標準解讀

《GB/T 22917-2008 豬水泡病病毒熒光RT-PCR檢測方法》是一項國家標準，旨在規(guī)范豬水泡病病毒（SVDV）的檢測流程。該標準詳細描述了使用熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術對豬水泡病病毒進行定性檢測的方法。以下是對該標準主要內容的說明：

首先，標準明確了實驗所需的主要儀器設備和試劑，包括但不限于實時熒光定量PCR儀、微量離心機、核酸提取試劑盒等，并且強調了實驗室應具備的基本條件以確保檢測結果準確可靠。

接著，對于樣品處理部分，給出了具體的采樣部位建議如口腔拭子、皮膚病變處等，并提供了詳細的樣本保存與運輸指南，確保樣本質量不受影響。

在RNA提取環(huán)節(jié)，推薦采用商業(yè)化的RNA提取試劑盒，并按照說明書操作完成總RNA的抽提過程。此外，還特別指出了防止RNA降解的重要性以及采取相應措施的方法。

隨后是cDNA合成步驟，利用隨機引物或特異性引物將提取得到的RNA反轉錄為互補DNA(cDNA)。此過程中需嚴格控制反應體系及溫度條件，以保證cDNA的有效生成。

核心部分即熒光RT-PCR擴增階段，標準中列出了針對SVDV特定區(qū)域設計的引物序列及其探針信息，同時規(guī)定了最佳退火溫度、循環(huán)數(shù)等參數(shù)設置。通過比較目標基因片段與內參基因的Ct值差異來判斷樣本是否含有豬水泡病病毒。

最后，在結果分析方面，《GB/T 22917-2008》提出了一套基于閾值法判定陽性與否的標準，并要求每個批次都設立陰性對照、陽性對照以及無模板對照以驗證整個檢測系統(tǒng)的有效性。

以上內容涵蓋了從樣本采集到最終報告出具的全過程指導，為實驗室開展豬水泡病病毒熒光RT-PCR檢測提供了科學依據(jù)和技術支持。


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  • 現(xiàn)行
  • 正在執(zhí)行有效
  • 2008-12-31 頒布
  • 2009-05-01 實施
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文檔簡介

犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國國家標準

犌犅／犜２２９１７—２００８

豬水泡病病毒熒光犚犜犘犆犚檢測方法

犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犳犾狌狅狉狅犵犲狀犻犮犚犜犘犆犚犳狅狉狊狑犻狀犲狏犲狊犻犮狌犾犪狉犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊

２００８１２３１發(fā)布２００９０５０１實施

中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局

發(fā)布

中國國家標準化管理委員會

書

犌犅／犜２２９１７—２００８

前言

本標準參考了世界動物衛(wèi)生組織（ＯＩＥ）《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊（哺乳動物、禽鳥與蜜蜂）》

（第５版）。

本標準的附錄Ａ為規(guī)范性附錄。

本標準由中華人民共和國農業(yè)部提出。

本標準由全國動物防疫標準化技術委員會歸口。

本標準起草單位：中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國云南出入境檢驗檢

疫局。

本標準主要起草人：花群義、盧體康、呂建強、阮周曦、楊云慶、周曉黎、楊素、董俊、陳書琨。

Ⅰ

書

犌犅／犜２２９１７—２００８

豬水泡病病毒熒光犚犜犘犆犚檢測方法

１范圍

本標準規(guī)定了豬水泡病病毒熒光ＲＴＰＣＲ檢測的操作方法。

本標準適用于動物及其產(chǎn)品中豬水泡病病毒的檢測。

２縮略語

下列縮略語適用于本標準。

２．１熒光犚犜犘犆犚

熒光反轉錄聚合酶鏈反應。

２．２犆狋值

每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

２．３犚犖犃

核糖核酸。

２．４犇犈犘犆

焦碳酸磷酯。

２．５犘犅犛

磷酸鹽緩沖鹽水，配方見附錄Ａ。

２．６犜犪狇酶

犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。

２．７犛犞犇犞

豬水泡病病毒。

３原理

根據(jù)豬水泡病病毒的基因特定序列，合成一對特異性引物和一條特異性的熒光雙標記探針。引物

和探針通過嚴格的設計和篩選，涵蓋已報道的所有豬水泡病病毒的毒株。熒光探針的５′端標記ＦＡＭ

熒光素，３′端標記ＴＡＭＲＡ熒光素，它在近距離內能吸收５′端報告熒光基團發(fā)出的熒光信號。擴增時，

由于犜犪狇酶的５′→３′的外切活性，在延伸到熒光探針時，將其切斷，兩基團分離，淬滅作用消失，熒光信

號產(chǎn)生。因此，可以通過檢測熒光信號對核酸模板進行檢測。

４材料與試劑

４．１儀器與器材

４．１．１熒光ＲＴＰＣＲ檢測儀。

４．１．２高速臺式冷凍離心機（離心速度１２０００ｒ／ｍｉｎ以上）。

４．１．３臺式離心機或手掌式離心機（離心速度３０００ｒ／ｍｉｎ）。

４．１．４混勻器。

４．１．５冰箱（２℃～８℃和－２０℃兩種）。

４．１．６微量可調移液器（５μＬ，１０μＬ，１００μＬ，１０００μＬ）及配套帶濾芯吸頭。

４．１．７１．５ｍＬ、０．５ｍＬ硅化Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管：將Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管和滴頭浸泡于含有０．１％

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