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文檔簡介
貨號:QS3603
規(guī)格:50管/48
樣尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucosepyrophosphosphprylase,UGP)試劑盒說明書注意:正式測定以前選擇
紫外分光光度法2-3個預(yù)期差別大的樣本做展望定。測定意義:UDPG焦磷酸化酶是生物體糖原合成過程中的重點酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化,將1-磷酸葡萄糖與UTP分子合成為UDP葡-萄糖(UDPG)。測定原理:UGP可逆催化反響生成1磷酸葡萄糖,在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH,340nm的吸光值增添快率反應(yīng)了UGP活性。自備實驗用品及儀器:天平、低溫離心計、研缽、紫外分光光度計、1mL石英比色皿。試劑構(gòu)成和配制:提取液:液體50mL×1瓶,4℃保留。試劑一:液體25mL×1瓶,4℃避光保留。試劑二:粉劑×1瓶,-20℃避光保留。臨用前加5mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保留,嚴禁頻頻凍融。試劑三:粉劑×1瓶,-20℃避光保留。臨用前加5mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保留,嚴禁頻頻凍融。試劑四:粉劑×1瓶,-20℃避光保留。臨用前加5mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保留,嚴禁頻頻凍融。試劑五:液體5mL×1瓶,4℃保留。酶液提?。航M織:依據(jù)質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比率(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。細胞:依據(jù)細胞數(shù)目(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比率(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破裂細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);而后4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。液體:直接檢測。測定操作:分光光度計預(yù)熱30min,調(diào)理波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。取1mL石英比色皿,挨次加入500μL試劑一,100μL試劑二,100μL試劑三,100μL試劑四,100μL試劑五,100μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm處30s的吸光值A(chǔ)1和330s的吸光值A(chǔ)2,△A=A2-A1計算公式:(1)按仍舊本蛋白濃度計算酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘耗費1nmol的NADP定義為一個酶活力單位。UGP(nmol/min/mgprot)=[A÷(ε×d)×V反總×109]÷(V樣×Cpr)T=321.54×ΔA÷Cpr(2)按仍舊實質(zhì)量計算酶活單位定義:每克組織每分鐘耗費1nmol的NADP定義為一個酶活力單位。UGP(nmol/min/g鮮重)=[A÷(ε×d)×V反總×109]÷(W×V樣÷V樣總)T=321.54×ΔA÷W(3)依據(jù)細胞數(shù)目計算酶活單位定義:每104個細胞每分鐘耗費1nmol的NADP定義為一個酶活力單位。UGP(nmol/min/104cell)=[A÷(ε×d)×V反總×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.643×ΔA(4)依據(jù)液體體積計算酶活單位定義:每毫升液體每分鐘耗費1nmol的NADP定義為一個酶活力單位。UGP(nmol/min/mL)=[9A÷(ε×d)×V反總×10]÷V樣÷T=321.54×ΔAV反總:反響系統(tǒng)整體積,1×10-3L;ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.1m
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