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Y謝斌瑞典Lund大學(xué)純與應(yīng)用生物化學(xué)系武漢2013.03EnzymeThermistor

-酶熱生物傳感技術(shù)及其乳品安全的快速分析什么是生物傳感器?電活性物質(zhì)電極pH變化pH電極熱量熱敏電阻光光敏元件質(zhì)量變化壓電晶體酶抗體微生物細(xì)胞分子識(shí)別信號(hào)傳感電信號(hào)生物傳感器原理生物量熱–一種萬(wàn)能的生物分析平臺(tái)生物反應(yīng)中的熱量變化是一種常見(jiàn)形式酶-底物催化的特異性生物反應(yīng)產(chǎn)生足夠的熱量測(cè)量系統(tǒng)對(duì)光、濁度、電等不敏感采用差分量熱，環(huán)境溫度變化影響小極高的分析精度（<10-5℃)適合于有機(jī)相熱敏傳感器無(wú)需校正樣品（如，血液、奶等）一無(wú)需預(yù)處理，可直接進(jìn)樣分析采用流動(dòng)注射分析，檢測(cè)快速、成本低（約1元人民幣/樣品）可連續(xù)、在線分析早期設(shè)計(jì)樣品酶Peltier器件酶熱敏電阻樣品酶流動(dòng)管熱敏電阻熱酶電阻(a)靜態(tài)分析(b)靜態(tài)或流動(dòng)分析(c)流動(dòng)分析酶熱生物分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理信號(hào)放大固相酶柱酶熱傳感器流動(dòng)泵進(jìn)樣閥進(jìn)樣管路緩沖載液酶熱生物分析儀生物固相固態(tài)表面固相及摧化反應(yīng)酶熱生物傳感原理ΔT=ΔH·nρCγTrTmSCΔT=Tm-TrCγ:反應(yīng)器熱容量ΔH:反應(yīng)中熱焓的變化nρ:反應(yīng)物摩爾數(shù)S:底物P:產(chǎn)物P酶催化熱焓變化●多數(shù)酶催化反應(yīng)為放熱反應(yīng),ΔH<0-ΔH=-100kJ/mol為典型的過(guò)氧化物酶和氧化酶的熱焓，其它酶在同一數(shù)量級(jí)氧化酶可與過(guò)氧化物酶共同固相-ΔH變化疊加，增加熱信號(hào)-消除過(guò)氧化氫危害，穩(wěn)定了酶活性-產(chǎn)生額外的50%氧●Tris緩沖液能加大質(zhì)子熱焓，從而對(duì)如，蛋白酶等增加約-47kJ/mol的熱量傳感裝置參數(shù)流速:0.5-2ml/mL樣品量:0.01-1mL測(cè)量時(shí)間:1-6min酶柱容量:0.2-1mL固相酶量:>50units/柱固相材料:CPG,傳感器:熱敏電阻傳感器酶柱進(jìn)樣樣品環(huán)：50-500μL酶柱內(nèi)徑（I.D）:1-2mm酶柱容量：0.5to1mL

固定化酶方法（戊二醛共價(jià)交聯(lián)）可控多孔(120-160nm)玻璃珠(CPG):瓊脂糖凝膠:CL-6B網(wǎng)狀?；迹≧VC）溶膠凝膠固定化細(xì)胞方法鈣果膠凝膠海藻酸鈣凝膠細(xì)胞嵌入瓊脂糖顆粒酶熱生物傳感電極酶柱裝載電極置位檢測(cè)條件設(shè)置檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)性能特點(diǎn)是一種萬(wàn)能的生物分析平臺(tái)。原理上只要存在相應(yīng)的酶，就能對(duì)其底物進(jìn)行特異的檢測(cè)

傳感器與流動(dòng)樣品隔離，不受光，電和化合物的直接干擾，無(wú)需經(jīng)常校正

無(wú)需對(duì)待測(cè)樣品，如全血、發(fā)酵液、奶等進(jìn)行預(yù)處理，可直接進(jìn)樣分析

可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)的連續(xù)、在線分析，如發(fā)酵過(guò)程檢測(cè)和血糖動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

可實(shí)現(xiàn)多分析物的同步檢測(cè)和分析

酶柱可反復(fù)使用數(shù)百次，檢測(cè)成本低，并易于更換

測(cè)量快速（約1-5分鐘/樣品），操作簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)檢測(cè)分析

已實(shí)現(xiàn)商品化和系列產(chǎn)品，并能根據(jù)用戶的特殊要求打造

除酶分析外，還可用于細(xì)胞、微生物、酵母、ATP等分析

應(yīng)用領(lǐng)域●

臨床分析，如糖尿病●發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)，如青霉素發(fā)酵●食品安全檢測(cè)分析，如乳品中非法添加劑青霉素、

β-內(nèi)酰胺酶等●環(huán)境污染分析，如持續(xù)有機(jī)污染物氯酚、重金屬、農(nóng)藥殘留物等●生物分析中，如酶分析、免疫分析、細(xì)胞分析、微生物分析、DNA分析等●遠(yuǎn)程健康監(jiān)測(cè)

已檢測(cè)的分析物實(shí)例乳品安全快速檢測(cè)分析

牛奶非法添加劑Illegaladditionofβ-lactamasewasdiscoveredinChina,in2007.Accordingtothereport,β-lactamaseactivitywasfoundin49outof77individuallypackedmilksamplescollectedfrom5retailstoresin3cities.Someofthesesampleshadextremelyhighβ-lactamaseactivity.TheministryofhealthofthePeople’sRepublicofChinaincludedβ-lactamaseintoitsnewlypublished“blacklist”ofillegalfoodadditives.β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)MethodsHPLCCylinderplatemethodchromogenicmethodDisadvantagesSamplepreparationTimeconsuming:24hr/testTimeconsuming:30min-24hr/testModifiedcylinderplatemethod:beta-lactamaseactivityisdefinedasadifferencebetweentheinhibitoryzonesofthetestsamplesandcontrolsamples.Chromogenicmethod:hydrolyticactivityofbacterialfl-lactamaseswasestimatedbythemeasurementofabsorbancechangesofnitrocefinandpiridinium-2-azo-p-dimethylamilinechromophase(PADAC).乳品快速檢測(cè)裝置β-內(nèi)酰胺酶響應(yīng)待測(cè)奶樣品乳品中β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)分析是基于這一原理:即，將特異性的酶催化反應(yīng)與精確的流動(dòng)量熱分析結(jié)合起來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)獨(dú)一無(wú)二的、快速的乳品分析。其檢測(cè)原理如下圖所示。測(cè)量方法和結(jié)果1.Calibration1.Effectofflow-rate2.Effectofsamplevolume3.Effectofmilkcontents牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)響應(yīng)0.25U/ml0.5U/ml1.0U/ml2.0u/ml5.0U/mlControl01020304050607080

Time（min）Penicillinaseactivitydeterminedinmilkwith3%fatand50%(v/v)dilution.1mMpenicillinG,flowrateof0.5ml/minandthesamplevolumeof350μlwereapplied.

不同方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比costpersampleTime(min/sample)ContinuityDetectionlimitModifiedETmethod≈0.1$6minSemi0.5u/mlCylinderplatemethod[5]n/a>24hrNo4u/mlChromogenicmethod[7]n/a30min~24hrn/a0.49u/mlET特點(diǎn)分析方法簡(jiǎn)單、儀器操作方便

待測(cè)奶樣品無(wú)需特殊預(yù)處理測(cè)量快速（約5-7分鐘/每樣品）

檢測(cè)成本低（約1元人民幣/每樣品）靈敏度高（β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)低于0.5U酶活性/ml奶樣品）適合原料奶、奶制品和其他液態(tài)食品中的β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)可用于其它酶的檢測(cè)或酶底物的分析乳腺炎奶檢測(cè)牛乳腺炎影響奶質(zhì)量，嚴(yán)重的會(huì)引起人體中毒，因此需要嚴(yán)格控制原料乳中的乳腺炎感染狀況。乳腺炎奶通常其乳酸的含量會(huì)增加數(shù)十倍。測(cè)量乳品中的乳酸含量不僅可控制原料乳的質(zhì)量，還可追蹤成品乳制品的產(chǎn)奶牛的健康狀況。因此，乳品中乳酸的檢測(cè)對(duì)于控制乳品質(zhì)量具有非常重要的意義。牛奶中的乳酸的檢測(cè)Comparisonoftheresultsofbuffersamplesandmilksamples.(A)buffersamples,withflow-rateof0.75ml/minandsamplevolumeof250μL.(B)1:1dilutedmilksampleswithflow-rateof0.75ml/minandsamplevolumeof250μL.分析結(jié)果固相酶柱在34天后其活性維持在82.5%（每天測(cè)量0.5mM的乳酸數(shù)次）

牛奶樣品（1：1稀釋）的乳酸檢測(cè)精度為62

μM檢測(cè)線性范圍0.06–1mM以上（用乳酸氧化酶）檢測(cè)時(shí)間5分鐘/樣品奶中尿素的檢測(cè)兩分析物檢測(cè)原理多指標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)ReferencesignalMeasurementsignalCalorimetriccylinderPeristalticpumpWasteBufferInjectionvalveReferencecolumnMeasurementcolumnThermistorsReferenceprobe乳品中乳酸和尿素的同步檢測(cè)雙通道ET的乳酸和尿素檢測(cè)

A3A4B3B4UreainSMlactateinSMlactateinVL乳酸和尿素的檢測(cè)比對(duì)Thecorrelationsofureadeterminationsintwodifferenttypeofmilksbefore(A1)andafter(A2)substractingthereferencesignalofthebackground(A4)fromthemeasurementsignal(A3).Similarly,thecorrelationsforlactatebefore(B1)andafter(B2)subtractingthebackground(B4)fromthemeasurements(B3).感謝！

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+46707686216(瑞典手機(jī)）郵箱：bin.xie@tbiokem.lth.se瑞典地址：PureandAppliedBiochemistry,Box124,S-22100Lund,Sweden中國(guó)地址：歐米克生物科技（武漢）有限公司，武漢東湖新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)華光大道18號(hào)，高科大廈8058室，郵編430074。電人簡(jiǎn)介

1982年畢業(yè)于華中工學(xué)院電子工程系,獲工學(xué)學(xué)士1988年畢業(yè)于同濟(jì)同科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè),獲醫(yī)學(xué)碩士1996年畢業(yè)于瑞典Lund大學(xué)純與應(yīng)用生物化學(xué)系,獲博士學(xué)位1997-1998年在