實驗三常見毒物亞硝酸鹽定性檢驗一、實驗目的與要求了解毒物定性檢驗的基本原理、毒物的性質。熟練地掌握毒物的檢測方法，懂得運用定性檢測結果，結合臨床、綜合分析對動物中毒作出較為確切的判定。二、實驗方法與步驟動物亞硝酸鹽中毒，多數是采自亞硝酸鹽含量很高的飼料而發(fā)生。將新鮮白菜切碎置于10℃氣溫下，自然風干腐爛，在2～3d內亞硝酸鹽含量略有增加，第4天急劇上升至190mg/kg，第7天達到最高（2609mg/kg）。將這種切碎的新鮮白菜置于37℃保溫時，第2天亞硝酸鹽的含量急劇上升達最高值（504mg/kg），出現亞硝峰。青飼料在鍋里微火慢煮時，經硝化菌作用，亞硝酸鹽轉化最快、最多。（一）聯苯胺－冰醋酸法【原理】

亞硝酸鹽在酸性溶液中將聯苯胺重氮化成一種醌式化合物而呈現棕紅色?！驹噭?/p>

準確稱取0.1g聯苯胺溶于10mL冰醋酸中，加水稀釋至100mL過濾制成聯苯胺－冰醋酸試劑。（一）聯苯胺－冰醋酸法【操作方法】取碾碎的飼料樣或切碎的青飼料，或取可疑的剩余飼料、嘔吐物或胃內容物5～10g，置于100mL帶塞三角瓶中，加70℃熱水30～50mL，放置10～15min，過濾液作待檢液。取檢液2滴，置白瓷板上或小試管中，加1滴聯苯胺－冰醋酸試劑，如有亞硝酸鹽存在，出現紅棕色、同時作陽性（亞硝酸空白）或陰性對照實驗。（二）安替比林法【原理】

亞硝酸鹽在酸性溶液中將使安替比林亞硝基代，溶液里綠色?！驹噭?g安替比林溶于100mL1mol/L硫酸（30ml濃硫酸緩慢進入適量蒸餾水中，冷卻至室溫，并稀釋至100ml）中制成安替比林試劑。（二）安替比林法【操作方法】

取檢液1滴，置于白瓷板上滴加1滴安替比林試劑，若出現綠色，示有亞硝酸鹽存在。

由于微量亞硝酸鹽，自然界廣泛存在，加之定性檢驗方法顯色的靈敏度高。因此在必要的情況應進行定量檢驗，方可判定亞硝酸鹽中毒。實驗四酮體檢測

酮體包括乙酰乙酸、β－羥丁酸和丙酮，前二者是脂質代謝的中間代謝產物，后者是一種剩余物。當碳水化合物缺乏時，酮體的產生增多，此時糖異生作用增強。在這種情況下，在三羧酸循環(huán)中草酰乙酸缺乏，導致乙酰輔酶A增多，后者則是生酮的先質。酮體的腎閾值較低，故在測出酮血癥之前，通常就已出現酮尿。一、酮體的定性試驗

通常采用亞硝基鐵氰化鈉反應。該反應對乙酰乙酸是特異性的，對丙酮也有一些反應，但對β－羥丁酸不起反應，而β－羥丁酸在酮血癥中占主要成分，因此反應程度與酮病的嚴重程度并無一致的關系。該方法簡便易行，可用酮粉法或配置的液體試劑測定奶、尿或血清樣品。一、酮體的定性試驗酮粉配制：取硫酸銨100g，無水碳酸鈉50g，亞硝基鐵氰化鈉3g，研碎混勻備用。操作方法：在短試管內或凹狀試板上加酮粉試劑1g，滴加被檢樣品，數分鐘后呈高錳酸鉀樣紅色為陽性反應。在乳牛場內，可對乳牛于產前1周至產后5周的時間內，每周2次測定尿液pH值和尿液或乳中酮體，pH值呈酸性或酮體呈陽性應予以注意，采用碳酸氫鈉、葡萄糖等治療。二、酮體的定量試驗

微量凱氏蒸餾、水楊醛比色法。該法可測得全量酮體。樣品以氫氧化鋇和硫酸鋅去除蛋白，其中丙酮首先被蒸餾分離，乙酰乙酸和β－羥丁酸經先后加入硫酸和重鉻酸鉀氧化，變成丙酮而蒸餾，蒸餾液與芳香族醛在堿性條件下發(fā)生紅色反應?！就w的臨床意義】

出現酮血癥或酮尿癥，表明機體脂肪和能量代謝紊亂。常見于奶牛酮病、綿羊妊娠毒血癥、母牛肥胖綜合征、真胃變位、糖尿病性酮酸中毒、長期饑餓等。實驗五動物血清轉氨酶的測定實驗目的與要求初步掌握血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）測定的實驗條件、方法和步驟。了解本次所測定血清酶的臨床意義。血清ALT的測定血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）作用于丙氨酸及α-酮戊二酸組成的基質，產生丙酮酸及谷氨酸?！驹怼垦錋LT的測定丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，再與同樣處理的丙酮酸標準液進行比色，計算出酶的單位。血清ALT的測定【試劑】0.1mol/L磷酸氫二鈉：磷酸氫二鈉（含兩個結晶水）17.6g溶解于水中，并加水1000ml，冰箱內保存。0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀13.6g溶解于水中，加水至1000ml，冰箱內保存。0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）：將420ml0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液和80ml0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液混勻，置冰箱內保存。血清ALT的測定基質緩沖液（DL-丙氨酸200mmol/L，α-酮戊二酸2mmol/L）：精確稱取1.79gDL-丙氨酸和29.2mgα-酮戊二酸，先溶于約50ml0.1mol/L磷酸緩沖液中，用0.1mol/L氫氧化鈉（約0.5ml）調節(jié)到pH7.4，再加磷酸緩沖液至100ml，置冰箱內保存，可穩(wěn)定2周。基質中可加麝香草酚（每毫升基質加入0.9g）防腐。置冰箱內至少可保存1個月。分裝安瓶滅菌后，室溫至少可用3個月。血清ALT的測定1mmol/L2,4-二硝基苯肼溶液：稱19.8mg2,4-二硝基苯肼，溶解于100ml1mol/L鹽酸中，置是室溫中保存。0.4mol/L氫氧化鈉溶液：將16.0g氫氧化鈉溶解于水中，并加至100ml，置具塞塑料試劑瓶中，室溫可長期保存。2mmol/L丙酮酸標準溶液：準確稱取22.0mg丙酮酸（AR），置于1000ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸至刻度。血清ALT的測定【操作方法】

在測定前，將基質在37℃水浴箱內預溫5min使用。具體操作按表1-1進行。管號測定管對照管血清（ml）0.10.1基質溶液（ml）0.5—表1-1ALT測定操作步驟血清ALT的測定

各管混勻后，在37℃水浴保溫20min，然后每管加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml，室溫放置10min，在505nm以蒸餾水校正零點，讀取各管的吸光度。測定管吸光度減去對照管吸光度后，從標準曲線查得ALT活力單位。2,4-二硝基苯肼溶液（ml）0.50.5基質溶液（ml）—0.5混勻后，在37℃水浴中保溫30min。血清ALT的測定【標準曲線繪制】按表1-2向各管中加入相應試劑。管號012340.1mol/L磷酸緩沖液（ml）0.100.100.100.100.102mmol/L丙酮酸標準液（ml）00.050.100.150.20基質緩沖液（ml）0.500.450.400.350.30相當于酶活力（卡門氏單位）0285797150表1-2ALT各標準管的配制血清ALT的測定各管加入2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml，混勻，37℃20min后加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液0.5ml?；靹?，放置10min后在505nm比色，以蒸餾水調零點，讀取各管吸光度。各管吸光度減去“0”號管吸光度，所得差值與對應得卡門氏酶活力單位作圖?！九R床意義】很多臟器都含有ALT，其分布大致為肝＞腎＞心＞肌肉。肝內ALT活性遠遠超過其它臟器的活性，主要存在于肝細胞質的可溶性部分，測定ALT對反映肝臟損害具有特殊意義。血清ALT活性增高原因：急性病毒性肝炎；骨骼肌、腎臟及胰腺等組織壞死；伴有急性肝炎的傳染性單核細胞增多癥；嚴重心肌梗塞、心力衰竭時的肝郁血；膽道疾病、肝外癌性膽道梗阻性黃疸、膽石癥、膽管炎及膽囊炎；藥物、酒精、鉛、汞、四氯化碳等中毒；外科手術、麻醉、劇烈運動、早期妊娠等。血清ALT的測定血清ALT的測定【注意事項】溶血的血清可能會引起測定管吸光度增加，因此，檢測此類標本時，應做血清標本對照管。當血清的標本酶活性超過150卡門單位時，應將血清用生理鹽水稀釋后再進行測定。血清ALT的測定【注意事項】加入2,4-二硝基苯肼溶液后，應充分反應混勻，使反應完全，加氫氧化鈉溶液方法要一致，不同方法會導致吸光度讀數的差異?；|中的α-酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼均為呈色物質，稱量必須準確，每批試劑的空白管吸光度上下波動不用超過0.015，如超出此范圍應檢查試劑及儀器方面等問題。血清AST的測定血清中門冬氨酸氨基轉移酶（AST）作用于天門冬氨酸及α-酮戊二酸組成的基質，產生草酸乙酸及谷氨酸。草酸乙酸脫羧基后最終產物也是丙酮酸?！驹怼垦錋ST的測定丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，再與同樣處理的丙酮酸標準液進行比色，計算出酶的單位。血清AST的測定【試劑】0.1mol/L磷酸緩沖液，PH7.01mmol/L2,4-二硝基苯肼4mol/L氫氧化鈉2mmol/L丙酮酸標準液以上四種試劑與ALT比色法相同。血清AST的測定【試劑】AST基質液（DL-門冬氨酸200mmol/L，α-酮戊二酸2mmol/L）：稱取α-酮戊二酸29.2mg和DL-門冬氨酸2.66g，置于一小燒杯中，加入1mol/L氫氧化鈉約1.5ml，溶解，加0.1mol/L磷酸緩沖液約50ml，校正至pH7.4，然后將溶液移入100ml容量瓶中，用磷酸緩沖液稀釋至刻度，放置冰箱保存。血清AST的測定【操作方法】同ALT比色測定法，但酶反應作用時間改為60min。血清AST的測定【標準曲線繪制】標準曲線繪制按表1-3向各管加入相應試劑。表1-3AST各標準管的配制管號012340.1mol/L磷酸緩沖液（ml）0.100.100.100.100.10基質液（ml）0.500.450.400.350.30丙酮酸標準液（ml）00.050.100.150.20相當于丙酮酸試劑含量(umol)00.100.200.300.40相當于酶活力（卡門氏單位）024