色譜分析法

Chromatography1.國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）的定義

Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationaryphasewhiletheothermovesinadefinitedirection.一、色譜法概述CaCO3Petroleumether茨維特Experiment色譜法是一種基于物理作用的分離方法。它的特點是：物質(zhì)在兩相中分配，一是固定相，一是流動相，兩相作相向運動。

色譜法創(chuàng)始人

——俄國植物學家Tswett色譜的歷史色譜法的發(fā)展1906年Tswett發(fā)明色譜的研究方法1954年Martin色譜塔片理論1958年，Giddings毛細管氣相色譜1960年代，高效液相色譜1980年代，超臨界流體色譜1990年代，大規(guī)模制備色譜：生命科學2000年代，多維色譜，超高壓色譜，快速制備：蛋白質(zhì)組學，藥物研發(fā)Paperchromatography(PC),紙色譜法Thinlayerchromatography(TLC),薄層色譜法Ionexchangechromatography(IEC，IC),離子交換色譜法Gelpermeationchromatography(sizeexclusion,GPC),

凝膠色譜法，體積排阻色譜法Affinitychromatography(AC)，親和色譜法Gaschromatography(GC),氣相色譜法Supercriticalfluidchromatography(SFC)，超臨界流體色譜法Highperformanceliquidchromatography(HPLC),高效液相色譜法Capillary(Zone)electrophoresis(CE),毛細管電泳HighSpeedCountercurrent

Chromatography（HSCCC）2.常用的色譜分析方法術語3.色譜法的分類按流動相的狀態(tài)分類氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜按固定相的使用形態(tài)分類柱色譜紙色譜薄層色譜按分離機理分類：吸附、分配、離子交換、空間排阻……色譜新分類法按分子間相互作用類型：一非特異相互作用色譜疏水相互作用離子作用：離子交換，離子排斥（道南效應）和離子對親水相互作用……二特異相互作用-親和色譜免疫親和固定化金屬親和硼親和仿生親和（分子印跡聚合物、適配體、仿生材料）……

4.各種色譜方法的應用（1）薄層色譜法設備簡單、操作方便分離速度快（適合多個樣品的同時測定）樣品預處理簡單對被分離物質(zhì)的性質(zhì)沒有限制直觀、可比HPTLC用于人參、三七和西洋參的鑒別最重要的應用領域：藥物分析，如中國藥典中的TLC鑒別（2）氣相色譜法用于分離分析易汽化、穩(wěn)定、不易分解、不易反應的樣品特別適合用于同系物、同分異構體的分離分離效率高（3）高效液相色譜法用于分離分析高沸點、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。分離效率高于TLC分離機理多，應用范圍廣人參的HPLC譜圖超臨界流體色譜用于齊聚物分析（4）超臨界流體色譜超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。超臨界流體色譜(SFC)，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點:（1）可處理高沸點、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。（5）毛細管電泳毛細管電泳用于DNA測序以毛細管為分離通道以高壓電場為驅(qū)動力依據(jù)樣品中各組分之間電泳速度和分配行為上的差異生命科學、藥物分析、以及從小分子、離子到單細胞分析電色譜的基本原理和操作結合毛細管電泳的高柱效和高效液相色譜的高選擇性色譜柱為填充了HPLC填料的填充型毛細管柱和管內(nèi)壁涂漬了固定相功能分子的開管毛細管柱以電滲流為流動相驅(qū)動力分離機理包含有電泳遷移和色譜固定相的保留機理，溶質(zhì)與固定相間的相互作用對分離起主導作用。CEC與質(zhì)譜聯(lián)用既可解決LC/MS的分離效率不高的問題，又可克服CE/MS中質(zhì)量流量太小的缺陷。主要應用在藥物、手性化合物和多環(huán)芳烴的分離分析。電色譜分離酸性化合物二、色譜理論基礎色譜常用術語色譜峰相關保留值相關分離效能評價相關peakPeakheightBaselinePeakwidthPeakwidthathalfheightPeakareaStandarderror:σ色譜流出曲線（chromatogram）:

指樣品注入色譜柱后，信號隨時間變化的曲線。RetentiontimeDeadtimeσ=0.607h處峰寬的一半W1/2=2.355σW=4σ=1.70W1/2基線:無組分通過色譜柱時，檢測器的噪音隨時間變化的曲線。保留時間:進樣到出現(xiàn)色譜峰的時間調(diào)整保留時間死體積：色譜柱的空隙體積保留體積：進樣到出現(xiàn)色譜峰時消耗的流動相體積調(diào)整保留體積：扣除死體積后的保留體積相對保留值：在相同的操作條件下，組分與參比組分的調(diào)整保留值之比分配系數(shù)K（distributioncoefficient）：一定溫度與壓力下兩相達平衡后，組分在固定相和流動相濃度的比值容量因子k（retentionfactor，capacityfactor)：一定溫度與壓力下兩相達平衡后，組分在固定相和流動相量的比值相比β（phaseratio）：色譜柱中流動相與固定相相體積之比理論塔板數(shù)（柱效）n（Numberoftheoreticalplates

）K=CS/CM

k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0)/t0選擇性因子αSeparationfactor）：相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比分離度R（Resolutionfactor）：相鄰色譜峰保留時間之差的兩倍與兩色譜峰峰基寬之和的比值

R<1.0 兩峰明顯重疊R=1.0 兩峰達97.7%分離R1.5 兩峰完全分開R=0.59R’α與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質(zhì)上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。

2色譜理論基礎色譜熱力學理論試樣在兩相間分配色譜動力學理論組分在色譜柱中運動，峰寬與傳質(zhì)關系塔板理論速率理論色譜熱力學理論分子間作用力：色散力、誘導力、取向力、氫鍵氣相色譜：溶質(zhì)與固定相間液相色譜：溶質(zhì)與固定相、流動相間重要熱力學參數(shù)分配系數(shù)K容量因子k保留值熱力學方程GC：溫度；HPLC:洗脫強度K=CS/CM

分配系數(shù)K與柱中固定相和流動相的體積無關，而取決于組分及兩相的性質(zhì)，并隨柱溫、柱壓變化而變化。容量因子k決定于組分及固定相的熱力學性質(zhì)，隨柱溫、柱壓的變化而變化，還與流動相及固定相的體積有關。k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0)/t0（1）塔板理論目的——從理論上得到描述色譜流出曲線的方程，并通過這一方程各參數(shù)來研究影響分離的因素。假設 （1）色譜柱存在多級塔板;

（2）組分通過時在每級塔板兩相間達 到一次平衡;色譜動力學理論r——塔板數(shù)N——轉(zhuǎn)移次數(shù)設：有A、B兩組分，kA=2 kB=1/2當N=0 r=0A組分在兩相分配達平衡后：流動相分量=固定相分量=r0r1r2。。。。。。。。rn下表列出經(jīng)過各級轉(zhuǎn)移后組分在每一級塔板中的量：色譜流出曲線方程c:流動相流過體積v時柱出口組分濃度；m為進樣量；b為與塔板高度、柱長、容量因子等有關的參數(shù)V=VR時，mcmax

由于所獲得的流出曲線在N很大時呈正態(tài)分布，因此可將流出曲線方程轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布方程形式：將此方程與標準正態(tài)分布曲線方程比較：可知：所以：或：根據(jù)：所以：n稱為色譜柱的理論塔板數(shù)。 因為tR是熱力學常數(shù)，當色譜柱的長度一定，理論板數(shù)目n越大，色譜峰越窄。（2）速率理論概述速率理論是1956年荷蘭學者VanDeemter等提出，因此又稱作范第姆特方程。運用流體分子規(guī)律研究色譜過程中產(chǎn)生色譜峰擴展的因素，導出了理論塔板高度與流動相線速度的關系，揭示了影響塔板高度的動力學因素。

氣相色譜中速率方程的導出根據(jù)塔板計算公式：

n=5.54(tR/W1/2)2速率理論討論的是色譜峰展寬原因，即影響塔板數(shù)n的因素，也就是影響塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu渦流擴散項A=2λdp渦流擴散項均勻性因子粒徑

渦流擴散項A

由不等路徑造成的色譜峰擴展。由于柱填料粒徑大小不同，粒度分布范圍不一致及填充的不均勻，形成寬窄、長短不同的路徑，因此流動相沿柱內(nèi)各路徑形成紊亂的渦流運動，有些溶質(zhì)分子沿較窄且直的路徑運行，以較快的速度通過色譜柱，發(fā)生分子超前，反之，有些分子發(fā)生滯后，從而使色譜峰產(chǎn)生擴散。

分子擴散項B/u項其中B=2γDg彎曲因子擴散系數(shù)

分子擴散項

由于分子的縱向擴散造成的色譜峰擴展。即由于試樣組分被載氣帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在于色譜柱的很小一段空間中，由于在塞子前后存在濃度梯度，因此使運動著的分子產(chǎn)生縱向擴散，引起色譜峰擴展。

傳質(zhì)阻力項由氣相傳質(zhì)阻力和液相傳質(zhì)阻力兩項組成

氣相傳質(zhì)阻力項Cgu

試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程中，由于質(zhì)量交換過程需要一定時間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子隨流動相向前運動，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴展。

容量因子

液相傳質(zhì)阻力項CLu

試樣組分從固定相表面移動到固定相內(nèi)部的過程中，由于質(zhì)量交換過程需要一定時間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子先離開固定相表面，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴展。

液相擴散系數(shù)液膜厚度

速率方程給我們的什么啟示？為柱型的研究和發(fā)展提供理論依據(jù)為操作條件的選擇提供理論指導為色譜柱的填充提供理論指導對柱型研究和發(fā)展的影響（1）A=0?Golay1957年提出毛細管柱的概念（opentube）毛細管柱A=0，H=B/u+CuH↓，N↑，分離能力大大提高液體作流動相時可用更細的固定相，A↓對柱型研究和發(fā)展的影響（2）B=0?溶質(zhì)在液體中的擴散系數(shù)DL≈10-5cm2/s溶質(zhì)在氣體中的擴散系數(shù)Dg≈10-1cm2/sDL《Dg當采用液體作流動相時

B→0載氣線速度（流速）的影響最佳流速：u=(B/C)1/2實用最佳流速：比最佳流速更快A與流速無關B/u：當流速小時，對H的大小起主導作用Cu：當流速大時，對H的大小起主導作用操作條件對柱效的影響（1）H-u曲線容量因子k的影響不同組分k不同，測出的柱效不同在氣相傳質(zhì)阻力相中，k↑

，Cg↑理論上說k越小柱效越高，實際不可取在液相傳質(zhì)阻力相中，k↑，Cl先↑，后↓當k=1時，最大。希望k在一個合適的范圍內(nèi)，通過改變柱溫、固定相、柱型參數(shù)等可實現(xiàn)。柱溫的影響間接