劑理論認(rèn)為在該法中溶質(zhì)的保留是溶質(zhì)分子與極性分子間的排斥力。9反相鍵合相色譜法影響保留行為的因素溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

極性，疏水性，k，tR

流動(dòng)相

與其表面張力和介電常數(shù)有關(guān)，有機(jī)溶劑含量，k流動(dòng)相的pH影響溶質(zhì)的離解程度，離解程度，k固定相

隨碳鏈延長(zhǎng)，鍵合相疏水性，k碳鏈一定時(shí)，鍵合相濃度，k10離子抑制色譜法ISCISC—調(diào)節(jié)RLLC流動(dòng)相pH值以抑制組分的離解

抑制劑：弱酸(HAc)、弱堿(NH3H2O)或緩沖液

分離機(jī)制：調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，抑制組分的理解，以中性分子的形式在固定相和流動(dòng)相之間產(chǎn)生分配平衡。

分析對(duì)象：3.0≤pKa≤

7.0的弱酸7.0≤

pKa≤

7.0的弱堿

兩性化合物

11（三）反相離子對(duì)色譜法RPIC—在一般RLLC流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑。

常用的離子對(duì)試劑：分析堿用烷基磺酸鹽，分析酸用四丁基季胺鹽。

分離機(jī)制：離子對(duì)試劑與被分析的離子形成中性離子對(duì)，在固定相和流動(dòng)相之間產(chǎn)生分配平衡。分析對(duì)象：各類有機(jī)酸、堿、鹽及兩性化合物

13保留機(jī)制-離子對(duì)模型B+HBH+RSO3NaRSO3-+Na++BH+RSO3-固定相BH+RSO3-14影響容量因子的因素離子對(duì)試劑的種類和濃度

分析酸性類物質(zhì)季銨鹽分析堿性類物質(zhì)烷基磺酸鹽或硫酸鹽PIC試劑碳鏈，k在低于膠束濃度時(shí)，PIC試劑濃度，k流動(dòng)相的pH影響PIC試劑和組分的離子化15三、其他高效液相色譜法離子色譜法（ionchromatography）手性色譜法（chialchromatography）親和色譜法（affinitychromatography）17離子色譜法（ionchromatography）離子交換色譜與電導(dǎo)檢測(cè)器相結(jié)合分析各種離子的方法抑制型（雙柱型）和非抑制型（單柱型）分離柱交換反應(yīng)：R＋－OH－+NaX→R＋－X－+NaOH洗脫反應(yīng)：R＋―X－+NaOH→R＋－OH－+NaX抑制柱與組分反應(yīng)：R――H＋+NaX→R――Na＋+HX與洗脫劑反應(yīng)：R－―H＋+NaOH→R――Na＋+H2O18第二節(jié)HPLC的固定相和流動(dòng)相及其選擇固定相應(yīng)滿足下列要求顆粒細(xì)、均勻傳質(zhì)快機(jī)械強(qiáng)度高，耐高壓化學(xué)穩(wěn)定性好，與流動(dòng)相不發(fā)生反應(yīng)19（一）鍵合相的種類

1.非極性鍵合相表面基團(tuán)-C18H37-C8H17OHSiOSiOHOSiOHOSiOSiOHOH硅膠表面212.弱極性、極性鍵合相弱極性鍵合相：

O正相和反相均可極性鍵合相：

CNNH2

一般作正相OSiCH3CNCH3(CH)2nSi22（二）鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)鍵合反應(yīng)含碳量和覆蓋度鍵合基團(tuán)的鏈長(zhǎng)增加，極性降低，載樣量增大，容量因子增加。鍵合相的特點(diǎn)

不流失、穩(wěn)定、載樣量大注意點(diǎn)pH適用范圍23流動(dòng)相對(duì)分離的影響

分離度R與n、、k2的關(guān)系n-決定于色譜柱（固定相）性能。、k-受溶劑系統(tǒng)（流動(dòng)相）影響。

R=n4-1k2k2-1(a)(b)(c)25AB23AB12AB12增加246810110070030010060%乙腈Time(min.)mAU40%水溶劑洗脫強(qiáng)度增加20001600600080%乙腈Time(min.)mAU100020%水246810InjectTime高柱效低柱效柱效增加26在HPLC中縱向擴(kuò)散項(xiàng)B=2Dm

Dm

T/B/u減小至忽略不計(jì)渦流擴(kuò)散項(xiàng)A=2dp降低降低dp

傳質(zhì)阻力系數(shù)CCm+CsmH=A+Cu=A+Cmu+Csmu

近似認(rèn)為流動(dòng)相的流速與板高成直線關(guān)系，流速增大，板高增加，柱效降低。一般采用1ml/min。29固定相粒度對(duì)板高的影響

Cm=dp2/Dmdp—固定相微粒直徑小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相低粘度流動(dòng)相，流速不宜太快柱溫適當(dāng)30（二）正相鍵合相色譜法的分離條件固定性極性>流動(dòng)相極性固定相：極性鍵合相

流動(dòng)相：烷烴（底劑）+極性調(diào)節(jié)劑

正相洗脫時(shí)，依靠組分的極性差別而分離出峰順序：極性小的組分先出峰。31（三）反相鍵合相色譜法的分離條件流動(dòng)相極性>固定相極性固定相：非極性鍵合相

流動(dòng)相：甲醇-水、乙腈-水，常加入弱酸、弱堿或緩沖鹽調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH以抑制組分離解，增加保留

反相洗脫時(shí)，出峰順序：極性大的組分先出峰。

32（四）反相離子對(duì)色譜法的分離條件離子對(duì)試劑的選擇流動(dòng)相pH的選擇有機(jī)溶劑及其濃度的選擇33四、其他固定相鍵合型離子交換劑手性固定相分析、分離對(duì)映體的最重要手段。制備單一構(gòu)型的活性異構(gòu)體是世界制藥業(yè)的大方向。親和色譜固定相雖然并非新方法，但近年來有了長(zhǎng)足的發(fā)展。利用親合反應(yīng)的專屬性