第二章微生物學(xué)經(jīng)典技術(shù)課程標(biāo)準(zhǔn)本章要點(diǎn)第一節(jié)顯微技術(shù)第二節(jié)無(wú)菌技術(shù)第三節(jié)分離技術(shù)第四節(jié)培養(yǎng)技術(shù)返回總目錄1第二章微生物學(xué)經(jīng)典技術(shù)ClassicalTechniqueofMicrobiology課程標(biāo)準(zhǔn)了解微生物學(xué)顯微技術(shù)、無(wú)菌技術(shù)、分離技術(shù)、培養(yǎng)技術(shù)等四大經(jīng)典技術(shù)的發(fā)展歷程，掌握四大經(jīng)典技術(shù)所涉及的方法。2一.顯微技術(shù)(MicroscopicalTechnique)二.無(wú)菌技術(shù)(Aseptictechnique)三.分離技術(shù)(SeparateTechnique)四.培養(yǎng)技術(shù)(CultureTechnique)本章要點(diǎn)3微生物最根本的特殊性就是它們微小特殊的觀察工具避免非目標(biāo)菌的干擾從混雜的微生態(tài)群中區(qū)分開(kāi)來(lái)特殊的培養(yǎng)技術(shù)顯微技術(shù)無(wú)菌技術(shù)分離技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)4第一節(jié)顯微技術(shù)Microscopicaltechnique1顯微鏡技術(shù)的發(fā)展2光學(xué)顯微鏡樣品的染色方法(Dyeingmethods

)3電子顯微鏡樣品的制備OpticalMicroscope,OMElectronMicroscope,EM5工具是人類(lèi)器官的延伸。要觀察肉眼看不到的微生物，沒(méi)有適當(dāng)工具是不可能的。在列文虎克用顯微鏡揭示微小的生命世界之前80多年，已經(jīng)有人制造出顯微鏡，并描繪了顯微鏡下細(xì)菌的形態(tài)。不過(guò)，看到細(xì)菌、原生動(dòng)物等活的微生物，并把它們的運(yùn)動(dòng)記錄下來(lái)的第一人是列文虎克（AnthonyVanLeeuwenhoek)。1顯微鏡技術(shù)的發(fā)展DevelopmentofMicroscopetechnique6隨著工業(yè)發(fā)展和技術(shù)進(jìn)步，顯微鏡經(jīng)過(guò)300多年的改進(jìn)，現(xiàn)在已經(jīng)是林林總總，形式多樣了。但從功能上說(shuō)，無(wú)非是從器具和觀察對(duì)象兩方面著手提高放大倍數(shù)和增加分辨細(xì)微結(jié)構(gòu)的能力。器具觀察對(duì)象提高放大倍數(shù)增加分辨細(xì)微結(jié)構(gòu)的能力器具觀察對(duì)象波束的性質(zhì)操縱裝置如何突顯待觀察的部分電磁波光波光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡染色7光波只能對(duì)大于其波長(zhǎng)的物體造象可見(jiàn)光的波長(zhǎng)大約是0.4—0.8微米，所以光學(xué)顯微鏡不可能分辨小于200納米（0.2微米）的物體。D=0.5λ/NA8910目前的光學(xué)顯微鏡放大和分辨效率已經(jīng)越來(lái)越接近其極限，大約可以將對(duì)象放大2000倍。由于一般細(xì)菌的直徑大約是1微米，所以在光學(xué)顯微鏡下，只能觀察細(xì)菌的一般形態(tài)和主要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即使較大的細(xì)菌，也不能有效地研究它們的內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)。11不僅可以看到細(xì)胞中許多細(xì)微結(jié)構(gòu)，還能觀察分子的形態(tài)。電磁波的波長(zhǎng)約是0.005納米，是可見(jiàn)光波長(zhǎng)的十萬(wàn)分之一電子顯微鏡的放大倍數(shù)目前可以達(dá)到百萬(wàn)，可以分辨0.1—0.5納米，也就是說(shuō)，物體中相距0.1—0.5納米的兩個(gè)點(diǎn)也可以分辨清楚。121314激光技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展顯微鏡的不斷革新15后來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以用染料染色，而且不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)染料有特異性反應(yīng)，甚至不同種類(lèi)微生物對(duì)同種染料的著色情況也不同。2染色方法DyeingMethods

為了提高觀察效果，被觀察的對(duì)象也要進(jìn)行處理。開(kāi)始，微生物學(xué)家在用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌的時(shí)候，由于懸浮在液體中的細(xì)胞既微小又透明，觀察起來(lái)非常困難。16染色方法的種類(lèi)簡(jiǎn)單染色法（Simplestaining)復(fù)合染色法（復(fù)染法）(complexstaining)用兩種或兩種以上的染料對(duì)菌體或菌體的不同結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色用一種染料對(duì)菌體進(jìn)行染色最著名的例子是丹麥科學(xué)家革蘭（Chriatian,Gram）在1884年發(fā)明的一項(xiàng)重要的觀察細(xì)菌的方法-革蘭氏染色法17這種目前仍然廣泛使用的革蘭氏染色反應(yīng)對(duì)于細(xì)菌的鑒定具有很高的價(jià)值，而且后來(lái)發(fā)現(xiàn)根據(jù)這個(gè)染色反應(yīng)區(qū)分的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（能夠保留染料，故細(xì)菌呈紫色）和革蘭氏陰性細(xì)菌（不能保留染料而被番紅花紅染成紅色）在許多生理特性上有區(qū)別，例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌對(duì)青霉素和磺胺類(lèi)藥物特別敏感。現(xiàn)在知道這是因?yàn)閮深?lèi)細(xì)菌的細(xì)胞壁有很大的差異。這個(gè)方法是把細(xì)菌涂在載玻片（slide)上，在酒精燈上烘干，用結(jié)晶紫染色，再用碘液處理，然后用酒精浸洗，看細(xì)胞是否能保留染料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有些細(xì)菌能保持紫色，另一些卻褪色.18正染色法(Positivestaining)負(fù)染色法(Negativestaining)對(duì)菌體或菌體內(nèi)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色對(duì)背景進(jìn)行染色，而菌體無(wú)色19紫色染料20嗜酸染色法（Eosinophilicstaining）識(shí)別引起麻風(fēng)的分支桿菌麻風(fēng)分支桿菌21印度墨汁染色細(xì)菌莢膜細(xì)菌莢膜22孔雀綠染細(xì)菌芽胞芽胞23除了用各種染料染色樣品以便清楚地觀察微生物外，還可以用各種發(fā)熒光的物質(zhì)來(lái)染色微生物樣品。例如現(xiàn)在可以用一種熒光染料來(lái)區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌。24電子顯微鏡觀察樣品的方法很多，基本上可以分為透射型和掃描型兩類(lèi)。前者是電子流通過(guò)觀察樣品而形成圖象；后者則是用來(lái)觀察微生物的表面細(xì)節(jié)，分辨率大約在7納米左右。3電鏡樣品的制備方法用電子顯微鏡觀察的樣品需要要經(jīng)過(guò)認(rèn)真細(xì)致的處理以至于今天出現(xiàn)了一門(mén)非常有用的技術(shù)科學(xué)—電子顯微鏡學(xué)251透射電子顯微鏡（TransmissionElectronMicroscope,TEM)的觀察樣品的主要制備方法：投影法在真空條件下，用電子散射能力強(qiáng)的重金屬原子來(lái)噴鍍樣品表面，這樣在樣品和沒(méi)有噴鍍的區(qū)域形成了較強(qiáng)的反差，而沒(méi)有噴鍍的部分成了樣品的投影，根據(jù)投影我們可以了解樣品的立體形狀、高度，通常用這種方法來(lái)觀察細(xì)菌的鞭毛或病毒的顆粒。2627負(fù)染法。將樣品的背景染色以突顯樣品，所以稱(chēng)為負(fù)染。一般是用電子密度高，本身不會(huì)顯示任何結(jié)構(gòu)，又和樣品不起反應(yīng)的物質(zhì)，例如磷鎢酸的鈉鹽將樣品包圍，同時(shí)染色劑還會(huì)投入觀察對(duì)象的內(nèi)部，這樣，既能顯示外形，又可在一定程度上反應(yīng)樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。用這種方法可以觀察細(xì)菌細(xì)胞、病毒等。28超薄切片法

這是最常用的方法，因?yàn)榭梢杂^察細(xì)胞或其它樣品內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。通常是要按照一定程序?qū)悠愤M(jìn)行固定，脫水，然后包埋在樹(shù)脂中作為支持物，用超薄切片機(jī)切成極薄的切片。因?yàn)橹挥性?0—100納米厚度的切片用投射電子顯微鏡才能觀察，所以一般細(xì)菌樣品，一個(gè)細(xì)胞要分割成10片到50片。294、冰凍蝕刻法所謂冰凍蝕刻，是把樣品放在-196℃的液態(tài)氮中迅速冷凍，然后加溫到-100℃，使樣品變得非常脆弱易碎，再用預(yù)先也冷卻到-196℃的非常鋒利的玻璃斷口切割經(jīng)冷凍的樣品，這樣使樣品在最容易斷裂的部位斷開(kāi)（如果是微生物細(xì)胞，則多半是沿內(nèi)膜中部），然后讓樣品放在真空條件下升華掉斷口處的冰，最后用重金屬?lài)婂冊(cè)摂嗫诒砻?，即可用電子顯微鏡觀察其結(jié)構(gòu)。用這種制備方法的優(yōu)點(diǎn)是可以避免在固定、脫水和包埋過(guò)程中造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的人為改變而形成的假象。30312掃描電子顯微鏡(ScanElectronMicroscope,SEM)掃描電子顯微鏡是用聚焦得很細(xì)的電子束在樣品表面掃描,電子激發(fā)樣品表面的原子放電，釋放出微細(xì)的電子簇（二次電子），用靈敏的檢測(cè)裝置可以捕獲它們，然后通過(guò)類(lèi)似電視機(jī)的原理將樣品圖象呈現(xiàn)出來(lái)。二次電子對(duì)檢測(cè)器的作用取決于樣品表面的性質(zhì)，當(dāng)電子激發(fā)樣品表面突起部位時(shí)，會(huì)有大量二次電子進(jìn)入檢測(cè)器，而表面凹陷處則只有少量二次電子進(jìn)入，所以可以顯出反差突出、明暗清晰的三維圖象。而且它的成像焦深較長(zhǎng)，圖象的立體感強(qiáng)，和肉眼所見(jiàn)差別不大。制備掃描電子顯微鏡的樣品也先要經(jīng)過(guò)固定、脫水等處理，以免在真空條件下變形失真，為了獲得較多的二次電子，表面要噴涂重金屬和碳原子。3233顯微鏡的問(wèn)世使人類(lèi)開(kāi)始認(rèn)識(shí)微生物，然而在對(duì)微生物的生命活動(dòng)和功能有所知曉之前，微生物學(xué)并沒(méi)有誕生。促使微生物學(xué)迅速誕生的，是無(wú)菌操作技術(shù)、分離技術(shù)和純培養(yǎng)技術(shù)。第二節(jié)無(wú)菌技術(shù)(Aseptictechnique)1無(wú)菌技術(shù)建立的歷史背景34微生物是從哪里來(lái)的？在列文虎克發(fā)現(xiàn)微生物后，這些成了當(dāng)時(shí)人們關(guān)心的問(wèn)題。有些人認(rèn)為是從沒(méi)有生命的物質(zhì)“自然發(fā)生”的，這就是古已有之的觀點(diǎn)，叫做自然發(fā)生論(abiogenesis,autogenesis,spontaneousgeneration)。自然發(fā)生論者認(rèn)為破布中會(huì)自然產(chǎn)生老鼠，污泥中會(huì)生出泥鰍，我國(guó)古代也有“腐草化為螢”的說(shuō)法。35意大利科學(xué)家斯巴蘭讓尼馬上就指出他的實(shí)驗(yàn)有許多漏洞，并且證明任何一種肉湯或菜汁，在充分煮沸并且密封后，只要里面沒(méi)有活的微生物，就不會(huì)腐敗。一頑固的自然發(fā)生論的信徒出來(lái)辯解，他們說(shuō)斯巴蘭讓尼在把液體煮沸并密封后，因?yàn)橐舶蜒鯕廒s走和隔絕了，所以微生物缺少營(yíng)養(yǎng)而不能生長(zhǎng)，并不是消滅了微生物本身。1749年，英國(guó)神父尼德漢發(fā)表文章，證明微生物可以自然發(fā)生。18世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)了氧氣，大家公認(rèn)沒(méi)有氧氣生物就不能生活36巴斯德這個(gè)簡(jiǎn)單但是具有說(shuō)服力的著名實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了微生物只能從微生物產(chǎn)生而不能自然地從沒(méi)有生命的物質(zhì)發(fā)生。而這個(gè)科學(xué)論斷的確立，為研究微生物奠定了基礎(chǔ)。在1861年，偉大的微生物學(xué)家巴斯德做了一個(gè)有名的實(shí)驗(yàn)—鵝頸瓶實(shí)驗(yàn)，從此結(jié)束了綿延100多年的爭(zhēng)論，把自然發(fā)生論趕出了科學(xué)界。37人們可以把不同的微生物從天然的混雜狀態(tài)下放在較少受其它微生物影響的條件下來(lái)研究。同時(shí)，無(wú)菌技術(shù)對(duì)于物資的保護(hù)、疾病的防治，也是非常重要的。現(xiàn)在，我們只要在操作中排除外來(lái)的微生物進(jìn)入我們的容器，就可以保證其中沒(méi)有生命我們?cè)趪?yán)格排除其它微生物混入的操作條件下把待研究的微生物放到事先殺死了全部生物的容器中，則其中只有我們要研究或觀察的對(duì)象，非此莫屬。人們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到無(wú)菌操作的重要。滅過(guò)菌的物質(zhì)在適當(dāng)保護(hù)下將保持無(wú)菌狀態(tài)，除非有人去感染它。巴斯德奠定了這個(gè)微生物學(xué)的基本原理。38巴斯德是第一個(gè)自覺(jué)地通過(guò)無(wú)菌技術(shù)實(shí)現(xiàn)食物保鮮和防治疾病的人，因?yàn)樗麖睦碚撋辖鉀Q了微生物不能自然發(fā)生的爭(zhēng)論。而英國(guó)外科醫(yī)生李斯特用石炭酸消毒方法的開(kāi)創(chuàng)，更是無(wú)菌技術(shù)給人類(lèi)帶來(lái)的巨大實(shí)惠。無(wú)菌技術(shù)的使用遠(yuǎn)在微生物學(xué)出現(xiàn)之前，例如用火燒或煮沸的方法保持食品衛(wèi)生或消滅病原的做法至少可以在幾千年前的文字中見(jiàn)到。近代有意識(shí)利用無(wú)菌技術(shù)的，是法國(guó)的廚師兼糖果制造商人尼可萊.阿佩爾（Nicolas,Appert），他發(fā)明了罐頭技術(shù)。阿佩爾花了14年的時(shí)間，完成了拿破侖懸賞征求的食品儲(chǔ)存方法。這種方法是把食品先加熱，然后把它密封起來(lái)與空氣隔絕。1809年拿破侖獎(jiǎng)勵(lì)了阿佩爾1萬(wàn)2千法郎，阿佩爾公開(kāi)了他的發(fā)明。這項(xiàng)重要發(fā)明當(dāng)時(shí)還不能完全說(shuō)清道理，直到巴斯德證實(shí)了微生物只能從微生物產(chǎn)生而不能自然地從沒(méi)有生命的物質(zhì)發(fā)生以后才為大家所理解和應(yīng)用。39采用無(wú)菌技術(shù)所達(dá)到的程度，可以是不同的。一般分為滅菌、消毒和防腐3個(gè)不同層次。滅菌Sterilization

消毒Disinfection防腐Anticorrosion化療Chemotherapy2消毒或滅菌的方法用物理或化學(xué)的方法殺滅物體內(nèi)外所有微生物用物理或化學(xué)的方法殺滅物體內(nèi)外所有病原微生物用物理或化學(xué)的方法抑制物體表面或內(nèi)部微生物的生長(zhǎng)采用化學(xué)治療劑殺滅或抑制動(dòng)物體內(nèi)微生物40在微生物學(xué)研究、微生物工業(yè)生產(chǎn)和大型手術(shù)中，為了獲得可靠的結(jié)果、保證生產(chǎn)的順利或避免感染，要求將器具、場(chǎng)地、環(huán)境進(jìn)行滅菌；而對(duì)于一般的食品，為了保證其營(yíng)養(yǎng)成分不受或少受破壞，所以通常只須采取消毒和防腐措施。我們通常在得了炎癥時(shí)服用抗生素或磺胺類(lèi)藥物抑制體內(nèi)的致病菌，也可以認(rèn)為是無(wú)菌技術(shù)的應(yīng)用。在培養(yǎng)某些需要生長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)間的微生物或組織時(shí)，通常要加入抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素。41實(shí)現(xiàn)消毒或滅菌的方法很多，基本上可以分為物理學(xué)方法和化學(xué)方法兩大類(lèi)。物理學(xué)方法主要包括加熱、低溫、過(guò)濾和電離輻射等。42加熱滅菌Heatingsterilization

加熱可以引起生命物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸和脂類(lèi)的破壞，從而導(dǎo)致其死亡。目前使用的有兩大類(lèi)，即干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌最常用的是火焰灼燒滅菌。這是最徹底的滅菌方法，但是并不是隨時(shí)隨處可以應(yīng)用的。我們常常用這種方法來(lái)處理病死的家畜家禽、實(shí)驗(yàn)室或發(fā)酵車(chē)間用于接種的工具滅菌。在要求滅菌后的器具干燥的情況下，通常也采用干熱空氣滅菌。例如用電熱干燥箱在160℃～180℃保持1～2h，可以將玻璃或金屬器皿完全滅菌。43濕熱滅菌的方法更多。因?yàn)樵谟兴蛩羝嬖诘臈l件下，細(xì)胞內(nèi)部更易遭受傷害，所以可以在較低的溫度和較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到滅菌的目的。微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞比較容易被殺死，而芽胞則較耐熱。44目前采用的濕熱滅菌方法有：1）常壓法巴斯德消毒法煮沸消毒法間歇滅菌法低溫維持法和高溫瞬時(shí)法兩種，前者是在63℃維持30分鐘，后者則是在72℃處理15秒在常壓下通過(guò)煮沸來(lái)達(dá)到消毒目的。例如在非高原地區(qū)將水加熱到100℃來(lái)消毒飲用水。又叫分段滅菌法，方法是：將要滅菌的液體在90-100℃加熱15分鐘以上，使?fàn)I養(yǎng)細(xì)胞死亡，然后將其冷卻到30℃，并保持這個(gè)溫度過(guò)夜，這時(shí)，滅菌樣品中沒(méi)有被殺死的芽孢因?yàn)闇囟冗m合而萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，到第二天再把該液體在90-100℃加熱15分鐘以上。如此重復(fù)3～4次，即可以將液體中的微生物全部殺死，達(dá)到滅菌的目的。某些做微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基，因?yàn)槟承┏煞衷?20℃左右容易破壞，就可以采用間歇滅菌法。452）加壓法又稱(chēng)高壓蒸汽滅菌法，因?yàn)樵诔^(guò)大氣壓的密閉容器中，水蒸汽的溫度可以大于100℃，更有利于殺死微生物。滅菌條件通常為121℃滅菌15-30min46低溫法抑菌冷凍和加熱的不同之處是這種方法不是簡(jiǎn)單地破壞微生物，而是抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖。低溫法抑菌在食品工業(yè)中采用最多，因?yàn)樵诘蜏叵拢?℃左右）大多數(shù)病原菌都不能生長(zhǎng)，在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和微生物工業(yè)中，這種方法不能起到滅菌的作用。一般在-20℃微生物就不會(huì)生長(zhǎng)了，因?yàn)榇藭r(shí)沒(méi)有液態(tài)的水供微生物活動(dòng)之用，也有些微生物可以被冰殺死，因?yàn)楸鶗?huì)破壞微生物細(xì)胞膜。低溫抑菌法可以用來(lái)保藏菌種、保藏食物等47過(guò)濾法除菌有些需要滅菌的材料不能受熱，例如許多維生素溶液。因此，許多液體可以用過(guò)濾法來(lái)滅菌。過(guò)濾法不是將微生物殺死，而是把它們排除出去。目前過(guò)濾除菌采用兩類(lèi)器具，一類(lèi)叫深層濾器，例如用燒結(jié)玻璃、不上釉的陶瓷顆?；蚴迚撼傻臑V板等：另一類(lèi)是濾膜。深層濾器已經(jīng)使用了100年以上，現(xiàn)在有逐漸被濾膜取代的趨勢(shì)，但因?yàn)榇罅砍恋砦锶菀锥氯麨V膜，所以一般先用深層濾器除去大的顆粒。濾膜一般由醋酸纖維素、硝酸纖維素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纖維材料制成。濾膜的孔徑一般為0.2微米，它可以濾除絕大多數(shù)微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。過(guò)濾法的最大缺點(diǎn)是不能濾除病毒48如圖所示，在一個(gè)漏斗形容器上部放置數(shù)片濾膜。右圖是整個(gè)過(guò)濾系統(tǒng)。待除菌的液體裝在三角瓶中（1），用蠕動(dòng)泵（2）將液體抽到過(guò)濾器（3）內(nèi)，濾過(guò)的液體進(jìn)入事先滅菌的瓶子中。12349過(guò)濾法用途廣泛，除在飲料、藥物生產(chǎn)中使用外，空氣也常常用過(guò)濾法除菌。我們通常做微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)滅過(guò)菌的容器一般用棉花塞堵在出口處，實(shí)際上就是過(guò)濾除去空氣中的微生物，使進(jìn)入容器的空氣中沒(méi)有微生物污染。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用的超凈臺(tái)也是用過(guò)濾法除菌。50輻射滅菌輻射滅菌是利用電磁輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)上的微生物的一種有效方法。用于滅菌的電磁波有微波、紫外線(xiàn)（UV）、X射線(xiàn)和γ射線(xiàn)等。它們都能通過(guò)特定的方式控制微生物生長(zhǎng)或殺死微生物。微波可以通過(guò)熱產(chǎn)生殺死微生物的作用紫外線(xiàn)使DNA分子中相鄰的嘧啶形成嘧啶二聚體，抑制DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄等功能，殺死微生物X射線(xiàn)和γ射線(xiàn)能使其它物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基（OH·H）再作用于生物分子，或者直接作用于生物分子，打斷氫鍵、使雙鍵氧化、破壞環(huán)狀結(jié)構(gòu)或使某些分子聚合等方式，破壞和改變生物大分子的結(jié)構(gòu)，從而抑制或殺死微生物?？梢?jiàn)光在長(zhǎng)時(shí)間照射后，也能損害微生物或殺死它們，因?yàn)樗泄夂仙锖腥~綠素（或細(xì)菌葉綠素）、細(xì)胞色素、黃素蛋白等光敏感色素，它吸收光能變成激發(fā)態(tài)或被活化，并將吸收的能量轉(zhuǎn)移到氧，產(chǎn)生氧自由基作用于細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體突變或死亡。51實(shí)行輻射滅菌的裝置包括微波爐、紫外光燈、陰極射線(xiàn)管、X射線(xiàn)發(fā)生器、放射性核素等。商業(yè)上用于大量物品滅菌使用的放射性源是鈷-60和銫-137，它們發(fā)射出γ射線(xiàn)，相對(duì)而言比較廉價(jià)。輻射滅菌用途很廣，例如醫(yī)療器械和用具（如注射器燈）、食品、實(shí)驗(yàn)室的許多塑料制品和多種培養(yǎng)基都是用這種方法滅菌。52化學(xué)滅菌用于抑制微生物生長(zhǎng)或殺死微生物的化學(xué)藥品很多，我們可以通稱(chēng)為化學(xué)滅菌劑。在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究和保藏物資或食品上化學(xué)滅菌方法也有重要用途。5354553保持無(wú)菌狀態(tài)Maintainsterileconditions

另外，我們還要防止所研究的微生物，特別是致病微生物或經(jīng)過(guò)基因工程改造了的本來(lái)自然界不存在的微生物從我們的實(shí)驗(yàn)容器中逃逸到外界環(huán)境中去。為了這些目的，在微生物學(xué)中，有許多措施。在獲得了無(wú)菌環(huán)境和無(wú)菌材料后，我們還要保持無(wú)菌狀態(tài)，才能對(duì)某種特定的已知微生物進(jìn)行研究或利用，否則外界的各種微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的現(xiàn)象，在微生物學(xué)中我們叫做污染雜菌。防止污染是微生物學(xué)工作中十分關(guān)鍵的技術(shù)。一方面是徹底滅菌，另一方面防止污染，是無(wú)菌技術(shù)的兩個(gè)方面。56無(wú)菌室外要設(shè)一個(gè)緩沖間，緩沖間的門(mén)和無(wú)菌室的門(mén)不要朝向同一方向，以免氣流帶進(jìn)雜菌。門(mén)多用推拉式，便于快速啟閉。無(wú)菌室和緩沖間都必須密閉。室內(nèi)裝備的換氣設(shè)備必須有空氣過(guò)濾裝置。無(wú)菌室內(nèi)的地面、墻壁必須平整，不易藏污納垢，便于清洗。工作臺(tái)的臺(tái)面應(yīng)該處于水平狀態(tài)。無(wú)菌室和緩沖間都裝有紫外線(xiàn)燈，無(wú)菌室的紫外線(xiàn)燈距離工作臺(tái)面1米。工作人員進(jìn)入無(wú)菌室應(yīng)穿滅過(guò)菌的服裝，戴帽子。無(wú)菌室Sterileroom

一般是在微生物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)專(zhuān)辟一個(gè)小房間。可以用板材和玻璃建造。面積不宜過(guò)大，約4—5平方米即可，高2.5米左右。57無(wú)菌室平面圖58通過(guò)電動(dòng)裝置使空氣通過(guò)高效過(guò)濾器具后進(jìn)入工作臺(tái)面，使臺(tái)面始終保持在流動(dòng)無(wú)菌空氣控制之下。而且在接近外部的一方有一道高速流動(dòng)的氣簾防止外部帶菌空氣進(jìn)入。超凈臺(tái)是20世紀(jì)80年代開(kāi)始問(wèn)世的一種防止污染的裝置。其主要功能是利用空氣層流裝置排除工作臺(tái)面上部包括微生物在內(nèi)的各種微小塵埃。5960結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于移動(dòng)，箱正面開(kāi)有兩個(gè)洞，不操作時(shí)用推拉式小門(mén)擋住，操作時(shí)可以將雙臂伸進(jìn)去。正面上部裝有玻璃，便于在內(nèi)部操作，箱內(nèi)部裝有紫外線(xiàn)燈，從側(cè)面小門(mén)可以放進(jìn)去器具和菌種等。無(wú)菌箱611純種分離技術(shù)的發(fā)展過(guò)程2純種分離的主要方法第三節(jié)分離技術(shù)SeparateTechnique62在自然界中，各種微生物之間并不是離群索居，彼此老死不相往來(lái)的。在任何天然環(huán)境中，都有多種微生物共同生活。要了解某種微生物對(duì)于人類(lèi)有害還是有益，或者目前與人類(lèi)還沒(méi)有什么特別密切的關(guān)系，就必須單獨(dú)把這種微生物分離出來(lái)研究。這就是在無(wú)菌技術(shù)的基礎(chǔ)上微生物學(xué)的另一項(xiàng)基本技術(shù)——純種分離技術(shù)。1純種分離技術(shù)的發(fā)展過(guò)程63要從含有成億個(gè)細(xì)胞，成百個(gè)種類(lèi)微生物的樣品中分離出某種微生物，并不是容易的事。第一個(gè)成功地分離出純種細(xì)菌的，是前面提到過(guò)的在手術(shù)中采用消毒劑的醫(yī)生李斯特。關(guān)鍵在于他發(fā)明了一種可以取出數(shù)量可以小到0.00062毫升牛奶的微量注射器。64李斯特用不含任何微生物的滅過(guò)菌的水稀釋極少量的牛奶，再把稀釋的牛奶分裝在幾個(gè)滅過(guò)菌的酒杯中，成功地分離出制造酸奶用的乳酸鏈球菌（Streptococcuslactis）。這種方法經(jīng)過(guò)100多年的改進(jìn)，現(xiàn)在仍然是一種分離純種微生物的常用方法，叫做系列稀釋法，也叫倍減稀釋法（Ten-FoldDilutedMethod

）。65十倍遞減稀釋法（Ten-FoldDilutedMethod)66真正解決問(wèn)題的純種分離方法，是著名的德國(guó)醫(yī)生，偉大的微生物學(xué)奠基人之一科赫和他的研究小組建立起來(lái)的?？坪赵诿髂z中加上一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（例如肉質(zhì)）加熱融化后倒在一片滅過(guò)菌的玻璃片上，待其凝固用在火焰上燒紅過(guò)、因而燒死了全部原來(lái)附著的微生物的白金絲蘸上一點(diǎn)要分離的樣品在凝固的明膠上輕輕劃動(dòng)，使樣品中的很少量微生物沾在明膠上，然后用玻璃罩蓋上玻璃片，以防空氣中的雜菌落下污染。幾天后，明膠板上便長(zhǎng)出一個(gè)個(gè)彼此分開(kāi)的菌落由于明膠是透明的，所以很容易觀察因?yàn)榘捉鸾z燒紅后很快便會(huì)冷卻，立即用來(lái)蘸樣品時(shí)也不會(huì)燒死樣品中我們需要分離的微生物?，F(xiàn)在我們用電爐絲代替，價(jià)格便宜多了，這就是我們今天常見(jiàn)的接種針和接種環(huán)這種方法叫劃線(xiàn)分離法67平板劃線(xiàn)分離法（StreakPlateMethod）6869另一位助手Petri又設(shè)計(jì)了一種圓形的有邊的，可以對(duì)著蓋起來(lái)的培養(yǎng)器具，使得融化的洋菜或明膠不會(huì)隨便亂流，又可以避免污染雜菌，這就是每個(gè)微生物學(xué)工作者都非常熟悉的培養(yǎng)皿（PetriPlate）。但是，明膠在攝氏20多度會(huì)融化，在一般細(xì)菌生長(zhǎng)需要的37℃下不能成為固體，菌落便不可能形成?？坪盏闹諬eese在他妻子的提示下，發(fā)現(xiàn)用洋菜（學(xué)名叫瓊脂agar，一種做果醬的植物膠）代替明膠，可以克服明膠在37℃會(huì)融化的缺點(diǎn)70柯赫（RobertKoch）的助手WHeese和他的夫人FranHeese71為了排除這個(gè)疑點(diǎn)，當(dāng)時(shí)人們采用反復(fù)多次，并仔細(xì)用顯微鏡檢查的辦法。后來(lái)，有人發(fā)明了可以在顯微鏡下用極細(xì)的玻璃絲挑取單個(gè)細(xì)胞的工具——單細(xì)胞分離器，純種分離的技術(shù)便成熟了。我們也許會(huì)提出一個(gè)疑點(diǎn)：在馬鈴薯片或瓊脂上長(zhǎng)出的菌落真是由一個(gè)微生物細(xì)胞繁殖來(lái)的嗎？可能不是!長(zhǎng)期實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)告訴我們，盡管不用單細(xì)胞分離器有一定風(fēng)險(xiǎn)，但是用稀釋法或劃線(xiàn)分離法，在適當(dāng)重復(fù)操作后，在很大程度上可以達(dá)到純種分離的目的。72為了獲得單一類(lèi)型微生物，即純培養(yǎng)物Pureculture，微生物學(xué)家通常采用稱(chēng)作富集培養(yǎng)的技術(shù)。所謂富集，就是指在分離純培養(yǎng)之前，通過(guò)這種技術(shù)使需要分離的對(duì)象在培養(yǎng)基中盡量生長(zhǎng)得多一點(diǎn)。為了富集，首先要選擇好適合對(duì)象微生物的培養(yǎng)基，微生物學(xué)家稱(chēng)為選擇性培養(yǎng)基(Selectivemedium)。73根據(jù)這個(gè)原理，我們?nèi)绻氲玫骄哂心撤N特定功能的微生物，首先可以用選擇培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行富集。如果我們想得到能夠分解橡膠或塑料的微生物，就可以在培養(yǎng)基中加進(jìn)橡膠或塑料。雖然我們?cè)谧匀唤缰锌梢砸?jiàn)到一些對(duì)簡(jiǎn)單的富集技術(shù)無(wú)動(dòng)于衷的微生物，但一般說(shuō)來(lái)，富集培養(yǎng)是尋求微生物純培養(yǎng)的第一步。74一個(gè)簡(jiǎn)單的例子是引起傷寒的傷寒桿菌，當(dāng)剛從傷寒病患者體內(nèi)分離出來(lái)時(shí)，常常需要向培養(yǎng)基中補(bǔ)加一種氨基酸促進(jìn)它們生長(zhǎng)，但在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)幾次后，它們?nèi)菀讍适Т朔N特性，即變得能夠自己制造這種氨基酸了，當(dāng)用該菌株去感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并再度分離它時(shí)，它又恢復(fù)了需要氨基酸的這一特性。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中分離純化的微生物是否與自然界實(shí)際存在的完全一致呢？這是個(gè)問(wèn)題?!已故的荷蘭卓越微生物學(xué)家克魯維教授早就指出，所有的細(xì)菌培養(yǎng)物均是實(shí)驗(yàn)室的人工產(chǎn)物，為了適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的生長(zhǎng)條件，這些微生物的特性已經(jīng)起了變化。我們必須牢記，不要把實(shí)驗(yàn)室中微生物材料的表現(xiàn)完全等同它們?cè)谧匀画h(huán)境中的情況。752純種分離的主要方法用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)單細(xì)胞（孢子）分離法選擇培養(yǎng)分離法76用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)1、稀釋倒平板法(PourPlateMethod2、涂布平板法(SpreadPlateMethod)操作較麻煩，對(duì)好氧菌、熱敏感菌效果不好！使用較多的常規(guī)方法，但有時(shí)涂布不均勻！77用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)3、平板劃線(xiàn)法78用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)3、平板劃線(xiàn)法79用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)4、厭氧微生物的分離厭氧罐厭氧手套箱80用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)4、厭氧微生物的分離厭氧罐厭氧手套箱81用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)4、厭氧微生物的分離稀釋搖管法82用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)0.0480.048+0.0012+0.0002=0.975稀釋法進(jìn)行液體分離必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過(guò)95%）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。例如：若同一稀釋度的試管中有95%表現(xiàn)為不生長(zhǎng)，則生長(zhǎng)的試管中僅含一個(gè)細(xì)胞的幾率為：4.8%；含二個(gè)細(xì)胞的幾率為：0.12%；含三個(gè)細(xì)胞的幾率為：0.002%在有細(xì)菌生長(zhǎng)的試管中得到純培養(yǎng)的幾率為97.5%831878年，Lister分離乳酸鏈球菌時(shí)所使用的微量注射器和酒杯培養(yǎng)裝置注射器的最小吸取量：0.00062毫升8485單細(xì)胞（孢子）分離一般采用顯微操作儀，在顯微鏡下進(jìn)行；操作難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比；86選擇培養(yǎng)分離法抑制大多數(shù)其它微生物的生長(zhǎng)；使待分離的微生物生長(zhǎng)更快；使待分離的微生物在群落中的數(shù)量上升，方便用稀釋法對(duì)其進(jìn)行純化。微生物群落中數(shù)量占少數(shù)的微生物的分離純化：（沒(méi)有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿(mǎn)足自然界中一切生物生長(zhǎng)的要求，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。）使待分離的微生物生長(zhǎng)“突出”；直接挑取待分離的微生物的菌落獲得純培養(yǎng)。87選擇培養(yǎng)分離1.利用選擇平板進(jìn)行直接分離待分離的微生物生長(zhǎng)，其它微生物的生長(zhǎng)被抑制高溫下培養(yǎng)：分離嗜熱細(xì)菌；培養(yǎng)基中不含N：分離固氮菌；培養(yǎng)基加抗生素：分離抗性菌；88選擇培養(yǎng)分離1.利用選擇平板進(jìn)行直接分離待分離的微生物的生長(zhǎng)特征明顯不同于其它微生物顏色反應(yīng)：分離特定的菌株；牛奶平板：分離蛋白酶產(chǎn)生菌；利用特定細(xì)菌的滑動(dòng)特點(diǎn)進(jìn)行分離純化；899091選擇培養(yǎng)分離2.富集培養(yǎng)從自然界中分離到所需的特定微生物特定的環(huán)境條件僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加922.富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家最強(qiáng)有力的技術(shù)手段之一。營(yíng)養(yǎng)和生理?xiàng)l件的幾乎無(wú)窮盡的組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要。根據(jù)微生物的特殊要求，從自然界分離出特定已知微生物種類(lèi)；分離培養(yǎng)在特定環(huán)境中能生長(zhǎng)的微生物；93無(wú)菌操作和純種分離技術(shù)確立以后，一方面分離了一大批純種微生物，極大地推動(dòng)了傳染病學(xué)和工業(yè)微生物學(xué)的發(fā)展，一方面又提出如何獲得大量純種培養(yǎng)物的要求。第四節(jié)培養(yǎng)技術(shù)CultureTechnique因?yàn)樵谘芯坎≡⑸飼r(shí)，尤其是采用打預(yù)防針的辦法防治疾病時(shí)要制備疫苗或菌苗需要有大量的微生物細(xì)胞；在工業(yè)上例如生產(chǎn)啤酒時(shí)也需要大量的純種酵母菌。因此，純種培養(yǎng)技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生了。94因?yàn)榕囵B(yǎng)好的微生物則稱(chēng)作培養(yǎng)物(Culture)，只有一種微生物的培養(yǎng)物稱(chēng)為純培養(yǎng)（PureCulture）。采用無(wú)菌操作，微生物學(xué)家們?cè)趯?shí)驗(yàn)室里，為微生物制備的各種適合微生物良好生長(zhǎng)的基質(zhì)，稱(chēng)作培養(yǎng)基(medium)。把純種微生物放進(jìn)培養(yǎng)基里讓它們生長(zhǎng)的操作，叫做接種(inoculation)。這樣可以保持培養(yǎng)微生物的“純一”。1培養(yǎng)基(medium)95如何配制某種特定微生物的最佳培養(yǎng)基，是微生物學(xué)中的重要課題。有些微生物目前還不能用人工配制的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)，必須采用活的生物或組織。沒(méi)有一種培養(yǎng)基