第十一章

常用動物實驗技術

動物實驗技術是實驗動物科學的主要組成部分，是生命科學研究的主要手段之一。它包括動物實驗的設計，實驗動物的選擇、應用；實驗設備的應用；試劑、樣品的篩選、配制、應用；實驗后實驗動物的飼養(yǎng)、觀察、實驗樣品的采集、處理等多方面的知識。在生命科學研究的各個學科都有其不同的應用，實驗方法也是多種多樣的。但一些基本技術是許多學科的實驗都要應用的，我們稱為常用動物實驗技術，是動物實驗工作者必須掌握的基本功。一、動物實驗前應注意的問題動物實驗前要做好充分的準備，選擇好合格的實驗場所，實驗后動物的飼養(yǎng)場所等。動物實驗人員要取得動物實驗人員崗位證書，熟練掌握動物實驗技術。1、要在動物實驗前一周領取動物，在實驗飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)觀察一周，以使動物適應飼養(yǎng)環(huán)境。2、每天測量動物體溫，并記錄室內(nèi)溫、濕度等。3、實驗前不要使動物感到異常。4、注意消毒，不要使動物離開等級飼養(yǎng)設施，尤其是使用獨立送風籠具或層流柜進行動物實驗飼養(yǎng)時要嚴格按操作規(guī)程進行。5、實驗中要做好記錄，包括實驗起始時間，環(huán)境條件等。二、動物的購入領取或購入實驗動物前要注意以下幾個問題：1、領取動物前要按計劃檢查各項準備工具，如籠具數(shù)量、飲水瓶、飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生、消毒、飼料等。2、購入動物時要索取所購動物的質量合格證，包括合格證批號，動物的品種、品系、年齡、體重等，并有簽發(fā)人簽字蓋章。3、同時購入相應的飼料和墊料。4、運輸時要注意防止途中污染和動物窒息死亡，注意保持溫度、濕度。長期運輸還要給予足夠的飲水和飼料。5、運輸動物要用相應等級的籠器具，例如運輸清潔級動物要用帶有空氣過濾膜的無菌運輸罐或帶過濾帽的籠盒，并嚴格檢查密封狀況。三實驗動物的抓拿、保定、編號、分組和除毛（一）抓取和固定

在動物實驗中必須首先抓取并固定動物，正確地抓取固定動物是為了不損害動物健康，不影響觀察指標，防止被動物咬傷，保證實驗的順利進行。同種動物往往有幾種不同的固定方法，有些單位還有自己的習慣的方法。但不管用什么方法，實驗者必須了解動物的一般習性。操作小心仔細，大膽敏捷，熟練準確，切不可粗暴，恐嚇動物。本節(jié)介紹一些常用的方法。

1、

小鼠的抓取固定：圖1、小鼠的抓取固定方法

2、

大鼠的抓取固定：

圖2、大鼠保定法之一也可用無紡布巾或無紡布三角袋包起大鼠進行固定。

圖3、無紡布方巾包裹大鼠固定為防止大鼠咬傷也可戴上帆布手套。3、

豚鼠的抓取固定：圖4、豚鼠的抓取4、家兔的抓取固定

圖5、家兔的抓取

兔的固定方法常用的有手法固定、盒式固定和臺式固定法。手法固定常用于灌胃給藥，人坐在椅子上用一只手抓住頸背部毛皮，另一只手抓住兩后肢放入大腿之間用雙腿夾住兔下半身，空著手抓住兩前肢固定之，抓頸背的手同時捏住兩個耳朵，不讓頭部轉動。盒式固定用于耳部采血和耳部血管注射，把兔放入盒或筒內(nèi)，前方露出頭部。。

圖6、兔的盒式固定臺式固定適用于測血壓、呼吸等實驗或進行手術操作（圖10）。圖7、家兔的臺式固定讓麻醉兔仰臥，用線繩依次將四肢系扎在固定器兩側，把頭部放在金屬制的首枷和嘴環(huán)上固定。如果做頭部手術，可用馬蹄形固定器固定頭部，固定時先剪去兩側眼眶下部的皮毛，暴露顴骨突起，調節(jié)固定器兩端的尖頭金屬棒，使其正好嵌在突起下方的凹陷處，然后在適當?shù)母叨裙潭ń饘侔簦▓D11）。圖8、兔的馬蹄形固定5、家犬的抓取固定

經(jīng)過馴服的家犬，例如Beagle犬，抓取是比較方便的。未經(jīng)馴服的較兇惡的狗，要用特制的鉗式長柄狗夾挾住狗頸部，將狗按倒在地，系上脖套和鐵鏈條。急性實驗用犬可將狗嘴綁住，再將其四肢固定好。在給狗進行靜脈給藥或采血等操作時可用架式懸吊固定法或用箱式固定法。箱式固定法類似家兔的盒式固定法，自制犬箱，將犬牽入，使犬不能回身，蓋上箱蓋前端卡住狗頸，使犬頭露在箱外（卡頸處的箱蓋和箱前端合攏后應為圓形，僅容犬頸存在，犬頭不能縮回），犬即站立在犬箱內(nèi)，犬箱的側面可為柵欄式，可伸手隨意牽出犬腿。

（二）編號和個體標記

動物實驗中，為了區(qū)別和觀察每一個動物，必須對動物進行標記和編號，要根據(jù)動物的種類、數(shù)量和實驗時間的長短來選擇合適的標記方法，標記方法要保證號碼耐久、清楚、簡便、易認、適用。常用的方法有以下幾種：

1、染色法：用毛筆或棉簽蘸取化學藥品在動物身體明顯部位進行涂染。常用的染色劑有0.5%中性品紅溶液（紅色），3—5%苦味酸溶液（黃色），2%硝酸銀溶液（咖啡色）和煤焦油溶液（黑色）。染色法常用于實驗同期短的實驗，方法簡單，動物無疼苦損害，但常因動物磨擦、舐毛，尿、水浸、被毛脫落等而脫落，因此不適用長期的實驗。2、掛牌法：用帶號碼的金屬牌固定在動物的耳上或掛在脖頸上，常用鋁牌，可以反復使用不生銹，常用于家兔、豚鼠和貓、家犬、猴等動物。在兔耳上固定時要將號碼牌的尖端避開血管，穿過耳殼，在耳的內(nèi)側面將其折曲固定。3、耳緣剪孔法：在動物的耳邊緣剪出不同的缺口或打成不同的小孔進行標記的方法。剪耳緣和打孔后要注意防止傷口感染，可用消毒滑石粉涂沫在打孔局部。4、烙印法：烙印法是把編號烙壓在動物身上，如狗可將號碼烙在被毛上，其他動物（主要為兔）可用刺數(shù)鉗在耳上刺上號碼，然后用棉簽蘸溶在酒精中的染料（如黑墨）涂沫。

5、形態(tài)特征標記法：可用于豚鼠、家犬等，根據(jù)動物形態(tài)顏色特征編號

6、籠子編號：用籠號作為個體號，但千萬注意不要把動物放錯籠盒。（三）、分組

進行動物實驗，常常需要把選擇的動物按需要分成若干組。1、分組的原則：按隨機分配的原則，使每一只動物都有同等機會被分配到各個組，包括各個實驗組和對照組。以避免各組之間的差別，保證實驗結果準確，有利于統(tǒng)計檢驗。應避免人為因素，要隨機將動物編號；若分兩組進行，可把雙數(shù)做為一組，單數(shù)做為一組；若分為多組時可用統(tǒng)計學的隨機數(shù)字表進行完全隨機化分組。每組動物的數(shù)量要根據(jù)實驗周期的長短，實驗的類型和統(tǒng)計學要求而定。慢性、周期長的實驗或實驗中要定期處死動物檢驗的實驗，使用的動物數(shù)量就多一些，以補充動物自然死亡和人為處死喪失的數(shù)量，保證有合乎統(tǒng)計學要求的動物數(shù)量。

2、建立對照組：一般動物實驗都要設立對照組，常設的對照組有以下幾種（1）、自身對照：用每個動物實驗處理前和實驗處理后的各項相關數(shù)據(jù)進行對照，就分別是對照組和實驗組的實驗結果。用每個實驗動物自身對比，可排除個體間的差異。（2）、平行對照組：設兩個對照組，正對照和負對照組；對實驗組給以實驗處理；對照組也給予同樣的實驗處理手段，但處理時不給予實驗所要的藥物（或樣品）；而負對照組則不給任何處理。 還有一些其他的設立對照組的方法，可根據(jù)實驗的需要進行設置。（四）、被毛去除

1、剪毛法：2、拔毛法： 3、剃毛： 4、脫毛法：用化學藥品脫去被毛。先將被毛剪短，然后用棉球蘸取脫毛劑，在欲脫毛部位涂一薄層，2—3分后用溫水洗去脫下的被毛，用紗布擦干。常用于犬等大動物的脫毛劑配方為：硫化鈉10g，生石灰15g，溶于100ml水中。用于兔、鼠等小動物脫毛劑為：①硫化鈉3g，肥皂粉1g，淀粉7g，加適量水調成糊狀。②硫化鈉8g，淀粉7g，糖4g，甘油5g，硼沙1g，加水75ml。③硫化鈉8g溶于100ml水中。四實驗動物的麻醉

實驗中為了減少動物痛苦和不適，保證動物安全，使動物服從操作，確保實驗順利進行，常常需要對動物進行麻醉。因動物品種不同，實驗的方法不同，麻醉的方法也不同。（一）常用的麻醉藥1、常用局部麻醉藥

（1）0.5—1%普魯卡因（Procaine,又名奴佛卡因，Novocain）毒性小，見效快（注射后1—3min），作用時間短（30—45min），常用于局部浸潤麻醉。（2）利多卡因（Lidocaine,又名賽羅卡因，Xylocaine）注身后見效快，作用時間稍長，組織穿透）性好，用于大動物神經(jīng)干阻止效果好，也用于局部浸潤麻醉（0.25％－0.5％）。局部浸潤用0.25—0.5%水溶液，神經(jīng)干組織用1—2%水溶液。2、全身麻醉藥：常用實驗動物全身麻醉藥及其用法和劑量

見表格.（二）麻醉前的準備和麻醉方法的選擇

1、麻醉前的準備（1）麻醉前禁食，一般在麻醉前12h禁食。（2）大動物如犬、猴、羊、豬等可給予一定量的安定劑和阿托品類藥物，以減輕動物的緊張和唾液分泌。（3）準備好麻醉器具和應急藥品。2、麻醉方法的選擇實驗動物麻醉方法的選擇要根據(jù)實驗動物的種類、品系；實驗的方法、類型、時間的長短；麻醉方法和麻醉藥的特性，麻醉的設備、條件進行考慮，例如實驗時間短可采用吸入性麻醉或短效麻醉藥；心臟、肺部手術實驗，采用氣管內(nèi)插管控制呼吸的方法；犬、猴等適于靜脈麻醉，鼠類動物常用腹腔注射麻醉，也可以用聯(lián)合麻醉的方法，例如先用乙醚吸入的方法將大鼠麻醉，再腹腔注射麻醉藥的方法。（三）、常用的麻醉方法

1、全身麻醉： （1）注射麻醉： （2）吸入麻醉： （3）氣管內(nèi)插管麻醉： 2、局部麻醉： （1）局部浸潤麻醉： （2）區(qū)域阻滯麻醉：（3）神經(jīng)干（叢）阻滯麻醉：（4）椎管內(nèi)麻醉：（5）表面麻醉：.實驗動物給藥途徑和方法

實驗動物給藥的途徑和方法是多種多樣的，可根據(jù)實驗目的、實驗動物的種類、藥物的劑型、劑量等情況確定。常用的有經(jīng)消化道給藥和注射法給藥。另外還有涂布法（經(jīng)皮膚）、吸入法（經(jīng)呼吸道）等方法。（一）經(jīng)消化道給藥受試物質經(jīng)口給入，常用下列幾種方式

1、口服法：把藥物混入食物或溶于飲水中讓動物自動食入。2、灌胃法：為準確掌握給藥劑量常用灌胃法。用灌胃器將應投給的藥物灌到動物胃內(nèi)。灌胃器由注射器和灌胃針組成。灌胃針為特制的，小鼠灌胃針長4—5cm，直徑約1mm，大鼠灌胃針長6—8cm，直徑1.2mm。灌胃針的尖端焊有一小金屬球，以防插入時損傷消化道，針的前端可以彎成20°左右的角度。犬、貓、兔等常用導尿管作為灌胃管。操作前，將灌胃針（或管）按在注射器上，先大致測一下從動物口腔到胃內(nèi)的位置的長度（從動物口角到最末一根肋骨前端的長度），估計灌胃針插入的深度。成年動物插入的深度一般是小鼠3—4cm，大鼠和豚鼠4—6cm，兔約15cm，犬約20cm。常用灌胃量小鼠0.2—1ml，大鼠1—4ml，豚鼠1—5ml，兔80—150ml，狗200—500ml，貓100—150ml。鼠類的灌胃：用左手拇指和食指抓住兩耳間和頸后皮膚固定頭部，其他三指抓住背部皮膚，將鼠握持在左掌中，小鼠可用無名指和小指夾住固定一側后肢。使動物腹部向上，頭部向上有一個傾斜度。右手持灌胃器，將灌胃針沿咽后壁慢慢插入食道，進入相當深度進入胃內(nèi)，回抽注射器針栓，如無空氣抽回（以防插入氣管）即注入藥液（圖15）。圖9、大鼠的灌胃

兔、貓、犬的灌胃：將動物固定，再將開品器固定于動物口中，壓住舌頭，將適宜粗細的灌胃管從開口器的小孔插入動物口中，沿上腭壁慢慢插入食道，進入適當深度進入胃內(nèi)。為防止進入氣管要慢，要輕，可用動物毛在導管外試一下，觀看動物呼吸時毛有無擺動，或將導管外端浸入水中，看是否有氣泡逸出，查看是否在氣管內(nèi)。如證實確在胃內(nèi)，聯(lián)結注射器將藥物推入。

動物種類體重（g）最大容積(ml)

小鼠>301.025~300.820~240.5大鼠.>3008.0250~3006.0200~2494.0~5.0100~1993.0豚鼠>3006.0250~3004.0~5.0家兔>35002002500~3500150200~2400100貓>3000100~1502500~300050~80狗10000～15000200～50011-表2各種動物一次灌胃能耐受的最大容積（魏泓，1998年）（二）注射法給藥 1、皮內(nèi)注射：注射量：小鼠最多不得超過0.05ml，豚鼠、大鼠、兔一般為0.1ml。 2、皮下注射： 3、肌肉注射： 4、腹腔注射：圖16）圖10、小鼠腹腔注射小鼠的一次注射量為0.1—0.2ml/10g（體重）。大鼠一次注射量為1—2ml/10g體重。5、靜脈注射：靜脈注射根據(jù)動物的種類不同，選擇不同的靜脈血管。注射藥物，一般只限于液體藥物，如果是混懸液，可能會因懸浮粒子較大而引起血管栓塞。小鼠和大鼠的靜脈注射：常選用尾靜脈。鼠的尾靜脈共有3根（圖17）。

圖11、鼠尾部血管左右兩側和背側各一根，兩側尾靜脈比較容易固定，常被采用。注射量一般為0.5ml為宜。11-表3、不同動物所使用針頭型號和投入量（ml）（孫敬方）動物灌胃皮下肌肉腹腔靜脈

小鼠使用針頭9（鈍頭）5554給藥量10.40.410.8大鼠使用針頭腰穿針6665給藥量2（鈍頭）10.424豚鼠使用針頭靜脈切開針6675給藥量310.545兔使用針頭導尿管（10）6676給藥量2022510貓使用針頭導尿管（10）7776給藥量2022610蛙淋巴囊注射最大量1ml/只

（三）其他途徑給藥

呼吸道給藥：呈粉塵、氣體、蒸汽或霧水等狀態(tài)的藥物或毒氣通過呼吸道吸入。如鋸末煙霧吸入制作慢性氣管炎動物模型等。皮膚給藥：鑒定藥物或毒物經(jīng)皮膚的吸收作用、局部作用、致敏作用、光感作用等需經(jīng)皮膚給藥，如用豚鼠進行化妝品的刺激、致敏作用實驗；經(jīng)兔腹部皮膚給予血吸蟲尾蚴，制做血吸蟲動物模型等。還可以根據(jù)需要經(jīng)直腸內(nèi)給藥、關節(jié)腔內(nèi)給藥、淋巴囊內(nèi)給藥、脊髓腔內(nèi)和腦內(nèi)給、鼻內(nèi)接種等途徑。（四）實驗動物用藥量的確定動物的用藥量一般因動物種類而異，也與給藥的方法有關，一般按mg/kg計算，應用時應查閱有關資料，如查不到，可選用致死量的1/10—1/5進行嘗試，也可以用其它動物或人的劑量來換算。一般來說，動物的耐受性比人大，因此單位體重的用藥量比人要大，大鼠、小鼠為人的25—50倍，兔、豚鼠為15—20倍，狗、貓為5—10倍。六實驗動物的采血技術方法

動物實驗中常常需要采取動物的血液進行檢查和分析，所以必須熟練地掌握動物的采血方法。采血方法依動物的種類和采血的血量不同。靜脈采血，若需反復多次。應先從遠心端開始，以免發(fā)生栓塞而影響整條靜脈。大、小鼠的采血1、剪尾采血：需血量少時可用此方法。小鼠每次采血約0.1ml，大鼠約0.4ml。為了多次反復取血應盡量從鼠尾末端開始。2、摘眼球采血：此法常用于鼠類大量采血3、眼眶后靜脈叢采血：小鼠一次可采血0.2—0.3ml，大鼠一次可采0.5—0.1ml（圖18）。

圖12、大鼠后眼框靜脈叢取血方法

4、頸靜脈或頸動脈采血：5、斷頭采血：6、心臟采血：

七、實驗動物體液、骨髓的采集（一）、尿液的采集

常用的采集方法較多，一般在實驗前需給動物灌服一定量的水。1、代謝籠法此法較常用，適用于大、小鼠。將動物放在特制的籠內(nèi)（圖19）。動物排便時，可以通過籠子底部的大小便分離漏斗將尿液與糞便分開，達到采集尿液的目的。圖13、大小鼠代謝籠裝置由于大、小鼠尿量較小，操作中的損失和蒸發(fā)，各鼠膀胱排空不一致等原因，都可造成較大的誤差，因此一般需收集5小時以上的尿液，最后取平均值。八動物實驗后的有關問題（一）、實驗后的護理動物實驗后應在相應等級的動物飼養(yǎng)設施內(nèi)飼養(yǎng)觀察。無菌動物、SPF級動物和清潔級動物飼養(yǎng)要嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，每天做好飼養(yǎng)及觀察記錄。普通級動物實驗后也應在普通級飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)觀察，每天做好環(huán)境條件數(shù)據(jù)記錄：天氣、室溫、濕度等。切不可在普通的實驗室內(nèi)、房間內(nèi)等處飼養(yǎng)觀察動物。（二）、實驗動物的處死

實驗動物的處死，有的是因中斷實驗而淘汰動物的需要，有的是因實驗結束后做進一步檢查的需要，有的是為保護健康動物而處理患病動物的需要。處死實驗動物應遵循動物安樂死的基本原則。注意：①保證操作人員安全。當用乙醚或三氯甲烷處死動物時，從人的安全及實驗條件來看還有不少問題，盡量不要使用。②不能影響實驗檢查的結果，而且處死方法應易于操作。③盡可能縮短致死時間，即處死開始到動物意識消失的時間。④確認動物是否已被處死不能只看呼吸是否停止，還要看神經(jīng)反射、肌肉松弛等狀況。⑤盡量避免動物產(chǎn)生驚恐、掙扎、叫喊，盡量減少動物的疼痛、痛苦。⑥處死動物是一件令人不愉快的事情，禁止無關人員參加。實驗動物處死的方法很多，常用的無痛苦死亡的處死方法有頸椎脫臼法、過量麻醉法。此外，還有斷頭法、毒氣法、放血法、空氣栓塞法等。實驗人員可根據(jù)實驗目的、動物種類等因素選擇不同的處死方法。1、頸椎脫臼法:所謂頸椎脫臼法，就是使動物的頸椎脫臼，斷開脊髓使動物致死?？雌饋砗軞埧?，但能使動物很快