1.2基因工程的基本

操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序基因工程的目的基因－－編碼蛋白質(zhì)的基因。與生物抗逆性相關(guān)的基因與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因與生物藥物和保健品相關(guān)的基因與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)所需酶相關(guān)的基因具有調(diào)控作用的因子……3、化學(xué)方法人工合成1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增(基因比較小，序列已知)基因文庫基因組文庫部分基因文庫－－如：cDNA文庫多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@取按照外源DNA片段的來源：從特定組織提取的染色體基因組DNA ---基因組文庫（總）mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝----cDNA文庫（部分）②基因文庫的目的在不知目的基因序列的情況下，獲得所需的目的基因。①基因文庫的分類將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點，并與其結(jié)合。②轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。③轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。1、編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)的序列。2、非編碼區(qū)：調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列(啟動子、終止子），不編碼蛋白質(zhì)。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充知識）真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充知識）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)

內(nèi)含子

外顯子

啟動子終止子與RNA聚合酶結(jié)合位點1、編碼區(qū)2、非編碼區(qū)：調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列(啟動子、終止子），不編碼蛋白質(zhì)。外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以從基因文庫獲取目的基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，如：基因的已知核苷酸序列；基因的功能；基因在染色體上的位置；基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA；基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)……以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，再反轉(zhuǎn)錄酶的催化下反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，即cDNA，從而獲得所需的基因。反轉(zhuǎn)錄法（cDNA文庫的構(gòu)建方法）（二）利用PCR擴(kuò)增目的基因1、過程高溫變性（加熱至90～95℃解旋為單鏈）低溫退火（復(fù)性）（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈）重復(fù)循環(huán)冷卻至55～60℃加熱至70～75℃PCR擴(kuò)增儀引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，使DNA聚合酶能夠從其3′端開始連接脫氧核苷酸。引物：原料4種游離的脫氧核糖核苷酸(dNTP)，包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，N代表變量指代A、T、G、C中的一種。2、條件酶Taq酶（熱穩(wěn)定的DNA聚合酶）適宜的溫度和PH值已知基因的核苷酸序列使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增4、結(jié)果3、方式：以指數(shù)方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）2nPCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)Taq酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶）細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學(xué)合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：（3）人工合成目的基因DNA合成儀(基因比較小，序列已知)文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以問題一：關(guān)于物種間的基因交流？五碳糖磷酸含氮堿基O12345問題二：3‘和5’端如何判定？PCPTPAPGPTAPGPCP5’3’3’5’——基因工程的核心1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種2過程:3.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶啟動子RNA聚合酶啟動子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。思考1：表達(dá)載體為什么一定要有啟動子？（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無法轉(zhuǎn)錄。思考2：終止子的作用是什么？

終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。

是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來。思考3：標(biāo)記基因有什么作用？三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞－轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點：

易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：

Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。③轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒（常用鎢粉粒子和金粉粒子）表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。適用于被子植物2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物常用法：Ca2+處理法/感受態(tài)細(xì)胞法常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的生理狀態(tài)四、目的基因的檢測與鑒定接種實驗抗原－抗體雜交分子雜交技術(shù)DNA分子雜交技術(shù)受體是否具有轉(zhuǎn)基因特征個體水平目的基因是否翻譯目的基因是否轉(zhuǎn)錄目的基因是否插入分子水平方法檢測對象抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因——DNA分子雜交技術(shù)——分子雜交技術(shù)用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了m